Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter
17. September 2016
Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.
Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die zirkadiane Periode in Arabidopsis-Linien durch Messung der Lumineszenz zu bestimmen, die von transfizierten Protoplasten emittiert wird. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der zirkadianen Biologie zu beantworten, z. B. welche Gene in den Zeitmessmechanismus selbst zurückfließen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle Analyse der zirkadianen Periode jeder Arabidopsis-Mutante ermöglicht, ohne dass stabile transgene Linien erzeugt werden müssen.
Um diesen Vorgang zu starten, beschriften Sie eine Petrischale und fügen Sie ihr 10 Milliliter gefilterte sterilisierte Enzymlösung hinzu. Befestigen Sie vier Streifen Autoklavenklebeband mit der klebrigen Seite nach oben auf einer sauberen Laboroberfläche und markieren Sie die Größe der Petrischale auf den Streifen. Sammeln Sie Pläne aus dem Wachstumsraum.
Schneiden Sie die Blätter von vier Wochen alten Pflanzen ab und drücken Sie die obere Epidermis auf das Autoklavenband, so dass die untere Epidermisfläche nach oben zeigt. Kleben Sie Streifen magisches Klebeband auf die untere Epidermisoberfläche. Drücken Sie die Streifen mit einem konischen 15-Liter-Rohr vorsichtig auf die Blätter, wobei Sie darauf achten, dass das Blattgewebe nicht zerdrückt wird.
Ziehe das Klebeband vorsichtig ab, um die untere Epidermis abzustreifen und die Mesophyllzellen freizulegen. Schneiden Sie als Nächstes das Autoklavenband so ab, dass es in die Petrischale passt, und schieben Sie das Klebeband mit einer Pinzette in die Petrischale und lassen Sie es mit den Blättern nach unten auf der Enzymlösung schwimmen. Drehen Sie sich 60 Minuten lang mit 60 U/min auf einem Plattformschüttler, wobei die Protoplasten in die Lösung freigesetzt werden.
Verwenden Sie nach 60 Minuten eine Pinzette, um die Streifen des Autoklavenbandes zu entfernen und zu entsorgen. Pipettenspitze pipettieren Sie die Lösung, die die Protoplasten enthält, mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Protoplasten bei 100 Gee drei Minuten lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, da das Pellet sehr locker ist.
Geben Sie 10 Milliliter W5-Lösung zu den Protoplasten und resuspendieren Sie sie, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schwenken. Entnehmen Sie ein Aliquot von Protoplasten zum Zählen. Lassen Sie die Protoplasten 30 bis 60 Minuten auf Eis ruhen.
Während die Protoplasten auf Eis liegen, beurteilen Sie die Ausbeute, indem Sie die Protoplasten in einem Hämozytometer zählen. Sammeln Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 Gee für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, da das Pellet sehr locker ist.
Zum Schluss resuspendieren Sie die Protoplasten in MMg-Lösung auf eine Konzentration von 500.000 Protoplasten pro Milliliter. Beginnen Sie das Verfahren zur Protoplastentransfektion, indem Sie zehn Mikroliter Reporterplasmid in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen geben, gefolgt von 400 Mikrolitern Protoplasten. Fügen Sie ein Volumen Polyethylenglykol oder PEG-Lösung hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 12 Mal vorsichtig umdrehen, um die Protoplasten zu transfizieren.
Acht bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Protoplasten müssen lange genug inkubiert werden, um eine effiziente Transfektion zu gewährleisten, aber nicht zu lange, da dies ihre Lebensfähigkeit verringert. Als nächstes verdünnen Sie die Protoplasten-DNA-PEG-Mischung mit vier Volumina W5-Lösung und mischen Sie durch vorsichtiges Invertieren sechsmal.
Die transfizierten Protoplasten werden durch Zentrifugation bei 100 Gee für zwei Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und seien Sie dabei sehr vorsichtig, da das Pellet sehr locker ist. Resuspendieren Sie die Protoplasten in 1.250 Mikrolitern Bildgebungslösung.
Die Protoplasten sollten sich relativ leicht resuspendieren lassen, was darauf hindeutet, dass sie nach der Transfektion intakt sind. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung in sechs replizierte Vertiefungen einer 96-Well-Platte und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit W5-Lösung. Verschließen Sie die Platte mit einem selbstklebenden, durchsichtigen Deckel, der für die Lumineszenzfotografie geeignet ist.
Um die Protoplasten abzubilden, übertragen Sie die 96-Well-Platte in ein beliebiges Lumineszenz-Imaging-Setup, das für die Pflanzenbildgebung geeignet ist. Wechseln Sie den Klebedeckel auf der Platte 10 bis 15 Minuten nach dem Transfer, um Kondensation und Druckunterschiede zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Starten Sie die Bildgebung.
Lesen Sie den Teller fünf Tage lang alle 45 Minuten bei Raumtemperatur ab. Analysieren Sie anschließend die Lumineszenzergebnisse mit einer beliebigen Analysesoftware, z. B. dem Biological Rhythms Analysis Software System. Mesophyll-Protoplasten, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, sind in diesem Bild in einer 200-fachen Vergrößerung zu sehen.
Bei Proplasten handelt es sich um Wildtyp-Arabidopsis und die cca1/LHY-Mutante wurde transfiziert und über fünf Tage hinweg bei konstantem Licht auf einem Plattenreader abgebildet. Erwartungsgemäß ist die freilaufende Periode der uhrgesteuerten Genexpression in dieser Mutante verkürzt. Im Gegensatz dazu ist die Periode der zirkadianen Oszillationen in Protoplasten der ztl-Mutante verlängert.
Bei Protoplasten, die CCA1 überexprimierten, gab es keine Oszillationen in der Expression des Reporterkonstrukts, da eine Überexpression von CCA1 zu Arrhythmien führt. Dieses Balkendiagramm zeigt die Schätzungen der zirkadianen Periode basierend auf Lumineszenzspuren in den Wildtyp- und Uhrmutanten-Protoplasten. Diese zirkadianen Perioden stimmen mit veröffentlichten Daten überein, die mit zeitaufwändigen transgenen Ansätzen aus ganzen Pflanzen gewonnen wurden.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, gesunde Pflanzen zu verwenden und die Protoplasten vorsichtig zu behandeln, da sie zerbrechlich sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arabidopsis-Protoplasten isoliert, transfiziert und abbildet.
Diese Techniken können nun auf jede mutierte Linie angewendet oder sogar modifiziert werden, um Protoplasten anderer Pflanzenarten abzubilden.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Beurteilung zirkadianer Phänotypen in Arabidopsis mittels lumineszenzbasierter Bildgebung von Protoplasten vor. Das Verfahren ermöglicht eine schnelle Analyse zirkadianer Perioden in verschiedenen Mutantenlinien, ohne dass stabile transgene Linien erforderlich sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zirkadiane Biologie
- Pflanzenphysiologie
- Genetische Analyse
Hintergrund
- Die circadiane Uhr beeinflusst einen erheblichen Teil des Transkriptoms von Arabidopsis.
- Das Verständnis, welche Gene zur Zeitmessung beitragen, ist entscheidend für die circadiane Biologie.
- Herkömmliche Methoden erfordern stabile transgene Linien, deren Erstellung zeitaufwendig ist.
- Diese neue Methode vereinfacht den Prozess, indem sie vorübergehend exprimierte circadiane Reporter verwendet.
Zweck der Studie
- Bestimmung der circadianen Periode in Arabidopsis-Linien.
- Identifizierung von Genen, die in den circadianen Taktmechanismus zurückkopplen.
- Bereitstellung einer schnellen und effizienten Methode zur Analyse circadianer Rhythmen in Mutantenlinien.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Mesophyllprotoplasten aus Arabidopsis-Blättern.
- Transfektion der Protoplasten mit einem lumineszenten zirkadianen Reporter.
- Messung der Lumineszenz zur Beurteilung zirkadianer Rhythmen.
- Analyse der Lumineszenzdaten mithilfe spezialisierter Software.
Hauptergebnisse
- Nachweis der Fähigkeit, circadiane Perioden in verschiedenen Arabidopsis-Mutanten zu messen.
- Bestätigung, dass die cca1/lhy-Mutante eine verkürzte freilaufende Periode aufweist.
- Zeigen, dass die ztl-Mutante eine verlängerte circadiane Oszillationsperiode besitzt.
- Validierung der Methode im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Ansätzen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ermöglicht eine schnelle Beurteilung der circadianen Rhythmen bei Arabidopsis.
- Sie kann auf jede Mutantenlinie angewendet werden und erweitert damit die Forschung in der circadianen Biologie.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Pflanzenarten erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle Phänotypisierung der circadianen Uhrfunktion in Arabidopsis-Protoplasten mithilfe lumineszenter Reporter ermöglicht eine beschleunigte Validierung von Zielstrukturen und die Reduzierung mechanistischer Risiken in der Forschung und Entwicklung der Pflanzenbiologie. Dieser Ansatz beschleunigt die Bewertung genetischer Störungen in der circadianen Regulation und unterstützt frühzeitige, vorhersagebasierte Entscheidungen in kritischen Phasen der Entdeckung. Die Flexibilität der Methode erlaubt eine breite Portfolio-Screening-Analyse, ohne dass das Erzeugen stabiler transgener Linien zum Engpass wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Genfunktion in der circadianen Regulation mittels transiente Reporter-Assays.
- Erleichtert die schnelle biologische Entschärfung von Risiken durch Unterscheidung von Mutanten mit veränderten Uhrenphänotypen.
- Unterstützt die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturauswahl, indem quantitative Periodenmessungen bereitgestellt werden.
- Beschleunigt die Portfolio-Triage durch hochdurchsatzfähige Mutantenscreenings.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, protoplastenbasierte Systeme für nachgeschaltete funktionelle Genomik-Workflows vor.
- Liefert standardisierte, reproduzierbare lumineszente Messwerte für die quantitative Assay-Entwicklung.
- Ermöglicht skalierbare Untersuchungen verschiedener genetischer Hintergründe ohne stabile Transformation.
- Unterstützt zuverlässige Bewertung von Genveränderungen in einem kontrollierten Umfeld.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Einbindung in translationale Biomarker-Strategien, indem die Genfunktion mit zirkadianen Ausgabesignalen verknüpft wird.
- Bietet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in Pflanzensystemen.
- Verringert das Risiko beim Voranbringen von Kandidaten, indem der mechanistische Einfluss auf die Uhrfunktion bestätigt wird.
- Bietet eine prädiktive Risikominderung für Merkmale, die für die landwirtschaftliche Produktivität relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser lumineszente Protoplasten-Assay eignet sich für den Bereich zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Leitstrukturen und ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung sowie funktionelle Bildschirmtests, bevor aufwändige transgene Arbeiten durchgeführt werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt hypothesengeleitete Untersuchungen der Genfunktion in der circadianen Regulation.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Lumineszenzdaten für vergleichende Analysen.
- Analytik: Erzeugt Zeitreihenausgaben, die für die statistische Periodenschätzung und die Phänotypklassifizierung geeignet sind.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung in Pflanzenmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für vielfältige Mutanten und Art-Hintergründe.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Phänotypisierungs-Workflows.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in der frühen Forschung und Entwicklung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in der Protoplasten-Isolierung, Transfektion und lumineszenzbasierten Bildgebung.
- Erfordert Zugang zu plattenbasierten Lumineszenzdetektoren und kompatibler Analyse-Software.
- Setzt sorgfältige Handhabung und Standardisierung voraus, um die Protoplasten-Vitalität und Datenqualität sicherzustellen.
- Kann durch Optimierung des Protokolls auf andere Pflanzenarten übertragen werden.
- Ist durch die vorübergehende Natur der Reporter-Expression und die Stabilität der Protoplasten begrenzt.
