Name: Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Analyse zirkadianer Phänotypen in Arabidopsis-Protoplasten mit lumineszenten Reportern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Uhrgenen ohne stabile transgene Linien.

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Wir möchten Prof. David Somers und Dr. Jeongsik Kim für das Luciferase-Reporter-Plasmid und die anfängliche Methodenentwicklung danken. Prof. Karen Halliday hat freundlicherweise alle zirkadianen Mutantenlinien zur Verfügung gestellt, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Forschung wurde durch Forschungsstipendien der Royal Society RS120372 und RS140275 unterstützt. GvO ist Research Fellow (UF110173) der Royal Society University.

HINWEIS: In diesem Protokoll, Reagenzien und Volumina beschrieben werden pro Arabidopsis Linie ausgedrückt, die getestet wird, und in sechs Wiederholungsvertiefungen für diesen Genotyp führt. Multiplizieren die Materialien mit der Anzahl der Zeilen analysiert werden, wenn mehr als eine Zeile zu analysieren. In dem Video wird Wildtyp - Arabidopsis auf die innere Uhr Mutantenlinie ztl verglichen werden (obwohl repräsentative Ergebnisse von weiteren Leitungen werden anschließend zur Verfügung gestellt werden). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzymlösung </td><td></td></tr><tr><td> Zellulase </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Pectinase R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMg Lösung </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging - Lösung </td><td></td></tr><tr><td> W5-Lösung </td><td> zum Endvolumen </td></tr><tr><td> Fetales Kälberserum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Luciferin </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Lösungen. 1. Herstellung von Materialien und Puffer <ol><li> Pflanzenmaterialien <ol><li> Halten Sie Arabidopsis Col -0 Samen in Wasser in einem 1,5 - ml - Röhrchen bei 4 ° C im Dunkeln für vier Tage. Pipette, um die Samen auf dem Boden kommen in einen Topf geben und Transfer zum Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht 8 Stunden Dunkelheit) bei 21 ° C für 7 Tage. Lassen Sie einen Deckel auf den Topf für die ersten drei Tage mit hoher Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Transplantations sechs Sämlinge zu einem neuen 8 cm x 13 cm x 5 cm Topf und weiterhin die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen für anoth wächster 21 Tage. Stellen Sie sicher, dass der Boden feucht ist im gesamten Gebäude. </li></ol></li><li> Reporterplasmid <ol><li> Reinige den CCA1pro: LUC - Reporterplasmid 19 aus Bakterienkultur im Voraus, eine DNA - Extraktions - Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . HINWEIS: 20 &amp; mgr; g Reporterplasmid erforderlich ist (10 &amp; mgr; l bei 2 ug / ul in dH 2 O) für eine Transfektion. </li></ol></li><li> Lösungen HINWEIS: Für dieses Protokoll fünf Lösungen benötigt werden: Enzymlösung, Wasch 5 (W5) Lösung, Mannitol-Magnesium (MMG) Lösung, Polyethylenglykol (PEG) -Lösung und Imaging - Lösung (Tabelle 1). Bereiten Sie diese, bevor auf die Isolierung von Protoplasten Schritt weiter. <ol><li> Herstellung von 10 ml der Enzymlösung gemäß Tabelle 1, wobei sich die Enzyme letzten, und Filtern der Lösung durch einen 0,22 um - Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Bereiten Sie die verbleibenden Lösungen in folgenden Volumina: 15 ml W5-Lösung, 10 ml MMg solution, 1 ml PEG - Lösung und 1,5 ml Imaging - Lösung gemäß Tabelle 1. Hinweis: Es ist wichtig, dass die PEG-Lösung nicht weniger hergestellt wird, als eine Stunde vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass das PEG vollständig aufgelöst hat. Filter sterilisieren die Imaging-Lösung durch einen 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Abb . 1: Isolierung von Protoplasten Die Blätter von erwachsenen Arabidopsis - Pflanzen (A) auf Autoklav Band fixiert mit der unteren epidermalen Schicht nach oben (B). (C) Magic Tape auf die untere Schicht der Epidermis mit der Spitze eines 15 ml konischen Röhrchen sanft gepresst. (D) Das magische Band wird entfernt , um die Mesophyllzellen (E) zu belichten. (F) Streifen des Autoklaven Band mit Urlaubs gebunden sind, auf die Enzymlösung, die Cellulase und Pektinase, schwebte Protoplasten in die Lösung freizusetzen. (G) Die Blatt Skelette auf Autoklaven Band bleiben , nachdem Enzym die Verdauung und werden verworfen, die Protoplasten in Enzymlösung verlassen (H). (I) Endgültige resultierende Mesophyll - Protoplasten (Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Isolierung von Protoplasten <ol><li> Beschriften Sie eine Petrischale und 10 ml Filter-sterilisierte Enzymlösung. </li><li> Fix vier Streifen Autoklav-Band mit der klebrigen Seite auf einer sauberen Laborfläche nach oben, und die Größe der Petrischale Markierung auf dem Streifen. </li><li> Schneiden Sie Blätter von 4-Wochen alten Pflanzen (Abbildung 1a), und drücken Sie die obere Epidermis auf den Autoklaven Band (dh der unteren epidermalen Seite nach oben ( <strong&gt; Abbildung 1b)). </li><li> Drücken Sie vorsichtig Streifen Magic Tape auf die untere epidermalen Oberfläche eine 15 ml konischen Röhrchen mit. Achten Sie darauf , nicht in das Blattgewebe (Abbildung 1c) zu vernichten. Vorsichtig die magische Klebeband abziehen die unteren Epidermis (Abbildung 1d) abzustreifen und Mesophyll - Zellen (1e) aus. </li><li> Schneiden Sie den Autoklaven Band der Petrischale, mit Hilfe einer Pinzette zu bewegen , um das Band in die Petrischale und schwimmen auf der Enzymlösung (Abbildung 1f) zu passen, verlässt nach unten zeigt . Drehen, bei 60 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattformschüttler für 60 min, während der die Protoplasten werden in die Lösung freigesetzt werden. </li><li> Pinzette benutzen zu entfernen und die Streifen des Autoklaven Band (1g) zu verwerfen und die Lösung pipettiert werden die Protoplasten (Figur 1h) in ein 50 ml konisches Röhrchen enthält. Verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze (wie ein P5000 Spitze oder ein P1000 Spitze mit dem Ende abgeschnitten). </li><li> Zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 100 xg für 3 min bei 4 ° C und der Überstand mit einer Pipette entfernen. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> 10 ml W5-Lösung zu den Protoplasten und resuspendieren durch das Rohr sanft wirbeln. </li><li> Rest ist die Protoplasten auf Eis für 30-60 min. In diesem Schritt beurteilt Ausbeute von Protoplasten in einem Hämozytometer (1I) zu zählen. </li><li> Sammle die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min bei 4 ° C und entfernt den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie darauf, wie das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Protoplasten / ml in MMg Lösung. </li></ol> 3. Protoplasten Transfection <ol><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l Reporter-Plasmid (2 ug / ul) zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> In 400 ul Protoplasten auf das Rohr. </li><li> Fügen Sie ein Volumen (410 ul) PEG-Lösung und mischen durch das Rohr sanft 12-maliges Umdrehen der Protoplasten zu transfizieren. </li><li> Nach 8-15 min incubation bei Raumtemperatur, verdünnt das Protoplasten-DNA-PEG-Mischung mit vier Bänden (1640 ul) W5-Lösung und mischen durch vorsichtiges sechsmal umgekehrt wird. </li><li> Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wieder einmal vorsichtig, denn das Pellet sehr lose ist. </li><li> Resuspendieren der Protoplasten in 1250 ul Imaging-Lösung. </li><li> Aliquot 200 ul in sechs replizieren Wells einer 96-Well-Platte, füllen Sie alle leeren Brunnen mit W5-Lösung und versiegeln Sie die Platte mit einem Klebstoff klaren Deckel geeignet für Leucht Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Platte zu jeder Leucht Imaging Einrichtung geeignet für Pflanzen Bildgebung. Ändern Sie die Klebe Deckel auf den Platten 10-15 Minuten nach der Übertragung Kondensation und Druckdifferenzen zwischen den Vertiefungen zu vermeiden, dann Imaging starten. Lesen Sie alle die Platte ~ 45 min (3 sec pro Vertiefung) für fünf Tage bei Raumtemperatur. Beachten Sie dasHäufigkeit der Platte liest und die Lesezeit pro Vertiefung könnte auf dem Imaging-Setup abhängig. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Sie die Lumineszenz Ergebnisse , eine Analyse - Software (zB Biologische Rhythmen Analyse - Software - System (BRASS) 22). Vergleichen Sie die Mutantenlinie zu Wildtyp-Kontrollen circadian Mängel aufzudecken. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier stellen wir einen schnellen Test zirkadianen Zeitraum Defekte in Arabidopsis Linien zu ermitteln, einschließlich der Isolierung von Protoplasten, Transfektion und luminecent Bildgebung. Die zirkadiane Periode in Wildtyp - Arabidopsis und die Uhr - Mutanten CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX wurde aus Messungen der Lumineszenz von einem CCA1pro berechnet: LUC Reporter und fand aus ganzen Pflanzen zeit- erzeugt mit den veröffentlichten Daten konsistent zu sein raubend transgene Ansätze (Tabelle 2). Unter Verwendung dieses Assays Arabidopsis-Mutanten zu screenen, vermeidet die anfängliche Anforderung transgener Leuchtlinien zu erzeugen, was zeitaufwendig ist und möglicherweise nur zeigen, dass eine bestimmte mutierte Wildtyp-Rhythmen aufweist. Ein klarer Vorteil dieses Protokolls ist , dass jede Arabidopsis Linie in kurzer Zeit für veränderte zirkadianen Rhythmen Transkriptions gescreent werden können, die die Identifizierung von mehreren Genen in Pflanzen helfen beeinflussen Zeitnehmung. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolierung von Protoplasten kann mühsam sein, vor allem, wenn die mutierte Linie einen Schatten gestellt Phänotyp zeigt. Zuvor berichteten Verfahren für Protoplasten Erzeugung umfassen Blätter oder Sämlinge in dünne Streifen und Vakuum Schneiden der Streifen mit Enzymlösung infiltriert die Enzyme zu ermöglichen , um die Zellwände 26,27 erreichen. Die anschließende Verdauung erfordert mindestens 3 h Inkubation im Dunkeln die Protoplasten in die Enzymlösung zu lösen. Bei Vakuuminfiltration nicht angewendet wird, sollte die Inkubationszeit bis zu 18 Stunden wird empfohlen. In dem Protokoll hier vorgestellten ist nicht notwendig, Vakuuminfiltration, weil die Epidermiszellschicht undurchdringlich für die Enzyme durch ein Band entfernt wird. Wenn Protoplasten durch Schneiden Pflanzenmaterial zu erzeugen ist es notwendig, getrennte Protoplasten aus Zellwandtrümmer nach der Verdauung; Dies wird typischerweise durch Filtrieren der Lösung oder Reinigung auf einem Zucker Gradienten 27,26 erfolgen. Hier wird jede unverdauten Gewebe auf dem Autoklaven Band bleiben nachVerdauung, so Filtration und Zucker Gradientenreinigung der Protoplasten verzichtet werden kann. Es gibt eine Chance, dass die Belastung aus längeren Protoplastierung Verfahren die Lebensfähigkeit der Zellen und die innere Uhr beeinflusst. Das bandbasierte Protoplastierung Verfahren 20 visualisiert hier ergibt sich eine hohe Anzahl von Protoplasten; und die Lebensfähigkeit der Zellen über einen zirkadianen Zeitreihe gegeben und die Anpassungsperiodenlängen von Protoplasten und ganzen Sämlingen (Tabelle 2), die hier beschriebene Methode wird über alternative Verfahren bevorzugt Protoplasten zu erzeugen. Der Transfektionsstufe des Protokolls ist ein wichtiger Schritt, dass die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Protoplasten. Die PEG-Lösung kann die DNA in die Zelle geliefert werden, und beide Inkubationszeit in dieser Lösung (Schritt 3.4), und den Prozentsatz der PEG sollte empirisch bestimmt werden. Die Standardkonzentration beträgt 20%, mit geringeren Konzentrationen die Transformationseffizienz zu reduzieren und eine höhereKonzentrationen Lebensfähigkeit reduziert 28. Die Inkubationszeit so kurz wie 5 Minuten konnten effiziente Transfektion der Protoplasten 27 ergeben. Die Protoplasten können auf jeder Leucht Imaging-Plattform abgebildet werden. In diesem Video haben wir einen Lumineszenz-Plattenleser ausgestattet mit Außenbeleuchtung (rot und blauen LEDs, 630 und 470 nm, jeweils bei einer kombinierten Intensität von ~ 20 &amp; mgr; E) verwendet, die für die Hochdurchsatz-Screening und häufige Messungen ermöglicht. Andere Bildgebungsgeräte, die Lumineszenz, wie beispielsweise alternative Plattenleser oder Setups um eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) Kamera basierend erkennt, könnte genauso gut so lange angewendet werden, wie Beleuchtung für die Photosynthese zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung einer CCD-Kamera auf einem steuerbaren Schrank montiert ist, dass Licht und Temperatur programmiert werden können. Ein Nachteil ist die längere Aufnahmezeit, die Einführung längere Zeiträume der Finsternis, die Stress zu den Protoplasten zusätzlich dazu führen können, störening endogene Zeitnehmung. Unabhängig davon, welche experimentelle Plattform gewählt wird, die Anpassung der Einstellungen ist wahrscheinlich notwendig sein, im Vergleich zu Einstellungen für Sämlinge oder reifen Pflanzen. Nach unserer Erfahrung bei der Transfektion und / oder Luciferin in dem Abbildungspuffer die Konzentrationen von Reporterplasmid Erhöhung könnte keine erratischen oder schnell dämpfen Rhythmen beheben, das in ersten Experimenten auftreten könnten. In zukünftigen Experimenten kann die hier beschriebene Methode angewendet, um die zirkadianen Phänotyp jeder Mutante von Arabidopsis Linie zu studieren. Mit geringfügigen Modifikationen könnte die Wirkung von zB verschiedene Medikamente auf timekeeping in diesem Setup untersucht werden. Darüber hinaus kann die Transfektion modifiziert werden , um Gen künstliche microRNA enthalten 19 zum Schweigen zu bringen, die Vielseitigkeit dieses Protokolls zu erweitern. Protokolle Reisprotoplasten zu erzeugen , sind gut etablierte 29 und das Bildgebungsprotokoll hier vorgestellten könnte gleichermaßen angewendet werden unsere u zu fördernERSTÄNDIGUNG der Uhr in wirtschaftlich wichtigen monokotylen Kulturpflanzen.

Die meisten lebenden Organismen besitzen ein endogenes Zeitnehmer effiziente Vermittlung von täglichen Änderungen der Umwelt zu unterstützen. Dieser Zeitnehmer, der zirkadianen Uhr reguliert viele Aspekte des Stoffwechsels und der Physiologie eines Organismus vorhersagbare Änderungen der äußeren Umgebung zu antizipieren. Bei Pflanzen zum Beispiel Vorgriff auf zeitlich vorhersehbar Erreger oder Pflanzenfresser Angriffe stark reduziert Gesamt Anfälligkeit 1 bis 4. Stärkemetabolismus ist eng durch die innere Uhr reguliert zuletzt bis zum frühen Morgen , dass Stärke Reserven , um sicherzustellen , ob 5 bei langen oder kurzen Tag Bedingungen gezüchtet. Tatsächlich Pflanzen, mit Zirkadianrhythmen die 24 - Stunden - Umgebung zeigen eine erhöhte Wachstumsraten passende, Kohlenstofffixierung Raten und Überlebensraten auf Pflanzen verglichen 6 eine Uhr nicht passender Zeit läuft. Den starken Einfluss der zirkadianen Rhythmen in allen diesen Verfahren entsteht zu einem großen Teil von der rhythmischen Regulierung von bis zu einem Drittelder gesamten Transkriptom in Arabidopsis 7. Diese rhythmische Genprodukte werden in einem breiten Spektrum von zellulären Prozessen einschließlich Stoffwechselwege, Hormonsignalisierung und Stressreaktionen beteiligt 7. Hinzu kommt, dass, wird durch zirkadianen Regulation der Phosphorylierung 8 und höchstwahrscheinlich andere post-translationale Modifikationen (PTM) direkt circadian Regulierung der Proteinfunktion etabliert. In der Mitte des zirkadianen Uhr , die diese tägliche Transkriptions Umprogrammierung treibt liegt ein Netz von Transkriptions / Translations - Feedback - Schleifen (TTFLs), einschließlich der Morgen-exprimierte Gene zirkadianen Uhr ASSOCIATED 1 (CCA1) und LATE ELONGATED Hypokotyls (LHY), die die Expression unterdrücken des abends Gene ZEITPUNKT dER CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) und die Mitglieder des abends Komplex (EG); LUX ARRHYTHMO (LUX), frühe Blüte 3 (ELF3) und ELF4 9 bis 11. Zusammen Witzh die PSEUDO RESPONSE REGLER -genes (PRR3, 5, 7 und 9), reprimiert TOC1 CCA1 / LHY - Expression während der EG wirkt als positiver Regulator 12 bis 14. Zusätzlich zur Rückkopplungsmechanismen, post-transkriptionale und post-translationalen Regulation der TTFL Netzkomponenten spielt eine wichtige Rolle bei der Abstimmung zirkadianen Rhythmen. Bis heute ist die am häufigsten vorkommende PTM auf zirkadianen Uhr Proteine ​​identifiziert ist Phosphorylierung 15. Die Phosphorylierung von CCA1 von Casein Kinase 2 (CK2) wirkt sich auf seine Bindung 16 Veranstalter zum Ziel und ist wichtig für die Temperaturkompensation des zirkadianen Uhr 17. Die PRR Proteine ​​werden unterschiedlich über den zirkadianen Zyklus phosphoryliert, und die Phosphorylierung von TOC1 wirkt Wechselwirkung mit seinem negativen Regulator, der Abend-Phasen - Taktkomponente Zeitlupe (ZTL) 18. Diese Beispiele zeigen, wie PTMs und Protein-Protein-Wechselwirkungen tune das TTFL Netzwerk in eine 24-Stunden-Transkriptions Oszillators. Für eine detaillierte Einführung in die Transkriptions Clock - Netzwerk und dessen Regulation sind ausgezeichnet jüngsten Bewertungen verfügbar (zB Referenz 15). Doch was bleibt weniger klar ist, inwieweit die rhythmisch geregelte Prozesse und andere Aspekte des Zellstoffwechsels selbst zurück in den Zeitmessungsmechanismus zuzuführen. Umfangreichen Screening von Arabidopsis-Mutanten zur Taktfehler könnten gewinnen weiteres Verständnis, welche Mechanismen oder Signalwege könnte in der Erzeugung von 24 Stunden Rhythmen von einem TTFL Netzwerk eingebunden werden. Zu diesem Zweck Kim und Somers veröffentlichte zuvor ein Durchbruch Verfahren für die effiziente und schnelle Analyse von Takt - Funktion in jeder Arabidopsis Linie 19. Basierend auf der Verwendung von transienten Expression in Protoplasten übertrifft diese Methode die Notwendigkeit für einen stabilen transgenen Linien oder kreuzt, um lumineszente Taktmarkierungslinien. Hier visualisieren wir eine ertragreiche Protoplasten isolation Verfahren 20 mit einer optimierten Protokolls kombiniert circadian Defekte zu screenen durch lumineszente Bildgebung von transient exprimierten Taktmarkierungen in einer 96-Well - Plattenlesegerät. Wir werden gut charakterisierte Uhr Mutanten Wildtyp Col- 0 Arabidopsis vergleichen die Methodik hier erfolgreich erkennt veränderten Tagesrhythmus beschrieben zu bestätigen. Die Protoplasten aus diesen Linien abgeleitet sind mit einem Reporterkonstrukt transfiziert , das Glühwürmchen - Luciferase aus dem zirkadianen CCA1 Promotor exprimiert; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalysiert die mehrstufige Reaktion , in der Luciferin umgewandelt wird elektronisch angeregten Oxyluciferin dass Licht 21 emittiert, die über die Zeit abgebildet wird die Periode, die Amplitude und Phase der Transkriptions Rhythmen in diesen Protoplasten zu beurteilen. Das Protokoll besteht aus drei Hauptteilen; der Protoplasten zu isolieren, die Protoplasten mit dem Reporter-Plasmid transfizieren und Leucht imAltern. Diese drei Teile sollten immer an einem einzigen Tag durchgeführt werden, unter Verwendung von frisch hergestellten Puffer und Reagenzien. Pflanzenwachstum und Reinigung von ausreichenden Mengen an Reporterplasmid sollten im Voraus durchgeführt werden und sind in diesem Protokoll visualisiert.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&nbsp; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Luciferin-Pulver in 0,1 M Trisphosphatpuffer pH 8,0 bis zu einer Konzentration von 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>auflösen Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Dampfindikatorband</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microtiterplatten, 96 Well, flacher Boden, weiß</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, Klebedeckel für 96-Well-Platten</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 10 ml, ohne Nadel</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,22 &micro; m</td><td>Merck</td><td>Millipore SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Kostenloser Download bei amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Modifizierte Fuch-Rosenthal Zählkammer, Doppelzelle</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Optika Mikroskope</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar2 Multimode-Reader, mit Lumineszenzmodul</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle analyse von circadian phänotypen in arabidopsis protoplasten transfizierte mit einem lumineszenten clock reporter

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Die zirkadiane Uhr der Pflanze ermöglicht die Antizipation täglicher Veränderungen der Umgebung. Diese Antizipation unterstützt die Reaktionen auf zeitlich vorhersehbaren biotischen und abiotischen Stress. Umgekehrt beeinträchtigt eine Störung der zirkadianen Zeitmessung die Pflanzengesundheit stark und verringert die landwirtschaftlichen Ernteerträge. Es ist daher unerlässlich, dass wir die komplizierte Regulation des zirkadianen Rhythmus in Pflanzen verstehen, einschließlich der Faktoren, die die Bewegung des transkriptionellen Uhrwerks selbst beeinflussen.
Das Testen zirkadianer Defekte in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) beinhaltet traditionell das Kreuzen spezifischer mutierter Linien mit einer Linie, die rhythmisch Glühwürmchen-Luziferase von einem zirkadianen Uhr-Genpromotor exprimiert. Dieser Ansatz ist mühsam, zeitaufwändig und könnte erfolglos sein, wenn eine Mutante keinen zirkadianen Phänotyp aufweist. Die hier vorgestellte Methodik ermöglicht eine schnelle Ersteinschätzung der zirkadianen Phänotypen. Protoplasten, die von mutierten und wildartigen Arabidopsis abgeleitet sind, werden isoliert, mit einem rhythmisch exprimierten lumineszierenden Reporter transfiziert und 5 Tage lang unter konstanten Lichtbedingungen abgebildet. Lumineszierende Spuren zeigen direkt, ob sich die Freilaufzeit von mutierten Pflanzen von der von Wildtyp-Pflanzen unterscheidet. Der Vorteil der Methode besteht darin, dass jede Arabidopsis-Linie effizient gescreent werden kann, ohne dass eine stabil transgene lumineszierende Uhrmarkierungslinie in diesem mutierten Hintergrund erzeugt werden muss.

Die Protoplasten von Wildtyp - Arabidopsis wurden zu den bekannten Takt Mutanten im Vergleich CCA1 / lhy (kurze Zeit Mutante 2), ztl (lange Zeit Mutante 23), und die Überexpression Linie CCA1 -OX (24 arrhythmic). LUC Reporter und bebildert in konstantes Licht auf einem Plattenleser über 5 Tage: Alle wurden mit dem CCA1pro transient. Hier zeigen wir , dass in der CCA1 / lhy Mutante, die Freilaufzeit von circadian gesteuerte Genexpression verkürzt wird (Abbildung 2a), in Übereinstimmung mit der veröffentlichten analysierten Zeitraum von stabilen transgenen Expression von Leuchttaktmarkierungen 2,9. Die Periode der zirkadianen Schwingungen in Protoplasten der ZTL - Mutante ist länger als in Wildtyp (2b), in Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen aus Sämlingen, Zellsuspension cultures und Protoplasten 19,23,25. Die Überexpression von CCA1 sperrt die Uhr in Morgen-Phase und der globalen Transkription wird arrhythmic 24. Konsequent beobachteten wir keine Schwingungen in CCA1pro: LUC - Expression in CCA1 -OX Protoplasten (Abbildung 2c). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Protoplasten Circadian Rhythms Protoplasten von Col- 0, CCA1 / lhy, ztl und CCA1 -OX transient mit dem CCA1pro umgewandelt wurden: LUC - Konstrukt und zirkadianen Rhythmen in Lumineszenz wurden über 5 Tage abgebildet (A - C). (D) Circadian Zeitraum Schätzungen basieren auf Lumineszenz Spuren in Col -0, CCA1 / lhy und ZTL (A - B). Micheine ± SEM, n = 3-5, t-Test p-Wert , wie angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotyp </td><td> Period (Protoplasten) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Berichtet von: </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC in Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA in L er Hintergrund </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ztl </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC in Ökotyp C24 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arrhythmic </td><td> arrhythmic </td><td> pCCA1: LUC (LD nur Daten) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arrhythmic </td><td> RNA und Protein in Col -0 Hintergrund </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Circadian Rhythms in Protoplasten im Vergleich zu transgenen Keimlinge Die zirkadiane Periode von pCCA1. LUC - Expression in Protoplasten im Vergleich zu den Periodenlängen zunächst für die Mutation berichtet und, falls vorhanden, mit pCCA1: LUC - Expression in Col -0.

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die circadiane Periode in Arabidopsis-Linien durch Messung der Lumineszenz emittiert von transfizierten Protoplasten zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der circadianen Biologie zu beantworten, beispielsweise welche Gene Rückwirkungen auf den Zeitmessungsmechanismus selbst ausüben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle Analyse der circadianen Periode beliebiger Arabidopsis-Mutanten ermöglicht, ohne dass stabile transgene Linien erzeugt werden müssen.Um dieses Verfahren zu beginnen, beschriften Sie eine Petrischale und geben Sie 10 Milliliter gefilterte, sterilisierte Enzymlösung hinein. Befestigen Sie vier Streifen Autoklavierband mit der klebenden Seite nach oben auf einer sauberen Laboroberfläche und markieren Sie die Größe der Petrischale auf den Streifen. Sammeln Sie Pflanzen aus dem Wachstumsraum ein.Schneiden Sie Blätter von vier Wochen alten Pflanzen ab und drücken Sie die obere Epidermis auf das Autoklavierband, sodass die untere epidermale Oberfläche nach oben zeigt. Legen Sie Streifen aus zauberhaftem Klebeband auf die untere epidermale Oberfläche. Drücken Sie die Streifen vorsichtig mit einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen auf die Blätter, wobei darauf geachtet werden muss, das Blattgewebe nicht zu zerquetschen.Ziehen Sie das Klebeband vorsichtig ab, um die untere Epidermis zu entfernen und die Mesophyllzellen freizulegen. Schneiden Sie als Nächstes das Autoklavierband passend für die Petrischale zu und verwenden Sie eine Pinzette, um das Band in die Petrischale zu legen und es mit der Blattoberseite nach unten auf der Enzymlösung schwimmen zu lassen. Schütteln Sie 60 Minuten lang mit 60 U/min auf einem Plattenschüttler, wobei die Protoplasten in die Lösung freigesetzt werden.Nach 60 Minuten die Streifen Autoklavierband mit einer Pinzette entfernen und entsorgen. Mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die Lösung mit den Protoplasten in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Protoplasten bei 100 × g drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und anschließend vorsichtig den Überstand entfernen, da das Pellet sehr locker ist.Geben Sie 10 Milliliter W5-Lösung zu den Protoplasten hinzu und resuspendieren Sie diese durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe der Protoplasten zur Zellzählung. Stellen Sie die Protoplasten 30 bis 60 Minuten lang auf Eis. Während die Protoplasten auf Eis stehen, bestimmen Sie die Ausbeute durch Zählen der Protoplasten in einem Hämozytometer. Sammeln Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100&nbsp;g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig, da das Pellet sehr locker ist.Resuspendieren Sie die Protoplasten abschließend in MMg-Lösung auf eine Konzentration von 500.000 Protoplasten pro Milliliter. Beginnen Sie das Verfahren zur Protoplastentransfektion, indem Sie zehn Mikroliter Reporterplasmid in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen geben, gefolgt von 400 Mikrolitern Protoplasten. Geben Sie ein Volumen Polyethylenglykol, also PEG-Lösung, hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges 12-maliges Umstülpen des Röhrchens, um die Protoplasten zu transfizieren.Bei Raumtemperatur für acht bis 15 Minuten inkubieren. Die Protoplasten müssen ausreichend lange inkubiert werden, um eine effiziente Transfektion sicherzustellen, jedoch nicht zu lange, da dies ihre Lebensfähigkeit verringern würde. Verdünnen Sie anschließend die Protoplast-DNA-PEG-Mischung mit vier Volumina W5-Lösung und mischen Sie durch vorsichtiges Sechs-mal-Umstülpen.Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100&nbsp;gee für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Überstandsmaterial mit einer Pipette, wobei erneut große Vorsicht geboten ist, da das Pellet sehr locker ist. Resuspendieren Sie die Protoplasten in 1.250&nbsp;Mikroliter Imaging-Lösung.Die Protoplasten sollten sich leicht resuspendieren lassen, was darauf hindeutet, dass sie nach der Transfektion intakt sind. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung in sechs replizierte Vertiefungen einer 96-Loch-Platte und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit W5-Lösung auf. Versiegeln Sie die Platte mit einem haftenden, klaren Deckel, der für die lumineszenzbasierte Bildgebung geeignet ist.Um die Protoplasten abzubilden, überführen Sie die 96-Well-Platte in eine beliebige lumineszenzbasierte Bildgebungseinrichtung, die für die Pflanzenbildgebung geeignet ist. Wechseln Sie 10 bis 15 Minuten nach dem Überführen den Klebeverschluss der Platte, um Kondensation und Druckunterschiede zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme.Lesen Sie die Platte über fünf Tage hinweg alle 45 Minuten bei Raumtemperatur ab. Analysieren Sie anschließend die Lumineszenzdaten mit einer geeigneten Analysesoftware, beispielsweise dem Biological Rhythms Analysis Software System. Im Bild sind Mesophyllprotoplasten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, bei einer 200-fachen Vergrößerung dargestellt.Protoplasten von Wildtyp-Arabidopsis und des cca1/lhy-Mutanten wurden transfiziert und über fünf Tage hinweg im Plattenreader unter konstantem Licht beobachtet. Wie erwartet ist die freilaufende Periode der uhrkontrollierten Genexpression bei diesem Mutanten verkürzt. Im Gegensatz dazu ist die Periode der circadianen Oszillationen in Protoplasten des ztl-Mutanten verlängert.In Protoplasten mit Überexpression von CCA1 gab es keine Oszillationen in der Expression des Reporterkonstrukts, da die Überexpression von CCA1 zu Arrhythmie führt. Dieses Balkendiagramm zeigt die Schätzwerte für die circadiane Periode basierend auf Lumineszenzspuren in Wildtyp- und Clock-Mutanten-Protoplasten. Diese circadianen Perioden stimmen mit veröffentlichten Daten überein, die aus ganzen Pflanzen mithilfe zeitaufwändiger transgener Ansätze gewonnen wurden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gesunde Pflanzen zu verwenden und vorsichtig mit den Protoplasten umzugehen, da diese empfindlich sind. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arabidopsis-Protoplasten isoliert, transfiziert und bildlich darstellt.Mit diesen Techniken können jetzt beliebige Mutantenlinien untersucht werden, oder sie können sogar modifiziert werden, um Protoplasten anderer Pflanzenarten abzubilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Dieser Bericht beschreibt eine Methode, bei der ein R-Skript in der Open-Source-Software RStudio verwendet wird, um großräumige Datensätze zu analysieren, die aus Zeitreihenexperimenten gewonnen wurden.

Eine benutzerfreundliche und leistungsstarke R-Analyse von großräumigen Datensätzen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Erfahren Sie die schnelle Analyse zirkadianer Phänotypen in Arabidopsis-Protoplasten mit lumineszenten Reportern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Uhrgenen ohne stabile transgene Linien.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

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