Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, vesikuläre Transportereignisse im endozytären Signalweg lebender Zellen zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des vesikulären Transports zu beantworten, z. B. wie Mutationen oder Veränderungen in der Proteinexpression die Raten und die Effizienz von Transportereignissen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Quantifizierung von endozytären Transport- und lebenden Zellen ermöglicht, indem die Intensität von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen gemessen wird.

Nach der Herstellung von Lösungen und Medien gemäß dem Textprotokoll inokulieren zwei bis drei Kolonien von Hefezellen in fünf Milliliter YNB-Medium, wobei zusätzliche Nährstoffe zur Aufrechterhaltung der Plasmidselektion fehlen. Züchten Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie 16 bis 24 Stunden lang. Messen Sie etwa drei Stunden vor der Bildgebung den OD 600 jeder Übernachtkultur.

Bereiten Sie dann fünf Milliliterverdünnungen mit einem OD 600 von 0,35 bis 0,4 in YNB-Medium vor, denen zusätzliche Nährstoffe für die Plasmiderhaltung fehlen, und wachsen Sie bei 30 Grad Celsius unter dreistündigem Schütteln. Während der Inkubation die Klimakammer des Mikroskops oder den beheizten Tisch auf 30 Grad Celsius voräquilibrieren. Nach der Vorbereitung eines mit Dosen behandelten Glastopfes mit acht Vertiefungen und eines Kammerobjektträgers für die Bildgebung gemäß dem Textprotokoll werden 200 Mikroliter YNB-Medium, dem zusätzliche Nährstoffe für die Plasmaselektion fehlen, in jede Vertiefung gegeben.

Wenn die Kulturen fertig sind, geben Sie einen Milliliter in ein Mikrokühlschrankröhrchen und pelletieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 8.000 U/min. Entfernen Sie dann 975 Mikroliter des Überstands. Das Zellpellet wird im verbleibenden Überstand wieder suspendiert.

Lassen Sie dann 2,5 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jeder Vertiefung der Acht-Well-Platte fallen. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen zu dispergieren, und lassen Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang ruhen. Legen Sie den Objektträger auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das auf 30 Grad Celsius ausgeglichen ist.

Verwenden Sie dann die Hellfeldbeleuchtung, um ein Feld mit Zellen zu lokalisieren. Geben Sie 50 Mikroliter vorgewärmtes YNB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Methionin zu den 200 Mikrolitern Medium in der Vertiefung, um eine endgültige Methioninkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang äquilibrieren, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.

Stellen Sie das Mikroskop dann unmittelbar vor der Bildgebung auf die gewünschte Brennebene ein. Erfassen Sie GFP in Hellfeld- oder DIC-Bildern im 5-Minuten-Intervall für 45 bis 60 Minuten. Verwendung identischer Aufnahmeparameter für alle Bilder innerhalb einer Zeitreihe.

Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner Zellen zu jedem Zeitpunkt und drücken Sie die Werte als Prozentsatz der Anfangsintensität des ersten Bildes aus. Nach dem Exportieren von Bildern gemäß dem Textprotokoll in Bild j öffnen Sie die Dateien im Dateimenü mit der Option Öffnen.

Verwenden Sie das Fluoreszenzbild für die Quantifizierung und das Hellfeld- oder DIC-Bild als Referenz, um die Position der Zellen zu identifizieren. Ausschließen von toten Zellen, die bei Betrachtung durch DIC dunkler erscheinen als lebende Zellen und Autofluoreszenz unter dem GFP-Kanal. Wählen Sie für Bilder mit unebenem Hintergrund im Menü "Prozess" den Algorithmus für die Hintergrundsubtraktion und wählen Sie die Standardeinstellung.

Sobald die Bilder aufgenommen wurden, ist es wichtig, eine Hintergrundsubtraktion durchzuführen, bevor mit dem Quantifizierungsverfahren fortgefahren wird. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da das Hintergrundsignal sonst Unterschiede zwischen den Samples überdecken oder dämpfen könnte. Umranden Sie eine Zelle mit dem Freihandauswahlwerkzeug und stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle, aber so wenig Bereich wie möglich außerhalb der Zelle enthalten ist.

Verwenden Sie dann im Menü Analysieren die Funktion "Maße einstellen", um die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert zu messen. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren und dann auf Tools klicken. Klicken Sie im Fenster ROI-Manager auf die Schaltfläche Hinzufügen, um den markierten Bereich als neuen ROI einzugeben.

Wiederholen Sie die Konturierung und Messung für die verbleibenden Zellen im Bild, wobei alle toten Zellen oder Zellen, die den Rand des Bildes berühren, ausgeschlossen werden. Speichern Sie die ausgewählten ROIs als ZIP-Datei, indem Sie auf die Schaltfläche "Messen" klicken, um die gemessenen Werte in einem neuen Fenster anzuzeigen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Mehr" und exportieren Sie alle Messungen in eine Tabellenkalkulation oder eine statistische Analysesoftware.

Beimpfen Sie zwei bis drei Kolonien von Hefezellen und 0,5 Milliliter YNB-Medium, denen zusätzliche Nährstoffe zur Aufrechterhaltung der Plasmidauswahl fehlen. Züchten Sie die Zellen auf einer Rolltrommel bei 30 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Fügen Sie einen Milliliter YNB-Medium hinzu, dem zusätzliche Nährstoffe für die Plasmiderhaltung fehlen, und bauen Sie weitere drei Stunden lang an.

Übertragen Sie als Nächstes je einen Milliliter Zellen in zwei Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Geben Sie dann 0,25 Milliliter YNB Met-Medium in das erste Röhrchen und 0,25 Milliliter YNB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Methionin in das zweite Röhrchen, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Bei einer großen Anzahl von Proben ist die Zugabe von Methionin zu staffeln, um Zeit für die Analyse der Fakten zu haben.

Unser Durchflusszytometer kann bis zu 40 Proben pro Lauf messen. Wir fügen Methionin in Chargen hinzu. Acht Proben alle fünf Minuten.

Dadurch wird sichergestellt, dass alle Proben zwischen 45 und 50 Minuten nach der Methioninzugabe gemessen werden. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang. Analysieren Sie dann die Zellen mittels Durchflusszytometrie, wählen Sie Vorwärtsstreuung oder FS als Maß für die Zellgröße und kartieren Sie die Intensität einer fließenden Fluoreszenz von einem FITC-Filter als Maß für die Internalisierung der Fracht.

Während der 45-minütigen Inkubation können Sie mit den Schiebereglern die Spannung der FS- und FITC-Kanäle anpassen, um die Detektion für den Größenbereich und die Fluoreszenzintensität der verwendeten Hefezellen zu optimieren. Messen Sie FS und Fluoreszenzintensität für 10.000 Zellen aus jeder Bedingung. Generieren Sie mit der Einstellung für eine hohe Flussrate ein Streudiagramm von FS gegen die Fluoreszenzintensität, indem Sie auf Diagramm hinzufügen klicken.

Wählen Sie dann FITC für die x-Achse und FS für die y-Achse aus und stellen Sie 1000 Punkte grafisch dar. Weisen Sie mithilfe der Gate-Funktion und der Wildtyp-Bedingung "Met" ein vertikales Gate zu, sodass etwa 5 % der hellsten Zellen rechts vom Gate liegen. Verwenden Sie dieses Gating für alle anderen Bedingungen im Experiment.

Wie hier gezeigt, wurde eine Zeitrafferbildgebung von Zellen in Fünf-Minuten-Intervallen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Methionin durchgeführt, um die Internalisierung von GFP oder Fluor-markiertem Mup1 und Veränderungen der Fluoreszenz zu überwachen. Erwartungsgemäß blieben GFP und Fluor-markiertes Mup1 in Abwesenheit von Methionin an der Plasmamembran. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die in Gegenwart von Methionin abgebildet wurden, eine fortschreitende Verarmung des Fluoreszenzsignals von der Zelloberfläche, die mit der Internalisierung der Fracht übereinstimmt.

Die Kinetik der Fluoreszenz, die in Gegenwart von Methionin verloren ging, war jedoch in den Mup1-GFP-Zellen im Vergleich zu den pHlourin Mup1-Zellen verzögert. Diese Streudiagramme vergleichen die Fluoreszenzintensität von Wildtyp- oder vier Delta-ENTH1-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Methionin nach Anwendung eines vertikalen Gates. 4 % der Wildtyp-Met-Zellen befanden sich auf der rechten Seite des Gates, was den hellsten Zellen in der Population entsprach, während 65 % der unbehandelten Wildtyp-Zellen im Gate enthalten waren.

Im Gegensatz dazu zeigten die vier delta ENTH1-Zellen keinen Unterschied in der Verteilung von hellen und schwachen Zellen, was auf einen Defekt in der Endozytose hindeutet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Startzeiten für die Durchführung gleichzeitiger Experimente zu staffeln, damit die Endpunktdaten nach der gleichen Behandlungszeit für alle Proben gesammelt werden können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. florale genetische Screenings, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. welche neuen Faktoren zum vesikulären Transport beitragen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des vesikulären Transports, um Aspekte des Endosomenabbaus sowie einen neu entdeckten Clathrin-unabhängigen und sauren Signalweg in knospenden Hefen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Florent-Ladungen zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen verwenden können.