Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, vesikuläre Transportvorgänge im endozytotischen Signalweg lebender Zellen zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des vesikulären Transports zu beantworten, beispielsweise wie Mutationen oder Veränderungen in der Proteinausprägung die Geschwindigkeit und Effizienz von Transportvorgängen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine direkte Quantifizierung des endozytotischen Transports in lebenden Zellen ermöglicht, indem die Intensität fluoreszenzmarkierter Cargo-Proteine gemessen wird.

Nach der Zubereitung der Lösungen und Medien gemäß dem schriftlichen Protokoll zwei bis drei Kolonien von Hefe-Zellen in fünf Millilitern YNB-Medium, das keine zusätzlichen Nährstoffe zur Aufrechterhaltung der Plasmidselektion enthält, ansäen. Die Kulturen bei 30 Grad Celsius unter Schütteln 16 bis 24 Stunden lang wachsen lassen. Ungefähr drei Stunden vor der Bildaufnahme die OD 600 jeder Übernachtkultur messen.

Danach fünf Milliliter Verdünnungen mit einem OD 600 von 0,35 bis 0,4 im YNB-Medium herstellen, das zusätzliche Nährstoffe für die Plasmidvermehrung fehlt, und drei Stunden bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Während der Inkubation die Umweltkammer des Mikroskops oder den beheizten Objekttisch auf 30 Grad Celsius vorab einstellen. Nachdem eine behandelte achtlochige Glasplatte und Kammerobjektträger gemäß dem schriftlichen Protokoll für die Bildgebung vorbereitet wurden, 200 Mikroliter YNB-Medium, das zusätzliche Nährstoffe für die Plasmidselektion fehlt, in jedes Loch geben.

Wenn die Kulturen bereit sind, überführen Sie ein Milliliter in ein Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren die Zellen bei 8.000 U/min für zwei Minuten. Anschließend entfernen Sie 975 Mikroliter des Überstandes. Resuspendieren Sie das Zellpellet im verbleibenden Überstand.

Gebe dann 2,5 µL der Zellsuspension in die Mitte jedes Wells der Acht-Well-Platte. Pipettiere mehrmals auf und ab, um die Zellen zu verteilen, und lasse die Zellen fünf bis zehn Minuten lang absinken. Platziere die Kammerplatte auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop, das auf 30 Grad Celsius temperiert ist.

Danach mithilfe der Hellfeldbeleuchtung ein Zellfeld suchen. 50 Mikroliter vorgewärmtes YNB-Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Methionin enthält, zu den 200 Mikrolitern Medium in der Vertiefung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm Methionin pro Milliliter zu erreichen. Die Zellen vor Beginn der Bildaufnahme zwei Minuten lang zur Equilibrierung ruhen lassen.

Danach unmittelbar vor der Bildaufnahme das Mikroskop auf die gewünschte Fokusebene einstellen. GFP in Hellfeld- oder DIC-Aufnahmen im Abstand von 5 Minuten über einen Zeitraum von 45 bis 60 Minuten aufnehmen. Dabei identische Aufnahmeparameter für alle Bilder innerhalb einer Zeitspanne verwenden.

Weitere Einzelheiten finden sich im Textprotokoll. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner Zellen zu jedem Zeitpunkt und geben Sie die Werte als Prozentsatz der anfänglichen Intensität des ersten Bildes an. Öffnen Sie nach dem Exportieren der Bilder gemäß dem Textprotokoll in ImageJ die Dateien über die Option „Öffnen“ im Dateimenü.

Verwenden Sie das Fluoreszenzbild zur Quantifizierung und das Hellfeld- oder DIC-Bild als Referenz, um die Position der Zellen zu identifizieren. Schließen Sie tote Zellen aus, sofern vorhanden, die im DIC-Kontrast dunkler erscheinen als lebende Zellen und in der GFP-Kanal-Autofluoreszenz zeigen. Bei Bildern mit ungleichmäßigem Hintergrund wählen Sie im Menü „Process“ den Hintergrundsubtraktionsalgorithmus und die Standardeinstellung.

Nachdem die Bilder aufgenommen wurden, ist es wichtig, vor der Durchführung des Quantifizierungsverfahrens eine Hintergrundsubtraktion durchzuführen. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da das Hintergrundsignal andernfalls Unterschiede zwischen den Proben verdecken oder dämpfen könnte. Umreißen Sie mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug eine Zelle, wobei sichergestellt werden sollte, dass die gesamte Zelle, jedoch so wenig wie möglich der Bereich außerhalb der Zelle, eingeschlossen wird.

Danach im Menü „Analyze“ die Funktion „Set Measurements“ verwenden, um die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert zu messen. Den ROI Manager öffnen, indem man auf „Analyze“ und dann auf „Tools“ klickt. Im Fenster des ROI Managers auf die Schaltfläche „Add“ klicken, um den markierten Bereich als neues ROI hinzuzufügen.

Wiederholen Sie das Umranden und Messen für die verbleibenden Zellen im Bild, wobei tote Zellen oder Zellen, die den Bildrand berühren, ausgeschlossen werden. Speichern Sie die ausgewählten ROIs als Zip-Datei, indem Sie auf den Messen-Button klicken, woraufhin die gemessenen Werte in einem neuen Fenster angezeigt werden. Klicken Sie dann auf den Mehr-Button und exportieren Sie alle Messwerte in eine Tabellenkalkulation oder eine Software zur statistischen Analyse.

Impfen Sie zwei bis drei Kolonien von Hefe-Zellen und 0,5 Milliliter YNB-Medium, das keine zusätzlichen Nährstoffe zur Aufrechterhaltung der Plasmidselektion enthält. Kultivieren Sie die Zellen auf einer Rollkulturanlage bei 30 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Geben Sie ein Milliliter YNB-Medium ohne zusätzliche Nährstoffe für die Plasmidpflege hinzu und kultivieren Sie weitere drei Stunden.

Überführen Sie anschließend ein Milliliter Zellen in jeweils zwei fünf Milliliter fassende Röhrchen mit rundem Boden. Geben Sie dann 0,25 Milliliter YNB Met-Medium in das erste Röhrchen und 0,25 Milliliter YNB-Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Methionin enthält, in das zweite Röhrchen, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Bei einer großen Anzahl von Proben erfolgt die Zugabe von Methionin zeitlich versetzt, um ausreichend Zeit für die Faktenanalyse zu gewährleisten.

Unser Durchflusszytometer kann bis zu 40 Proben pro Durchlauf messen. Wir geben Methionin portionenweise hinzu. Acht Proben alle fünf Minuten.

Dadurch wird sichergestellt, dass alle Proben zwischen 45 und 50 Minuten nach der Zugabe von Methionin gemessen werden. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang. Anschließend analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie, wobei Sie den Vorwärtsstreulicht-Signal (FS) als Maß für die Zellgröße auswählen und eine durchfließende Fluoreszenzintensität aus einem FITC-Filter als Maß für die Aufnahme von Frachtstoffen darstellen.

Während der 45-minütigen Inkubation verwenden Sie die Schieberegler, um die Spannung der FS- und FITC-Kanäle anzupassen, um die Detektion für den Größenbereich und die Fluoreszenzintensität der verwendeten Hefezellen zu optimieren. Messen Sie FS und Fluoreszenzintensität für 10.000 Zellen aus jeder Bedingung. Erzeugen Sie mit der Einstellung für hohe Durchflussgeschwindigkeit durch Klicken auf „Diagramm hinzufügen“ ein Streudiagramm von FS gegen die Fluoreszenzintensität.

Wählen Sie anschließend FITC für die x-Achse und FS für die y-Achse aus und tragen Sie 1000 Messpunkte grafisch dar. Weisen Sie mithilfe der Gate-Funktion und der Wildtyp-Met-Bedingung ein vertikales Gate zu, sodass etwa 5 % der hellsten Zellen rechts des Gatters liegen. Verwenden Sie diese Gating-Einstellung für alle anderen Bedingungen des Experiments.

Wie hier gezeigt, wurde die Zeitrafferaufnahme von Zellen in Fünf-Minuten-Intervallen in Abwesenheit oder Anwesenheit von Methionin durchgeführt, um die Internalisierung von GFP- oder Fluorin-markiertem Mup1 sowie Änderungen der Fluoreszenz zu überwachen. Wie erwartet blieben GFP- und Fluorin-markiertes Mup1 in Abwesenheit von Methionin an der Plasmamembran. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die in Anwesenheit von Methionin aufgenommen wurden, eine fortschreitende Verringerung des fluoreszierenden Signals an der Zelloberfläche, was mit der Internalisierung des Cargos übereinstimmt.

Jedoch waren die Kinetik des Fluoreszenzverlusts in Gegenwart von Methionin bei den Mup1-GFP-Zellen im Vergleich zu den pHlourin-Mup1-Zellen verzögert. Diese Streudiagramme vergleichen die Fluoreszenzintensität von Wildtyp- oder vier Delta-ENTH1-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Methionin nach Anlegen eines vertikalen Tors. 4 % der Wildtyp-Met-Zellen befanden sich auf der rechten Seite des Tors, was den hellsten Zellen der Population entspricht, während 65 % der unbehandelten Wildtyp-Zellen innerhalb des Tors lagen.

Im Gegensatz dazu zeigten die vier Delta-ENTH1-Zellen keinen Unterschied in der Verteilung von hellen und dunklen Zellen, was auf einen Defekt der Endozytose hindeutet. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Startzeiten für gleichzeitige Experimente zu versetzen, damit die Endpunkt-Daten nach derselben Behandlungszeit für alle Proben erhoben werden können.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie genetische Pflanzenanalysen durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche neuartigen Faktoren zum vesikulären Transport beitragen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des vesikulären Transports den Weg, Aspekte des Endosomenverlusts sowie einen neu entdeckten, clathrinunabhängigen und sauren Weg in Hefe zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man Florent-artige Frachtmoleküle verwendet, um endozytotische Vorgänge in lebenden Zellen zu quantifizieren.