Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die circadiane Periode in Arabidopsis-Linien durch Messung der Lumineszenz emittiert von transfizierten Protoplasten zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der circadianen Biologie zu beantworten, beispielsweise welche Gene Rückwirkungen auf den Zeitmessungsmechanismus selbst ausüben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle Analyse der circadianen Periode beliebiger Arabidopsis-Mutanten ermöglicht, ohne dass stabile transgene Linien erzeugt werden müssen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, beschriften Sie eine Petrischale und geben Sie 10 Milliliter gefilterte, sterilisierte Enzymlösung hinein. Befestigen Sie vier Streifen Autoklavierband mit der klebenden Seite nach oben auf einer sauberen Laboroberfläche und markieren Sie die Größe der Petrischale auf den Streifen. Sammeln Sie Pflanzen aus dem Wachstumsraum ein.

Schneiden Sie Blätter von vier Wochen alten Pflanzen ab und drücken Sie die obere Epidermis auf das Autoklavierband, sodass die untere epidermale Oberfläche nach oben zeigt. Legen Sie Streifen aus zauberhaftem Klebeband auf die untere epidermale Oberfläche. Drücken Sie die Streifen vorsichtig mit einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen auf die Blätter, wobei darauf geachtet werden muss, das Blattgewebe nicht zu zerquetschen.

Ziehen Sie das Klebeband vorsichtig ab, um die untere Epidermis zu entfernen und die Mesophyllzellen freizulegen. Schneiden Sie als Nächstes das Autoklavierband passend für die Petrischale zu und verwenden Sie eine Pinzette, um das Band in die Petrischale zu legen und es mit der Blattoberseite nach unten auf der Enzymlösung schwimmen zu lassen. Schütteln Sie 60 Minuten lang mit 60 U/min auf einem Plattenschüttler, wobei die Protoplasten in die Lösung freigesetzt werden.

Nach 60 Minuten die Streifen Autoklavierband mit einer Pinzette entfernen und entsorgen. Mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die Lösung mit den Protoplasten in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Protoplasten bei 100 × g drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und anschließend vorsichtig den Überstand entfernen, da das Pellet sehr locker ist.

Geben Sie 10 Milliliter W5-Lösung zu den Protoplasten hinzu und resuspendieren Sie diese durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe der Protoplasten zur Zellzählung. Stellen Sie die Protoplasten 30 bis 60 Minuten lang auf Eis.

Während die Protoplasten auf Eis stehen, bestimmen Sie die Ausbeute durch Zählen der Protoplasten in einem Hämozytometer. Sammeln Sie die Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig, da das Pellet sehr locker ist.

Resuspendieren Sie die Protoplasten abschließend in MMg-Lösung auf eine Konzentration von 500.000 Protoplasten pro Milliliter. Beginnen Sie das Verfahren zur Protoplastentransfektion, indem Sie zehn Mikroliter Reporterplasmid in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen geben, gefolgt von 400 Mikrolitern Protoplasten. Geben Sie ein Volumen Polyethylenglykol, also PEG-Lösung, hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges 12-maliges Umstülpen des Röhrchens, um die Protoplasten zu transfizieren.

Bei Raumtemperatur für acht bis 15 Minuten inkubieren. Die Protoplasten müssen ausreichend lange inkubiert werden, um eine effiziente Transfektion sicherzustellen, jedoch nicht zu lange, da dies ihre Lebensfähigkeit verringern würde. Verdünnen Sie anschließend die Protoplast-DNA-PEG-Mischung mit vier Volumina W5-Lösung und mischen Sie durch vorsichtiges Sechs-mal-Umstülpen.

Sammeln Sie die transfizierten Protoplasten durch Zentrifugation bei 100 gee für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Überstandsmaterial mit einer Pipette, wobei erneut große Vorsicht geboten ist, da das Pellet sehr locker ist. Resuspendieren Sie die Protoplasten in 1.250 Mikroliter Imaging-Lösung.

Die Protoplasten sollten sich leicht resuspendieren lassen, was darauf hindeutet, dass sie nach der Transfektion intakt sind. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung in sechs replizierte Vertiefungen einer 96-Loch-Platte und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit W5-Lösung auf. Versiegeln Sie die Platte mit einem haftenden, klaren Deckel, der für die lumineszenzbasierte Bildgebung geeignet ist.

Um die Protoplasten abzubilden, überführen Sie die 96-Well-Platte in eine beliebige lumineszenzbasierte Bildgebungseinrichtung, die für die Pflanzenbildgebung geeignet ist. Wechseln Sie 10 bis 15 Minuten nach dem Überführen den Klebeverschluss der Platte, um Kondensation und Druckunterschiede zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Lesen Sie die Platte über fünf Tage hinweg alle 45 Minuten bei Raumtemperatur ab. Analysieren Sie anschließend die Lumineszenzdaten mit einer geeigneten Analysesoftware, beispielsweise dem Biological Rhythms Analysis Software System. Im Bild sind Mesophyllprotoplasten, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, bei einer 200-fachen Vergrößerung dargestellt.

Protoplasten von Wildtyp-Arabidopsis und des cca1/lhy-Mutanten wurden transfiziert und über fünf Tage hinweg im Plattenreader unter konstantem Licht beobachtet. Wie erwartet ist die freilaufende Periode der uhrkontrollierten Genexpression bei diesem Mutanten verkürzt. Im Gegensatz dazu ist die Periode der circadianen Oszillationen in Protoplasten des ztl-Mutanten verlängert.

In Protoplasten mit Überexpression von CCA1 gab es keine Oszillationen in der Expression des Reporterkonstrukts, da die Überexpression von CCA1 zu Arrhythmie führt. Dieses Balkendiagramm zeigt die Schätzwerte für die circadiane Periode basierend auf Lumineszenzspuren in Wildtyp- und Clock-Mutanten-Protoplasten. Diese circadianen Perioden stimmen mit veröffentlichten Daten überein, die aus ganzen Pflanzen mithilfe zeitaufwändiger transgener Ansätze gewonnen wurden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gesunde Pflanzen zu verwenden und vorsichtig mit den Protoplasten umzugehen, da diese empfindlich sind. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arabidopsis-Protoplasten isoliert, transfiziert und bildlich darstellt.

Mit diesen Techniken können jetzt beliebige Mutantenlinien untersucht werden, oder sie können sogar modifiziert werden, um Protoplasten anderer Pflanzenarten abzubilden.