Ein Polyanilin basierenden Sensor von Nucleic Acids

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese von wasserdispergiertem Polyanilin, das zum markierungsfreien Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden könnte. Diese Technik ist eine kostengünstige Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren. Labore, die es einsetzen, werden es einfach, robust und empfindlich finden.

Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie markierungsfrei ist und zum direkten Nachweis von RNAs und DNAs verwendet werden kann, ohne dass eine enzymatische Manipulation erforderlich ist. Diese Technik hat Potenzial für neue diagnostische Technologien, und da sie kein Etikett verwendet, kann sie mit wenig Manipulation für die Verarbeitung von Patientenproben verwendet werden. Die visuelle Demonstration hilft, den Sensor zu entmystifizieren.

Diese Plattform umfasst Polymerwissenschaft und Biologie, die sehr exotisch erscheinen, aber in Wirklichkeit außerordentlich einfach zu implementieren sind. Anilin wird in 60 ml Chloroform in einem 250-ml-Rundkolben vollständig gelöst. Nach fünf Minuten Rühren bei 600 U/min mit Eis auf null bis fünf Grad Celsius abkühlen lassen.

Dies dauert in der Regel 15 bis 20 Minuten. Geben Sie anschließend Natriumdodecylbenzolsulfonat in einem Rundkolben unter Rühren bei 600 U/min zur Anilinlösung. Ammoniumpersulfat in 20 ml Wasser auflösen und über 30 Minuten tropfenweise hinzufügen, um eine Überhitzung der Reaktion zu vermeiden.

Führen Sie die Reaktion 24 Stunden lang bei null bis fünf Grad Celsius durch. Beobachten Sie, wie sich das Reaktionsgemisch zunächst nach 15 Minuten, dann nach zwei Stunden dunkelbraun und schließlich nach 24 Stunden dunkelgrün verfärbt. Lassen Sie es dann weitere 24 Stunden auf Raumtemperatur kommen.

Filtrieren Sie die PANI-Natriumdodecylbenzolsulfonatlösung mit einem Buchner-Trichter. Mischen Sie das Filtrat mit 80 ml Chloroform und 120 ml Wasser in einem Trenntrichter. Inkubieren Sie die Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur, dann sammeln Sie das dunkelgrüne PANI aus dem Trenntrichter, wobei nicht umgesetztes Natriumdodecylbenzolsulfonat und APS im wässrigen Überstand verbleiben.

PANI-Lösung 10-mal mit Chloroformwasser verdünnen, dann 200 Mikroliter verdünntes PANI mit 6,4 Mikromol DNA-Oligonukleotiden der Sonde mischen, indem 15 Minuten lang in einem Mikrofugenröhrchen sanft geschaukelt wird. Bestrahlen Sie die PANI-DNA-Lösung zwei Minuten lang mit 1200 Mikrojoule pro Quadratzentimeter UV in einem Vernetzer. Es ist wichtig, dass die UV-Exposition auf die angegebene Menge begrenzt wird.

Eine längere UV-Exposition beeinträchtigt die Fluoreszenzänderung in PANI, wahrscheinlich aufgrund eines kovalenten Kreuzlecks von PANI und DNA. Pellet-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 x g für sechs Minuten und Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Nach dem zweiten Pelletieren in PBS resuspendieren.

Fügen Sie acht Mikroliter mit 100 Mikromolern komplementären DNA-Oligonukleotiden oder Zielnukleinsäuren zu 200 Mikrolitern PANI-Sondenkomplexen hinzu. Führen Sie die Hybridisierung durch, indem Sie die Lösungsmischung 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius schaukeln. Nach dem Pelletieren der PANI-Komplexe durch Zentrifugation bei 17.000 x g für sechs Minuten mit PBS waschen und in Wasser resuspendieren.

Geben Sie PANI aus verschiedenen Behandlungen in eine 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Emissionsfluoreszenz im Bereich von 270 bis 850 Nanometern durch Anregung bei 250 Nanometern. Ein Emissionspeak für PANI sollte bei etwa 500 Nanometern beobachtet werden. Um eine fluoreszenzmikroskopische Messung des hyberdisierten Duplex durchzuführen, lassen Sie PANI auf einen Deckglas tropfen und trocknen Sie es 48 Stunden lang bei 40 Grad Celsius.

Geben Sie acht Mikroliter einer 100-Mikromoler-Sonde auf einen getrockneten PANI-Film und bestrahlen Sie ihn zwei Minuten lang mit UV-Licht. Waschen Sie die PANI-Sondenfolie nach der Bestrahlung mit PBS und trocknen Sie sie 48 Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Führen Sie eine Hybridisierung für 15 Minuten durch, indem Sie Zielnukleinsäuren hinzufügen.

Dabei kann es sich um eine biologische Probe oder ein kontrolliertes Ziel-Oligonukleotid handeln. Anschließend eine PBS-Wäsche auftragen. Erhalten Sie die Fluoreszenzbilder bei 40-facher Vergrößerung mit einem 500-Nanometer-Langpassfilter.

Hier ist die elektrostatische Wechselwirkung von PANI und DNA-Sonden dargestellt, die durch UV-Bestrahlung verstärkt wird. Die Hybridisierung der Zielnukleinsäure löst die Duplexbildung aus, wodurch sich die strukturelle Bestätigung ändert, was zu einer Dissoziation des Sondenziels von der PANI-Oberfläche führt. Diese Abbildung zeigt die Änderung der PANI-Fluoreszenz in Abwesenheit oder Anwesenheit einer Sonde, sowohl in der Lösung als auch im festen Beschichtungsmedium.

Die Zunahme der Fluoreszenz ist auf den Elektronenfluss von negativ geladener DNA zurückzuführen, der die Elektronendichte des Polymers erhöht. Bei der Hybridisierung von komplementären Ziel-Oligonukleotiden lösen sich die Sonden ab, was zur Wiederherstellung der Basilikumfluoreszenz führt. Umgekehrt führt die Hybridisierung mit einzelnen unpassenden Zieloligonukleotiden nicht zu dieser Wiederherstellung der Basilikumfluoreszenz

Die wichtigste Neuerung dieser Technik besteht darin, dass sie mildes UV für eine exakte Wechselwirkung verwendet, was ihr tatsächlich hilft, unspezifische und leichte Wechselwirkung zu unterscheiden. Einmal gemeistert, kann diese Technik bis zu zwei Stunden dauern, ohne die Sinneszeit und die Trocknungszeit der Beschichtungen. Beim Ausprobieren dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich die DNA in Wasser auflöst und der saure Tee tatsächlich die elektronische Eigenschaft des PANI verändert.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten die Zuschauer ein gutes Verständnis dafür haben, wie man wasserdispergiertes Polyanilin synthetisiert und seine fluoreszierenden Eigenschaften zum Nachweis von Nukleinsäuren nutzt. Sie werden in der Lage sein, Sonden-DNAs zu immobilisieren und Hybridisierungen durchzuführen, um Ziele zu erkennen. Bei der Arbeit mit dem Monomer ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Synthese gefährlich ist und in einer Haube mit Schutzausrüstung wie Schutzbrille, Handschuhen und Laborkitteln durchgeführt werden sollte.