Name: Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Aktivierung muriner Lymphozyten mit magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Aufreinigung von B- und T-Zellen mit minimaler Manipulation für funktionelle in-vitro- und in-vivo-Analysen.

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Die Studie wird durch das Ministerium für Bildung, Singapur (ACRF Tier1-RG40 / 13 und Tier2-MOE2013-T2-2-038) unterstützt. Das Manuskript wurde von Amy Sullivan aus Obrizus Kommunikation bearbeitet.

Alle Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen und alle Maus-Protokolle werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee geführt gehalten. 1. Herstellung von Puffer und Reagenzien <ol><li> Bereiten vollständige Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium (10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 IU / ml) / Streptomycin (100 ug / ml), 55 uM 2-Mercaptoethanol ). </li><li> Bereiten Sie 20x Balanced Salt Solution (BSS) Lager 1 und Lager 2, getrennt. <ol><li> Bereiten Sie 20x BSS Lager 1 (111 mM Dextrose, 8,8 mM Kaliumphosphat, 26,7 mM Dinatriumhydrogenphosphat in 1 l sterilem Wasser) und 40 ml 0,5% Phenolrot bis 20x BSS Lager 1 vor Endvolumeneinstellung. Sterilfilter unter Verwendung von 0,2-um-Filter, bevor bei 4 ° C lagern. </li><li> Bereiten Sie 20x BSS Lager 2 (25,8 mM Calciumchloriddihydrat, 107 mM Kaliumchlorid, 2,73 M Natrium chloride, 19,6 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 16,6 mM Magnesiumsulfat in 1 l sterilem Wasser). Sterilfilter unter Verwendung von 0,2-um-Filter, bevor bei 4 ° C lagern. </li><li> 1x BSS für den experimentellen Einsatz, verdünnen 50 ml BSS Lager 1 und 50 ml BSS Lager 2, getrennt, in 400 ml sterilem Wasser je vorzubereiten. Kombinieren Sie beide verdünnten Lösungen, passen auf pH 7 und 20 ml FBS (2%). Top bis zu 1 L mit sterilem Wasser und Sterilfilter mit 0,2 um Filter. HINWEIS: BSS Stammlösungen separat hergestellt werden sollte, weil die Mischung von konzentrierter BSS Aktien direkt in Ausfällen führen kann. </li></ol></li><li> Rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer <ol><li> RBC Lysispuffer, mischen 9 Teile Lager Ammoniumchlorid (155 mM Ammoniumchlorid in sterilem Wasser) zu 1 Teil Lager Tris-Base (130 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan in sterilem Wasser, pH-Wert 7,65) vor dem Gebrauch zu bereiten. HINWEIS: Shop sterilen Stammlösungen von Ammoniumchlorid und Tris-Base bei 4 ° C. Bereiten Sie die Lyse bUffer frisch effiziente Lyse von roten Blutkörperchen zu gewährleisten. </li></ol></li></ol> 2. Erzeugung von Lymphozytensuspension aus Milz oder Lymphknoten Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Reagenzien und Geräte für das Experiment vor Maus Euthanasie und zur Erzeugung Einzelzellsuspensionen von Lymphozyten so schnell wie möglich zu halten hohe Zellviabilitäten erforderlich vorzubereiten. <ol><li> Euthanize experimentellen Maus durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken. HINWEIS: Von diesem Schritt an gelten alle experimentellen Verfahren unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden sollte. </li><li> Tauchen Sie die gesamte Maus in 70% Ethanol, bevor irgendwelche Schnitte zu machen. Entfernen Sie die Milz und Lymphknoten aseptisch 8, und legen Sie sie in einem separaten 15 - ml - Röhrchen , die 5 ml eiskaltem RPMI / FBS (RPMI mit 2% FBS) oder BSS / FBS (aus Schritt 1.2.3). HINWEIS: Da BSS effiziente RBC-Lyse verhindert, verwenden RPMI für die Herstellung der Milz- Zellsuspension und wechseln Sie zu BSS nacr RBC-Lyse. </li><li> Um eine einzelne Zellsuspension aus der Milz oder Lymphknoten, legen Sie das Organ (e) zwischen zwei Stücken von sterilen 100 &amp; mgr; m Zellsieb mesh in einer Petrischale mit 2 ml eiskaltem RPMI / FBS oder BSS / FBS erzeugen. Mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze, zerdrücken die Orgel (n), bis er in sehr feine Teile zerrissen wurde. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und waschen Sie die Zelle Sieb mit eiskaltem RPMI / FBS oder BSS / FBS Netz. Sammeln Sie die restlichen Zellsuspension, fügen Sie ihn auf den gleichen 15-ml-Tube und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. HINWEIS: Die pelletierten Zellen erneut zu suspendieren, indem das Rohr mit den Fingern Ausklopfen vor RBC-Lyse Puffer oder Medium in den nachfolgenden Schritten hinzugefügt wird. </li><li> Vorbereitung Raumtemperatur (RT) RBC-Lyse-Puffer während der Zentrifugation der Zellsuspension (siehe Schritt 1.3.). Nachdem die Zellen pelletiert und Entfernen des Überstands, resuspendieren der Zellen mit 1 ml Puffer RBC - Lyse je 10 8 Zellen. Incubate die Lysereaktion bei RT für 3-4 min. </li><li> Stopp RBC Lyse mit 14 ml eiskaltem BSS / FBS und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. </li></ol> 3. Reinigung von B und T-Zellen <ol><li> Reinigung von B-Zellen <ol><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Re-suspendieren bis zu 10 8 Milzzellen in 300 &amp; mgr; l BSS / FBS und 50 &amp; mgr; l anti-CD43 9,10 magnetischen Mikrokügelchen hinzuzufügen. Zum Entfernen von toten Zellen, fügen Sie 30 ul Annexin V magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Zellsuspension in einem 4 ° C Kühlschrank für 30 min. </li></ol></li><li> Reinigung von T-Zellen <ol><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Re-suspendieren bis zu 10 8 Zellen in nicht-T - Zell - Depletion - Antikörper - Cocktail (biotinylierter Antikörper gegen CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 und CD4 oder CD8 abhängig von der Zielzellpopulation gereinigt werden), 1: 200 verdünnt in 200 &amp; mgr; l BSS / FBS 4,5. Inkubieren der Zellsuspension in ein4 ° C Kühlschrank für 15 min. </li><li> Nach der Inkubation, 10 ml BSS / FBS die Zellen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in 165 &amp; mgr; l BSS / FBS mit 30 &amp; mgr; l Streptavidin-Mikrokügelchen und 15 &amp; mgr; l Annexin V magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Zellsuspension in einem 4 ° C Kühlschrank für 30 min. HINWEIS: Um sicherzustellen, dass auch mit den magnetischen Mikrokügelchen Markierung, die Zellen mit Microbeads für 15 min inkubieren, dann die Zellsuspension vorsichtig mischen, indem die 15-ml-Röhrchen klopfen und weitere 15 min bei Schritt 3.1.1 inkubiert. oder 3.2.2. </li></ol></li><li> Herstellung von Trennsäule für Zellreinigung <ol><li> Bereiten Sie eine nicht verwendete Trennsäule während Mikrobead Markierung der Zellen (Schritt 3.1.1. Oder 3.2.2.). Vorwärmen BSS (ohne FBS) auf RT und verwenden 2 ml die Säule aseptisch zu waschen und ins Gleichgewicht. Nach Äquilibrierung mit BSS sollte die gewaschene Säule nicht austrocknen gelassen werden. HINWEIS: Wir verwenden die LS cPALTE anstelle der Spalte empfohlen LD aufgrund seiner Wiederverwendbarkeit (siehe Schritt 3.4.). </li><li> Nach der Markierung mit den magnetischen Kügelchen, fügen Sie 14 ml BSS / FBS die Zellen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und erneut die Zellen in 1-3 ml RT BSS. </li><li> Befestigen eines sterilen 21 G Nadel an der Spitze der Säule, die Durchflussrate während des Prozesses der Reinigung zu reduzieren. Laden die Zellsuspension auf die äquilibrierte Säule und Sammeln des Durchflusses durch die gereinigten Zielzellen enthält. HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen in die Spalte während des Ladens einzuführen. </li><li> Die Säule wird einmal mit 1 ml BSS / FBS und sammle die Strömung durch die gereinigten Zielzellen enthält. Neuladen der Säule mit dem Fluss durch wieder. Sammeln Sie die Strömung durch nach dem zweiten Laden in der gleichen 15-ml-Tube. </li><li> Die Säule wird 3-mal mit 1 ml BSS / FBS und sammeln die Strömung durch die gereinigten Zielzellen enthält. Danach werden 5 ml BSS / FBS zu the-Säule und mit einem Kolben, spülen Sie die magnetisch markierten Zellen aus der Säule in ein neues 15-ml-Tube. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der durch Strömungs gesammelten Zellen Zytometrie unter Verwendung von Antikörpern , die Antigene binden , 4,5 gereinigtes B oder T - Zellen an die Oberfläche. </li></ol></li><li> Die Wiederverwendung von der Trennsäule HINWEIS: Die LS Spalte bis 4 Mal wiederverwendet werden kann, ohne Reinigungswirkungsgrad zu beeinträchtigen. <ol><li> Die Säule wird 3-mal mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 3-mal mit 5 ml destilliertem Wasser von oben den Kolben verwendet wird. </li><li> Die Säule wird mit 5 ml 70% Ethanol und trocknet die Säule ausgiebig einen Lufthahn mit dem Aufbau von Rost in der Säule zu verhindern. </li><li> Um eine gebrauchte LS-Säule für eine separate Reinigung Experiment vorzubereiten, waschen Sie die Säule von unten nach oben mit 5 ml 70% Ethanol mit dem Spritzenadapter. Als nächstes waschen Sie die Spalte von unten einmal von der Spitze der Säule mit 5 ml PBS zweimal mit 5 ml sterilem PBS, gefolgt. In 2ml RT BSS die Säule und dann fahren Sie mit dem Laden der Säule mit markierten Zellen zu äquilibrieren. </li></ol></li></ol> 4. CFSE Labeling und Stimulation HINWEIS: Gereinigte Zellen können auf eine Vielzahl von in vitro und in vivo funktionellen Assays unterzogen werden. Hier verwenden wir gereinigten T - Zellen , die T - Zell - Stimulation Fähigkeit von APCs 5 zu bestimmen. <ol><li> Vorwärmen Markierungslösung (0,1% FBS in PBS) auf 37 ° C vor der CFSE Belastung. HINWEIS: einen geringen Prozentsatz an FBS in PBS Verwendung reduziert Zelltod während CFSE Laden und minimiert Zellverlust während der Zentrifugation. Doch zu viel FBS kann mit CFSE Laden stören. </li><li> Bei 2 x 10 7 Zellen / ml in vorgewärmten Markierungslösung in einem Rohr 15 ml Waschen gereinigt Zellen zweimal mit Markierungslösung, dann wieder suspendiert. </li><li> Bereiten Sie 10 &amp; mgr; M CFSE-Lösung (1: 500 Verdünnung von 5 mM CFSE Stammlösung) in vorgewärmten Markierungslösung. CFSE Lösung solltewerden jeweils frisch zu erreichen optimale Kennzeichnung vorbereitet. </li><li> Um Zellen mit CFSE laden, fügen 1 Teil Zellsuspension zu 1 Teil 10 &amp; mgr; M CFSE-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen und Inkubation im Dunkeln für 10 min bei 37 ° C. Eine Endkonzentration von 5 &amp; mgr; M CFSE verwendet ml zu etikettieren 1 x 10 7 Zellen /. </li><li> Drehen Sie das Röhrchen alle 2 Minuten eine homogene Mischung von Zellen während der CFSE Belastung zu gewährleisten. </li><li> Um die Reaktion zu stoppen, mehrere Bände eiskaltem komplettem RPMI Medium hinzufügen und Spin-down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Nach dem erfolgreichen CFSE Laden wird das Zellpellet gelblich erscheinen. </li><li> Wash CFSE Zellen ein weiteres Mal mit eiskaltem kompletten RPMI - Medium und Spin - down bei 453 × g für 5 Minuten bei 4 ° C geladen , bevor sie für in - vitro - Kultivierung oder in vivo Stimulation verwendet wird . </li></ol> 5. In - vitro - Stimulation <ol><li> Bereiten Sie eine 2x-Stammlösung von Reizen (2x Stimuli Stammlösung) unmittelbar vor der Anwendung, so dass 100 &amp; mgr; l 2x Stimuli Stammlösung kann in einer 96-Well-Platte zu 100 ul Zellen zu einem Endvolumen von 200 &amp; mgr; l pro Vertiefung zugegeben werden. </li><li> Wenn eine Platte mit Stimuli (IgM oder CD40 für B-Zellen oder CD3 und CD28 für T-Zellen), aufgetragen erforderlich ist, verdünnt die Stimuli in PBS und pre-coat der Kulturplatte bei 4 ° C über Nacht. Alternativ kann der Kulturplatte bei 37 ° C für 1 Stunde am Tag des Versuchs überzogen werden. Waschen Sie die beschichtete Platte zweimal mit PBS (Nicht in die Platte zu jeder Zeit zu trocknen). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Für B - Zellen </td><td></td></tr><tr><td> Stimuli </td><td> Die Endkonzentration </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 Ziegen-anti-Maus-IgM </td><td> 0,6-2,4 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD40 mAb </td><td> 0,5-2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> RekombinanteMaus-IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td rowspan="2"> 0,1-10 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> (LPS) aus E. coli Serotyp 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Für T - Zellen </td><td></td></tr><tr><td> Stimuli </td><td> Die Endkonzentration </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (Platte beschichtet) </td><td> 2-10 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> (50 &amp; mgr; l / Vertiefung für die Beschichtung) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (Platte beschichtet) </td><td> 2 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td> Rekombinantes IL-2 </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (Phorbol ester) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (Calciumionophor) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Die Konzentrationen von Stimuli Lymphozyten in in - vitro - Kultur zu stimulieren.<ol start="3"><li> Für CFSE-markierten B - Zellen, resuspendieren bis 3 x 10 6 Zellen / ml in komplettem RPMI - Medium und der Kultur in dreifacher Ausfertigung mit 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 96-well - Flachbodenplatten für 72 Stunden. </li><li> Für CFSE-markierten T - Zellen, resuspendieren zu 0,5-3 x 10 6 Zellen / ml in komplettem RPMI - Medium und der Kultur in dreifacher Ausführung mit 0,5-3 x 10 5 Zellen / Well in 96-Well - Rundbodenplatten für 48 oder 72 Std . </li></ol> 6. In - vivo - Stimulation <ol><li> Für in vivo Stimulation, adoptiv Übertragungs 4 x 10 6 CFSE-markierten T - Zellen pro Maus (intravenös (iv) in 200 &amp; mgr; l PBS) in jedes MHC-angepaßten Empfängermaus. HINWEIS: In diesem Protokoll CFSE-markierten T-Zellen adoptiv übertragen werden können Schwanzvene oder retroorbitale Injektions da diese Zellen verwendet werden Hause Organe wie die Milz und Lymphknoten lymphoiden. </li><li> Fordern Sie die Empfängermäuse 1 Tag später mit dem Antigen. HINWEIS:In diesem Beispiel verwenden wir Ovalbumin (OVA-Protein, 50 &amp; mgr; g / Maus) als Antigen weil OVA-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) -transgene T-Zellen adoptiv in Empfängermäuse transferiert. Bereiten Sie OVA Protein in sterilem PBS und injizieren 100 ul OVA Protein / PBS oder PBS - Kontrolle wird über eine subkutane Injektion (si), in jede Empfängermaus 5. </li><li> Ernte und Einzelzellsuspensionen aus lymphatischen Organen (Lymphknoten und Milz) erzeugen von Empfängermäuse 3 Tage nach der Immunisierung mit OVA-Protein oder PBS. Separate Lymphknoten in proximal-Lymphknoten (PLN), die Achsel umfasst, brachialis und oberflächlicher Lymphknoten) und distale Lymphknoten (dLN), die mesenterischen umfasst, popliteal, inguinal, Lenden- und caudal Lymphknoten. Stain Zellen die entsprechenden FACS unter Verwendung von Antikörpern für T-Zellproliferation zu überprüfen. HINWEIS: In diesem CFSE Zelle Tracking-Experiment, CFSE-markierten T-Zellen von PBS-injizierten Kontrollmäusen eine Fluoreszenzbasis für Nicht-di etablierenViding Zellen. Zellteilungen von proliferierenden, Antigen-stimulierten, CFSE-markierten Zellen werden durch Messen Fluoreszenzpeaks 12,13 visualisiert. Mit der PBS - Kontrolle, die Anzahl der Zellteilungen von proliferierenden, CFSE-markierten T - Zellen können 12,13 bestimmt werden. </li><li> Analyse der CFSE-markierten Zellproliferationsdaten durch die Anzahl der Zellteilungen zu vergleichen oder Spitzen zwischen den Proben (1 und 2). HINWEIS: Zum Beispiel CFSE-markierte, OVA-spezifischen T - Zellen adoptiv Empfängermäuse übertragen in das OVA - Antigen empfangen wird aktiv proliferieren im Vergleich zu den PBS-injizierten Kontrollmäusen 5,12. Darüber hinaus ist es bemerkenswert , darauf hinweisen , dass es viele Wege gibt CFSE Zellproliferationsdaten zu analysieren, wie 14 von Hawkins und Kollegen gezeigt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Lymphozyten aus lymphoiden Organen zu reinigen. Zellreinigung magnetischen Kügelchen Sortieranlage verwendet, ist eine schnelle und einfache Methode, die lebensfähige, hochgereinigten Zielzellen ergibt. Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellausbeute Die Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von hämatopoetischen...

Reife Lymphozyten existieren im Allgemeinen im Ruhezustand, wenn bei dem Individuum keine vorbestehende Infektion oder Entzündung vorliegt. Daher ist es wichtig, den naiven Status der Lymphozyten während des Isolierungsprozesses beizubehalten, bevor in vitro oder in vivo funktionelle Assays durchgeführt werden. Der Schlüssel zur Gewährleistung konsistenter und reproduzierbarer Ergebnisse besteht darin, unnötige Manipulationen an den Zellen zu begrenzen. 
Bei der magnetischen Zellsortierung werden Antikörper und Mikrokügelchen verwendet, um Zellen zu markieren und so die interessierende Zellpopulation anzureichern. Bei diesem Ansatz gibt es zwei Reinigungsstrategien: positive Anreicherung und negative Erschöpfung. Bei der positiven Anreicherung wird die interessierende Zellpopulation mit einem Antikörper angereichert, der an die Zielzellen bindet. Bei der negativen Depletion hingegen werden Nicht-Zielzellen depletiert, so dass die Zellpopulation von Interesse bleibt. In unserem Labor bevorzugen wir die negative Depletion gegenüber der positiven Anreicherung, da die Bindung von Antikörpern an die Zielzellen möglicherweise die Zelleigenschaften und das Verhalten verändern könnte. Tatsächlich sind viele etablierte Zelloberflächenmarker, die sich für die Isolierung einer bestimmten Zellpopulation eignen, auch funktionelle Rezeptoren. 
Die magnetische Zellsortierung liefert nicht nur hochreine Populationen lebensfähiger Zielzellen, sie ist auch weniger zeitaufwändig und vermeidet den zellulären Stress, der durch die Hochdruckströmung induziert wird, die bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) verwendet wird. Durch die Markierung der unerwünschten Zellpopulationen und deren Depletion mit einer magnetischen Trennsäule sind wir in der Lage, eine schnelle Zellisolierung durchzuführen, ohne die Lebensfähigkeit der Zielzellpopulation zu beeinträchtigen. In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung negativer Depletionsstrategien zur Aufreinigung naiver B-Zellen oder T-Zellen.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (ohne L-Glutamin)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td></td><td></td><td>Hitzeinaktiviert&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43 magnetische Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Gut mischen vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Streptavidin Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td> Gut <td>mischen vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Anti-Annexin V Magnetkügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Vor Gebrauch</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td> gut mischen<td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Sterilkulturplatte mit U-Boden</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Sterilkulturplatte mit F-Boden</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m cell Siebnetz</td><td></td><td></td><td>Zur Sterilisation mit UV-Strahlung vor Gebrauch</td></tr><tr><td>0,2 &mu; M&nbsp; sterile Einwegfiltereinheiten</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Kann durch jedes sterile Filtergerät</td></tr><tr><td>ersetzt werden CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV, kurz; Alternative zu CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY, kurz; Alternative zu CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR, kurz; Alternative zu CFSE</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>CPD670 kurz; Alternative zu CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, Alternative zu CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Kann aus anderen Quellen verwendet</td></tr><tr><td>werden Magnesiumchloridhexahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma Aldbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>(5-(und 6-)-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>C-1157</td><td>Rekonstitution in DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutyrat (PBDU, Phorbolester)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Calciumionophor)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Antikörper und rekombinantes Protein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b Biotin (Klon m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>CD11c-Biotin (Klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>Gr-1 Biotin (Klon RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>Ter119 Biotin (Klon Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>TCR-& gamma; &Delta; Biotin (Klon GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>CD19 Biotin (Klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>B220 Biotin (Klon RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>CD49b Biotin (Klon DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>CD4 Biotin (Klon GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>CD8-Biotin (Klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T-Zell-Depletionscocktail</td></tr><tr><td>F(ab')2 Anti-Maus-IgM für Ziegen (plattenbeschichtet)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &Mikro; l/Well zum Beschichten (96 Well)</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD40 mAb (plattenbeschichtet)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 &micro; l/Well für die Beschichtung (96 Well)</td></tr><tr><td>Rekombinant IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS aus E. coli Serotyp 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (Klonklon OKT3) (plattenbeschichtet)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &micro; l/Well für die Beschichtung (96 Well)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (Klonklon 37.51) (plattenbeschichtet)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 &Mikro; l/well zum Beschichten (96-well)</td></tr><tr><td>Rekombinant IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Hühnereiweiß, Ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und aktivierung von murinen lymphozyten

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B- und T-Zellen haben mit ihrem extrem vielfältigen Antigen-Rezeptor-Repertoire die Fähigkeit, spezifische Immunantworten gegen fast jeden eindringenden Krankheitserreger zu starten1,2. Verständlicherweise werden solche komplexen Fähigkeiten von einer großen Anzahl von Molekülen gesteuert, die an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind, um eine rechtzeitige und räumlich regulierte Immunantwort zu gewährleisten3. Hier beschreiben wir experimentelle Verfahren, die eine schnelle Isolierung von hochreinen murinen Lymphozyten mittels magnetischer Zellsortiertechnologie ermöglichen. Die resultierenden gereinigten Lymphozyten können dann verschiedenen in vitro oder in vivo funktionellen Assays unterzogen werden, wie z. B. der Bestimmung der Lymphozytensignalkapazität nach Stimulation durch Immunblotting4 und der Untersuchung der proliferativen Fähigkeiten durch3-H-Thymidin-Inkorporation oder Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFSE)-Markierung5-7. Neben dem Vergleich der funktionellen Fähigkeiten von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten können wir auch die T-Zell-Stimulationskapazität von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) in vivo bestimmen, wie unsere repräsentativen Ergebnisse an transplantierten CFSE-markierten OT-I-T-Zellen zeigen.

Magnetzellreinigung von Lymphozyten erlaubt Benutzern, eine Zielzellpopulation in einer relativ kurzen Zeit zu reinigen. Mit unserem Verarmungs Protokoll konnten wir den Prozentsatz der CD8-T-Zellen (OT-I in Rekombinations-aktivierendes Gen-1 (RAG-1) -defiziente Mäuse) von 72,8% (vor Reinigung) auf 94,2% (nach der Reinigung zu erhöhen; 1A) 4,5. Diese gereinigten Lymphozyten können dann für die nachfolgende funktionelle Assays verwendet werden , um die Lymphozy...

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die funktionellen Kapazitäten gereinigter muriner Lymphozyten mittels verschiedener in-vitro- und in-vivo-Funktionsassays zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Immunologie und Molekularbiologie zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung der Funktion eines Proteins von Interesse in genveränderten Lymphozyten.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, Lymphozyten schnell zu reinigen, wobei Manipulationen und Umweltstress minimal gehalten werden. Zum Reinigen der B-Zellen resuspendieren Sie bis zu 1 × 10⁸ lysierte Ganzmilzzellen pro rote Blutkörperchen in 300 µL einer mit FBS angereicherten Pufferlösung (BSS). Anschließend geben Sie 50 µL anti-CD43-magnetische Mikroperlen hinzu.Um die toten Zellen zu entfernen, geben Sie 30 Mikroliter Annexin-V-magnetische Mikrokügelchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius hinzu. Schütteln Sie die Zellsuspension alle 15 Minuten leicht, um eine gleichmäßige Markierung der Zellen sicherzustellen. Am Ende der Inkubation wurden die markierten Zellen mit 14 Millilitern BSS, ergänzt mit FBS, gewaschen.Nach der Zentrifugation das Überstand ent

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen...

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Lernen Sie die Isolation und Aktivierung muriner Lymphozyten mit magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Aufreinigung von B- und T-Zellen mit minimaler Manipulation für funktionelle in-vitro- und in-vivo-Analysen.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

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