Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie
18. Oktober 2016
Diese Handschrift beschreibt ein detailliertes Protokoll für phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren durch Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können auch für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellsortierung, Genexpressionsanalyse oder funktionelle Untersuchungen, wodurch die in dem experimentellen Modell erhaltenen Informationen zu erhöhen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, residente Makrophagen aus Rattennieren mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann eine Schlüsselfrage in der Fließfähigkeit beantworten, z. B. was ist der Beitrag jedes Makraphagen des Typs bei Nierenschäden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Nierenkatheterisierung von unterschiedlichen Proteinmarkern ermöglicht. Elena Olivares, A.P.A.S.D.-Studentin von der Complutense Universität, und Melania Guerrero, A.P.A.S.D.-Studentin von der Universität Complutense, schränken somit die zelluläre Integrität ein. Für die Nierenperfusion und -extraktion beginnen Sie damit, eine kleine Hautfalte zu kneifen, um zu bestätigen, dass die Ratte den entsprechenden Sedierungsgrad erreicht hat. Und bedecken Sie die Augen mit Vet Salbe. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einen Operationstisch. Und tränken Sie den Bauch mit 70%Ethanol. Machen Sie dann einen zentralen Schnitt durch die Bauchhaut und das Bauchfell vom Schambein bis zum Brustkorb, um die Pleura- und Bauchhöhle freizulegen. Verwenden Sie das Perfusionssystem, um 0,9%ige Kochsalzlösung in die Bauchaorta zu injizieren, um die Nieren zu spülen. Durchtrennen der Aorta am Bauch, um das Blut abzulassen. Wenn das gesamte Blut aus den Nieren entnommen wurde, durchtrennen Sie den Nierenhilum. Drücken Sie dann auf den Rand jeder Niere, um die Organe vorsichtig zu entkapseln. Und überführen Sie die extrahierten Nieren in frische H.B.S.S.To erzeugen Sie eine einzelne Nierenzellsuspension, schneiden Sie mit einer Schere die Hälfte einer Niere in kleine Fragmente. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein 1,5-ml-Röhrchen und geben Sie 1 ml frisch zubereitete Kollagenase in das Röhrchen für eine 30-minütige Inkubation bei 37
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur phänotypischen und quantitativen Analyse ortsständiger Makrophagen aus Ratten-Nieren mittels Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können für verschiedene Anwendungen genutzt werden und erweitern so die gewonnenen Informationen im experimentellen Modell.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Phagozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Nierenfunktion und Nierenerkrankungen.
- Mittels Durchflusszytometrie ist eine detaillierte Analyse von Zellpopulationen möglich.
- Das Verständnis des Phagozytenverhaltens kann therapeutische Strategien unterstützen.
- Rattenmodelle werden häufig zur Untersuchung der Nierenfunktion verwendet.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Isolierung und Analyse von Nierenmakrophagen.
- Unterstützung weiterer Forschungsarbeiten zu Makrophagenfunktionen in renalen Kontexten.
- Bereitstellung einer Ressource für Forschende in verwandten Fachgebieten.
Verwendete Methoden
- Durchflusszytometrie zur Zellanalyse.
- Färbetechniken zur Identifizierung von Makrophagen.
- Protokolle für die Zellsortierung und Genexpressionsanalyse.
- Funktionelle Untersuchungen zur Beurteilung der Makrophagenaktivität.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung ortsständiger Makrophagen aus Ratten-Nieren.
- Detaillierte Charakterisierung von Makrophagen-Phänotypen.
- Mögliche Anwendungen in Genexpressions- und Funktionsstudien.
- Verbessertes Verständnis der Rolle von Makrophagen für die Nierenfunktion.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Analyse von Makrophagen.
- Die Ergebnisse können zukünftige Studien zu Nierenerkrankungen beeinflussen.
- Die Forschung kann auf andere Anwendungen jenseits der Durchflusszytometrie erweitert werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue phänotypische Charakterisierung von Makrophagen-Subpopulationen in Nierenerkrankungsmodellen ist entscheidend, um die Zielvalidierung bei entzündungsbedingten Nierenerkrankungen abzusichern. Dieses Durchflusszytometrie-Protokoll ermöglicht die quantitative Unterscheidung proinflammatorischer (M1) und immunregulatorischer (M2) Makrophagenphänotypen in der Ratte, wodurch Einblicke in die Mechanismen von Fibrose und immunologischer Modulation gewonnen werden. Durch die Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Beurteilung des Makrophagenanteils an Nierenschädigungen stärkt dieser Ansatz das Vorhersagevermögen bei der präklinischen Zielidentifizierung und der Analyse von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der M1/M2-Makrophagen-Verhältnisse in Modellen der Nierenverletzung.
- Operativer Wert: Nutzt eine doppelte CD45/CD68-Gating-Strategie mit Oberflächenanfärbung gegen CD86/CD163, um Makrophagen-Phänotypen mit hoher Spezifität zu definieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Risikominimierung von Zielstrukturen, indem Makrophagen-Polarisationszustände mit Fibrose- und immunregulatorischen Signalwegen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Durchflusszytometrie-Auswertungen zur Bestimmung der Makrophagenhäufigkeit und Markerexpression.
- Reproduzierbarkeit: Zeigt geringe Zellsterblichkeit und erhaltene Integrität, wodurch konsistente phänotypische Ergebnisse über verschiedene Experimente hinweg ermöglicht werden.
- Weiterverwendbarkeit: Die isolierten Makrophagen verbleiben lebensfähig für Zellsortierung sowie mRNA- und Proteinanalysen und unterstützen damit Multi-Omics-Analysen in nachfolgenden Untersuchungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Direkt anwendbar auf Modelle entzündlicher Nierenerkrankungen, bei denen Makrophagen-Phänotypen die Pathogenese antreiben.
- Übertragbarkeit: Phänotypische Daten aus sortierten Makrophagen können die Entdeckung von Biomarkern und die funktionelle Validierung in präklinischen Studien unterstützen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht die objektive Beurteilung der Wirkung immunmodulatorischer Substanzen auf die Makrophagen-Polarisierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Evaluation ein und liefert immunologische Endpunkte, die die Optimierung von Leitverbindungen sowie Mechanismus-der-Wirkung-Studien in Modellen der Nierenerkrankung unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung makrophagenvermittelter Signalwege bei Nierenschädigungen durch phänotypische Quantifizierung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Makrophagendaten, die für die Assay-Validierung und Screening-Kampagnen von Wirkstoffen geeignet sind.
- Analytik: Bietet multiparametrische Durchflusszytometrie-Auswertungen (CD45+/CD68+/CD86+ für M1; CD45+/CD68+/CD163+ für M2), die vergleichende Gruppenanalysen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Makrophagen-Phänotypisierung mit nachgeschalteten Funktionsassays und der Genexpressionsprofilierung in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Immunphänotypisierungs-Workflow, der auf mehrere Nierenerkrankungsmodelle und therapeutische Bereiche anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Uneindeutigkeit bei makrophagenvermittelter Nierenschädigung, indem eine präzise phänotypische Differenzierung ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, geringe Variabilität aufweisende Isolierung und Färbung von Makrophagen, die mit gängigen Durchflusszytometrie-Einrichtungen kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die Modulation von Zielstrukturen mit messbaren Veränderungen der Makrophagenpolarisierung verknüpft wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten basierend auf der Modulation des Makrophagenphänotyps in präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kompensation der Durchflusszytometrie, der Gating-Strategie und der Validierung von Makrophagenmarkern.
- Setzt den Zugang zu Ausrüstung für die Kollagenaseverdauung und sterile Einrichtungen für die Zellverarbeitung voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Antikörpanelen und Fluoreszenzkontrollen zwischen verschiedenen Standorten für eine reproduzierbare Quantifizierung von M1/M2.
- Die Anpassung an andere Gewebe kann eine Optimierung der Dissoziationsenzyme und Markerpanele erfordern.
- Ist im Vergleich zu den umfangreicheren murinen Repertoires durch die Verfügbarkeit ratenspezifischer Makrophagenmarker (CD86, CD163) begrenzt.
