Name: Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Lernen Sie subzelluläre Patch-Clamp-Aufnahmen aus Dendriten dopaminerger Neuronen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Ionenkanal-Funktionen auf subzellulärer Ebene für die Neurobiologie.

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Ich danke Dr. Vincent Seutin für seine ständige Unterstützung, Telle Gillissen und Laurent Massotte für hervorragende technische Unterstützung, Drs Jean Defourny und Sandra Ormenese für Ratschläge mit dem konfokalen Mikroskop, Dr. Jacques Destiné für das Geschenk des zweiten Axopatch 200B-Verstärker, der GIGA-Imaging Plattform für für kritische Lesen des Manuskripts des konfokalen Mikroskop und Imaris Software und Dr. Stephen Freeman zu teilen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen FRS unterstützt - FNRS (U.N002.13 und T.N0015.13) und mit Unterstützung der belgischen Universitätsstiftung (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) veröffentlicht.

Der Autor erklärt , dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Dual somatodendritische Ganzzellableitungen und lokale dendritischen Aufnahmen zu implementieren. Es ist nützlich für den Einfluss von Ionenkanälen zu bestimmen (dh I h) auf dem zeitlichen Verlauf der postsynaptischen Potentiale und Abbilden der Verteilung des Ionenkanals (I h) entlang der somatodendritischen Domäne von nigralen DA - Neuronen, respectively. Die resultierenden elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um hoc histochemistry Post Zellmorphologie zu erholen. Das Verfahren wurde eingesetzt DA Neuronen zu untersuchen, in der Substantia nigra, kann aber für benachbarte nigral GABA-Neuronen verallgemeinert werden, Bereich ventralen tegmental DA Neuronen oder andere midbrain Neuronen. Alle Schritte können auch gefolgt werden , um andere Ionenkanäle untersuchen in Dendriten von nigral Neuronen ohne wesentliche Änderungen zum Ausdruck gebracht. Post - Hoc - Visualisierung ist besonders relevant für Neuronen mit Axon-LagerDendriten, wie nigral Neuronen 25,26, Hippokampus - oriens-alveus Inter 21 oder einigen CA1 Pyramidenneuronen 67. Interessanterweise scheinen Neuronen diese Funktion teilen häufiger zu sein als allgemein 67 gedacht. Morphologische Analyse zeigt auch die genaue Lage der Elektroden und axon. Die Detektion des letzteren können im Axon Anfangssegment (spannungsabhängige Na + -Kanäle oder Ankyrin G) mittels Immunhistochemie 68,69 ausgedrückt durch die Markierung von Proteinen optimiert werden. Die Zuverlässigkeit der Daten mit dendritischen Aufnahmen und anschließender neuronalen Kennzeichnung gesammelt, hängt immer von der Scheibenqualität. Maximale Anstrengung muss daher angewandt werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebes zu erhalten. Dies wird mit schonenden Umgang mit gesunden Tieren, hochwertige Werkzeuge und Reagenzien, ausreichend Sauerstoffversorgung der Gewebe und eiskalten Temperaturen während der gesamten Herstellung von Scheiben erreicht. Stabile Aufzeichnungsbedingungen beruhen auf der Auswahl von gesunden Neuronen. In der whole-cell-Modus sollten Serienwiderstand anfänglich so niedrig wie möglich sein und gewartet werden während des gesamten Experiments konstant. Die Stabilität der Aufnahmen ist weiterhin abhängig von hochwertigen Manipulatoren ohne Drift und Vibrationen. Diese Störungen können durch die Optimierung der Pipette Stabilität reduziert werden: die Verbindung zum Pipettenhalter prüfen und zu heads, Controlling, dass Mikromanipulator Kabel sind schlaff, zu vermeiden plötzliche Änderungen der Temperatur oder Tischbewegung und die Überprüfung der Mechanismus des Manipulators. Für Doppelaufnahmen Methylsulfat- 13,15,21 wurde in der intrazellulären Lösung enthalten, aber Gluconat 9,14,25 können alternativ verwendet werden. Jedoch kann die Haupt Anion das Membranpotential 70,71 und einige spannungsabhängige Ströme 72 verändern. Intrazellulärer Lösung kann mit ATP, GTP und Phosphokreatin zur Erhaltung der Physiolo ergänzt werdengische Funktionen von Neuronen. Zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff in der Pipettenlösung Zugabe (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 41) , um die Dendriten während einer somatischen Aufzeichnung zu visualisieren kann nützlich sein , zum Beispiel eine Druckanwendung zu platzieren (Abbildung 7 in Ref. 41) oder eine elektrische Stimulations Pipette. Die Pipettenlösung für Cell-Attached - Aufnahmen enthält einen hohen K + -Konzentration und keine Na + große I h zu erfassen. Bemerkenswert der Na + / K + Konzentrationsverhältnis beeinflusst die Stromamplitude 10, das Umkehrpotential des Stroms 11 und die Gating von I h 73. Alternativ kann ich h auch außerhalb Outs 10 aufgezeichnet werden. In dieser Aufzeichnungskonfiguration jedoch das intrazelluläre Milieu, in der Nähe der Kanäle gestört werden kann. Folglich Unterschiede in der spannungsabhängige Aktivierung von I &lt;sub&gt; h beobachtet wird beim Vergleich von Strömen mit Cell-Attached - Patches erhalten und außerhalb Outs 10. Anschwellen von Neuronen wird gelegentlich bei der Patch-Clamp - Aufzeichnung auftreten, und stellt sich oft aus verschiedenen Ursachen, wie die geringe Qualität des Wassers, starkes Ungleichgewicht in der Osmolarität oder pH - Wert zwischen dem intra- und extrazellulären Lösungen 39 oder Fehler in der Zusammensetzung der Lösungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Ableitungen hat eine direkte Auswirkung auf die Qualität der Morphologie der verwerteten Neuronen. (- 10 MOhm, wie in Refs 6,11. 6) und für einzelne somatische Aufnahmen nach Cell-Attached - Aufnahmen 14 der Verdünnung des intrazellulären Milieu zu minimieren Hohe Beständigkeit somatischen Pipetten werden für Dual - Aufnahmen verwendet. Die Ganzzell-somatischen Aufzeichnung nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung wird deshalb kurz gehalten (&lt;10 min). Outside-out-Patches von sowohl der somatischen und dendritischen Pipetten sind für die ordnungsgemäße Schließen der cell Membran und die anschließende Erholung der Zellmorphologie. Zusätzlich zu der Struktur der Zelle kann der neurochemischen Inhalt für die aufgezeichneten Neuronen 59,74 bestimmt werden. So kann beispielsweise die intrazelluläre Protein - Tyrosin - Hydroxylase immunmarkierten zur eindeutigen Identifizierung von DA - Neuronen 13 werden. DA - Neuronen werden hauptsächlich in der SN pars compacta eingeengt, mit einer viel niedrigeren Dichte in der SN pars reticulata, wo sie sich mit einer höheren Anzahl von GABA - Neuronen 75 miteinander vermischt werden. Während die Zellkörper von DA-Neuronen ist oft größer als der GABA-Neuronen, ist die visuelle Identifizierung dieser Zellen mit IR-Videomikroskopie unsicher und teilweise durch die Opazität der pars compacta behindert. Um diese Einschränkungen, die Vorauswahl von DA - Neuronen umgehen kann durch die Verwendung von transgenen Mäusen , erleichtert werden , um einen Fluoreszenzmarker in einer bestimmten Population von Neuronen (TH 65 oder DAT für DA - Neuronen exprimiert, GADfür GABA-Neuronen) und Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzfarbstoff in der Lösung der somatischen Elektrode eingeschlossen werden, um die Visualisierung von Dendriten zu erleichtern. Verbesserte Auflösung der Fluoreszenzzelle wird durch Nipkow Kreiselscheibenapplikators konfokalen 14,22,30 oder Zwei-Photonen - Mikroskopie 7 kombiniert , um IR-DGC 6 gebracht. Mehrere Vorteile werden DGC im Vergleich zu DIC bezogen. Zunächst wird , wie DIC Prismen nicht erforderlich sind, kann die IR-DGC Bildes mit einem Fluoreszenzbild 49,52,53,76 überlagert werden. Zweitens kann DGC mit Photostimulation kombiniert und Optogenetik 77. Ein Nachteil der Scheibe Vorbereitung ist die Erhaltung der Integrität von Neuronen. DA - Neuronen erweitern ihre Dendriten in den drei Raumebenen 78,79 und damit Verkürzung des dendritischen Fach nicht vollständig in den Scheiben 80 können vermieden werden. Die Wahl der Orientierung der Scheiben (coronal, horizontal oder parasagittal) ist ein Trade-off. Der Ursprung der Innervation und dem experimentellen Design muss berücksichtigt werden, um die richtige Ausrichtung der Scheiben zu wählen. Direkt dendritischen Patching ist die Technik verwendet, um die Verteilung der funktionellen Ionenkanäle in den verschiedenen Kompartimenten von Zellen abzubilden. Darüber hinaus bietet diese Technik die Variabilität in funktionellen Eigenschaften der Kanäle 20 zu bestimmen. Als Ergänzung kann die Position und Dichte von Ionenkanälen ermittelt werden mittels Immunhistochemie an den Licht- und Elektronenmikroskopie Ebenen 17,23. Dieser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, die Kanaldichte in kleinkalibrigen Strukturen zu bestimmen, die Patch-Pipetten unzugänglich sind. Jedoch könnten diese Kanäle in einer bestimmten Funktionszustand 24 oder sogar inaktiv im Vergleich zu denen, Patch-Clamp - Techniken aufgenommen werden. Beide Techniken sind daher notwendig, um ein vollständiges Bild von der Lage zu erhalten und die Eigenschaften vonIonenkanäle in einem bestimmten zellularen Bereich 17. Mit der Entwicklung von spannungsempfindlichen Farbstoffen, Spannung Abbildungs verwendet wurde an mehreren Stellen 81 , um die Ausbreitung von APs und EPSPs in Neuronen zu untersuchen. Als Alternative zu Dual-Patch-Clamp-Aufnahmen, kann dieser Ansatz auch für dünne Dendriten implementiert werden, die auf Patch-Pipetten nicht zugänglich sind, aber eine genaue Kalibrierung des Signals und Mitteln erforderlich machen. Während DA-Neuronen im ventral tegmentalen SN und Bereich über somatische Aufnahmen im physiologischen und pathophysiologischen Kontext umfassend untersucht werden, bleibt die funktionellen Eigenschaften ihrer Dendriten in beiden Bedingungen weitgehend unbekannt. Patchen von Dendriten wurde für nigral Dopamin - Neuronen von mehreren Gruppen mit Erfolg 13,25,26 und bleibt die Methode der Wahl zu sezieren erregbar Eigenschaften dieser feinen subzellulärer Strukturen 8 umgesetzt. Dendritische Aufnahmen bieten eine weitere Mögschaft , die Effizienz und die Plastizität der synaptischen Übertragung und die Plastizität der dendritischen Erregbarkeit 82,83 zu prüfen.

Neurone erhalten synaptischen Informationen überwiegend auf ihre Dendriten. Erregenden und hemmenden synaptischen Signale von ihrer Website von Generation zur Integrationsstelle verbreiten, in dem Aktionspotentiale (APs) als Ausgangssignal hervorgerufen werden. Auf ihrem Weg werden synaptische Potentiale beeinflusst sowohl die Struktur der Dendriten und die Wechselwirkung zwischen passiven und aktiven Membraneigenschaften. Die Kombination dieser sehr variablen Parameter erweitert die Rechenleistung von Neuronen 1,2. Jedoch verhindert der geringe Durchmesser von Dendriten jedoch die Untersuchung ihrer elektrischen Eigenschaften. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Patch-Clamp - Technik 3 ist die Optik 4 und Verbesserung von Verfahren zur Schicht Vorbereitung 5 in den letzten Jahrzehnten haben es ermöglicht , Aufnahmen aus sehr dünn (0,7-3 &amp; mgr; m Ø) Dendriten 6,7. Diese Verfahren wurden und werden immer noch verwendet weitgehend die Erregbarkeit von Dendriten in einer Vielzahl zu untersuchen of Neuronen 8. Direkt dendritischen Aufnahmen sind wesentlich die Verteilung 9-19 und Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften 20-22 von Ionenkanälen in verschiedenen neuronalen Abteilen zu bestimmen. Diese Daten sind die notwendige Ergänzung der Ionenkanalverteilungen mit Immunhistochemie nachgewiesen kombiniert , um Licht- und Elektronenmikroskopie 23,24. Dual - somatodendritische Aufnahmen wurden implementiert , um die Ausbreitung von Aktionspotentialen 9,13-15,21,22,25-27 und Verbreitung der synaptischen Potentiale 13,16,18 entlang der somatodendritische Domäne von Neuronen zu erforschen, erhalten detaillierte passive Kabelmodelle 28- 30 und die zeitliche Auflösung der neuronalen Integration 31 untersuchen. Die Substantia nigra (SN) ist eine Region, in der Mittelhirns in mehreren Funktionen beteiligt sich beispielsweise die Steuerung der Bewegung, die Codierung von Belohnung und gewohnheitsmäßige Verhalten. Die Abnahme von Dopamin aufgrund der spezifischenVerlust dopaminerger (DA) Neuronen in der SN mit den motorischen Störungen in Patienten , die an Parkinson-Krankheit leiden , beobachtet 32 verbunden. Die nigral Schaltung besteht aus zwei Hauptzelltypen: dopaminergen und GABA-erge Neuronen. Interessanterweise haben diese Neuronen mehrere spezifische Eigenschaften, die sie von anderen Neuronen unterscheiden. Das Axon eines großen Anteils von DA - Neuronen und einigen GABA - Neuronen stammt aus einer dendritischen Ort anzeigt , dass die dendritischen Dorn heterogen ist (Axon-Lager und Axon-fehlt Dendriten) 25,26,33. Die Morphologie dieser Neuronen im Gegensatz daher mit der typischen Organisation von Neuronen in dem die Informationsübertragung das Gesetz der dynamische Polarisation emittiert von Cajal folgt: ausgehend von Dendriten zu soma und schließlich 34 bis Axon. DA - Neuronen sind auch Aktivität zu lösen Dopamin aus ihren Dendriten 35, erzeugen Platzen bekannt 36 und NMDA-Rezeptor Plastizität 37. Die dissection dieser Phänomene ist schwer zu fassen, ohne direkte Aufnahmen von der Stelle, wo sie initiiert werden. Um Einblicke in die Beziehung zwischen den genauen Ort und funktionellen Eigenschaften von Ionenkanälen und ihre Rolle bei der dendritischen Erregbarkeit und Informationstransfer in nigral Neuronen, direkte dendritischen Aufnahmen sind die Methode der Wahl. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Verfahren , die verwendet werden können Single- und Dual - Patch-Clamp - Aufnahmen von Dendriten nigraler Neuronen und dem entsprechenden Post - hoc - biocytin Kennzeichnung zu erhalten. Die Grundprinzipien für das Patchen der somatischen und die dendritischen Membran sind sehr ähnlich. Praktisch jedoch Aufnahmen von dendritischen Sites erfordern eine gezielte Optimierung im Vergleich zu somatischen Aufnahmen. Erfolgreiche dendritischen Aufnahmen verlassen sich auf die Qualität der Scheiben, eine optimale Anpassung der Optik, sanfte Annäherung der Patch-Pipette und die Stabilität der Aufnahmen.

<table><tbody><tr><td>Doppelt destilliertes Wasser</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Widerstand >14 M&Omega; cm, ideal 18,2 M&Omega; cm bei 25&nbsp; &deg; C, gefiltert (0,22 &Mikro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Mikrofilterkerzen</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm oder 13 mm Durchmesser</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Slicer mit Vibrosonde</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Schnittparameter: Geschwindigkeit 0,07, Amplitude 1,40</td></tr><tr><td>Tissue-Slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>Schneidparameter: Geschwindigkeit 4, Frequenz 7</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Präparierwerkzeuge</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservekammer</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigungen</td></tr><tr><td>PP</td><td>Beckers VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0,22 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber&nbsp;</td><td>UHU"</td><td>Sekunden Kleber"</td><td>flüssiger Kleber</td></tr><tr><td>Aufnahmekammer&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice Minikammer</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaler Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm Außendurchmesser/1 mm Innendurchmesser Glaskapilare, Enden feuerpoliert, gewaschen</td></tr><tr><td>Dentalwachs</td><td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td><td>kieferorthopädische Tablett Wachsstreifen</td></tr><tr><td>Platingitter</td><td></td><td></td><td>zur Verankerung von Scheiben in der Aufnahmekammer, speziell angefertigt mit einer Platinscheibe</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>zum Brennpolieren von Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>Kaliummethylsulfat</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulatoren</td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Die Bildquelle</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Kondensor</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Kondensor mit hoher numerischer Apertur Arbeiten mit Öl</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63-fache Vergrößerung, große Entfernung, hohe numerische Apertur 1,0 Wasserimmersion Objektiv</td></tr><tr><td>Vierfach-Wechsler</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>zwischen Kamera und Mikroskop</td></tr><tr><td>Schwarz-Weiß-Videomonitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 Zoll, 850 TV-Zeilen, analog</td></tr><tr><td>Probenflaschen, Braunglas, mit Kappe</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>zum Transfer von Scheiben aus dem Setup in den Histologieraum</td></tr><tr><td>Der Axon Guide Molecular</td><td>Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analyse der elektrophysiologischen Daten</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>siehe SICHERHEITSDATENBLATT und Gefahrstoffrichtlinie (EU) vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Well Zellkulturplatte</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>für die Färbung von fixierten Scheiben</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>siehe SICHERHEITSDATENBLATT und Gefahrstoffrichtlinie (EU) vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Maus Anti-TH monoklonaler primärer</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>Arbeitskonzentration: 1/1.000</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus Sekundärantikörper - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>Arbeitskonzentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molekulare Sonden - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>Plugin für ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Rekonstruktion von Biocytin-gefüllten Neuronen</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Rekonstruktion von Biocytin-gefüllten Neuronen</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analyse elektrophysiologischer Daten</td></tr></tbody></table>

subzellulärer patch-clamp-aufnahmen aus der somatodendritische domain nigraler dopamine neurons

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendriten von dopaminergen Neuronen empfangen und vermitteln synaptischen Eingang, Unterstützung Aktionspotential Rückausbreitung und die Freisetzung von Neurotransmittern. Schuppen Licht in diesen Neuronen auf der Informationsübertragung wird diese grundlegenden Funktionen zu verstehen. Dendritische patch-clamp-Aufnahmen bieten die Möglichkeit, direkt auf die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und das darunter liegende spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen. Jedoch sind diese feinen Strukturen nicht leicht zugänglich Patch-Pipetten wegen ihres kleinen Durchmessers. Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren stabile und zuverlässige Aufzeichnungen von den Dendriten von dopaminergen Neuronen in akuten Scheiben zu sammeln. Elektrophysiologische Messungen werden mit Post - hoc - Erholung der Zellmorphologie kombiniert. Erfolgreiche Experimente stützen sich auf eine verbesserte Herstellung von Scheiben, Lösungen und Pipetten, adäquate Einstellung der Optik und Stabilität der Pipette in Kontakt mit der aufgezeichneten Struktur. Standard-Prinzipien somatic Patch-Clamp-Aufzeichnung werden an Dendriten angewendet, sondern mit einem sanfteren Ansatz der Pipette. Diese vielseitigen Techniken können verschiedene Fragen zu den erregbaren Eigenschaften von Dendriten zu adressieren umgesetzt werden.

Das oben beschriebene Protokoll beabsichtigt, die Sammlung von Daten unter Verwendung von dendritischen Patch-Clamp-Aufnahmen zu erleichtern. Diese Technik, kombiniert mit post hoc Histochemie hilft Einblicke in die Mechanismen vieler elektrischer Signale in Dendriten Ursprung oder Ausbreitung zu gewinnen. Direkter Zugriff auf Dendriten mit Patch-Pipetten ist schwierig, aber ein besonderes Augenmerk auf einige methodische Aspekte werden die Erfolgsrate der Aufnahmen zu verbessern. Ein Experimentator ausreichend stabilen somatischen Aufnahme erfahren können damit rechnen, auf die meisten Versuche mit hohem Widerstand (G &amp; Omega;) Dichtungen und vollständige Experimente zu erhalten. Ein bis zwei hochwertige dendritischen Aufnahmen können pro Präparation gesammelt werden. Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Hirnschnitten mit gesundem somata und Dendriten ist eine Voraussetzung für den Zugriff auf diese feinen Strukturen (Abbildung 1). Die criteriein für diese Neuronen Auswahl sind eine glatte und homogene Oberfläche der ganzen Zelle und einer soma und Dendriten mit geringem Kontrast , wenn sie mit optimal angepasst Optik (1A und 1B) beobachtet. Auswählen von Neuronen zu stark im Allgemeinen führt zu instabilen Aufnahmen (1C und 1C) gegenübergestellt . Daher werden solche Neuronen vermieden werden sollte. Im Vergleich zu anderen Neuronen zeigen nigral DA Neuronen spezifischen morphologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften. Diese Funktionen , die normalerweise mit einem einzelnen somatischen Pipetten beurteilt kann auch in Doppel somatischen (Abbildung 2) und somatodendritischen Aufnahmen (Abbildung 3) beobachtet werden. Lange hyperpolarisierender Strominjektionen induzieren ein Membranpotential Rektifikation genannt &#39;sag&#39; (2B und 5D). Das Axon stammt, in den meisten Fällen auf einer dendritischen Website identifiziert alsVerwendung komplementärer Kriterien 13,25,26, was anzeigt , dass die dendritischen Kompartiment in diesen Neuronen heterogen ist (3A - 3B). Als Folge davon , wo das Fach der AP entspricht beobachtet wird zuerst dem Fach , in dem das Axon (3C - 3D) austritt 13,25,26. Das Axon wird von einem axonalen Bleb verursacht durch eine Schneid des Axons während des Schneidens 64, aber diese Struktur nicht systematisch erfasst im Allgemeinen beendet. Die ausgeprägte sag beobachtet in nigralen DA - Neuronen in Folge der Aktivierung von I h deutet auf eine hohe Expression von HCN - Untereinheiten. Um den Einfluss von I h auf die Integration von synaptischen Signale, synaptic artigen Strom (EPSC) Wellenformen bestimmen wurden über die dendritischen Aufzeichnungselektrode während somatodendritische Dual Aufnahmen 55 (&lt;erzeugt und injiziertstrong&gt; Abbildung 4). Die Kinetik dieser simulierten EPSCs wurden auf den Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des realen spontanen EPSCs basiert. Die sich ergebende aEPSP wurde mit dem somatischen Elektrode aufgezeichnet. Badanwendung der I h blocker ZD 7288 erhöht , um die Dauer der aEPSP, was darauf hinweist , den Beitrag von I h zu den Zeitverlauf der synaptischen Signale (4B). ZD 7288 beseitigt auch das Membranpotential Rektifikation bestätigt , dass die SAG ergibt sich aus der Aktivierung von I h (4C). Die Ergebnisse mit simulierten EPSPe erhalten könnte Experimente korreliert werden unter Verwendung von elektrisch evozierten EPSPe 65. Um die genaue Verteilung des Kanals in der somatodendritische Domäne von DA - Neuronen, Cell-Attached - Aufnahmen Karte implementiert wurden (Abbildung 5). Eine hochohmige Dichtung (&gt;&gt; 1 G &amp; Omega;) ist eine absolute Notwendigkeit für Cell-Attached - Aufnahmen (5B </strong&gt;). In Dendriten von DA - Neuronen aktiviert I h langsam mit langen hyperpolarisierender Spannungsschritten und der Strom im stationären Zustand wird nach Hunderten von ms (5C) erreicht, wie zuvor 66 gezeigt. Diese Beobachtung zeigt , dass HCN - Kanäle in Dendriten von DA - Neuronen haben unterschiedliche Untereinheiten im Vergleich zu denen in pyramidalen Neuronen oder andere Zelltypen exprimiert 10,16,66. Da die Verteilung des Kanals in dem dendritischen Kompartiment inhomogenen sein könnte und als das dendritische Kompartiment selbst heterogen ist, wird die Identität des Dendriten (Axon-Lager oder nonaxon tragenden Dendrit) ergab durch die IR-DGC Bild mit dem konfokalen Bild zu vergleichen nach Biocytin Färbung (3A und B). Wiederherstellung der Zellmorphologie ist daher notwendig, für beide Dual somatodendritische Aufnahmen und für Cell-Attached-Aufnahmen über nachfolgende somatischen Ganzzellableitungen. Abbildung 1. Soma und proximaler Dendriten nigraler dopaminerge Neurone Mit Infrarot - Videomikroskopie sichtbar machen . (A) IR-DGC Bild eines nigral DA Neuron die soma und proximalen Dendriten und beide somatischen und dendritischen Pipetten zeigt. Ein Dual-somatodendritische Aufzeichnung wurde erfolgreich auf diesem gesunden Neuronen durchgeführt. Beachten Sie die niedrigen Kontrast und die glatte Oberfläche der ganzen somatodendritische Domäne der Zelle. (B) Ein weiteres Beispiel für ein gesundes DA Neuron. (C) DA Neuron mit einer raueren und unebenen Oberfläche und einer stärkeren Kontrast. Während ein Doppelaufzeichnung erhalten wurde, war die Stabilität suboptimal und die Aufzeichnungsdauer war kurz (~ 15 min) durch eine allmähliche Zunahme des Zugangswiderstand an beiden Pipetten. (D) zweites Beispiel eines DA Neuron ein stark kontrastierte zeigt soma und proximalen Dendriten. In diesem Fall wurde eine starke Erhöhung der Zugangswiderstand beobachtet kurz nach der Pause in der whole-cell-Modus. Ein Versuch, den Zugangswiderstand durch Unterdruck zu verringern, war nicht erfolgreich. Neurone in Panel C und D können sich während der Schneideverfahren beschädigt wurden und sollte für Versuche vermieden werden. (E) Simultaneous Doppel somatischen Aufzeichnung in einem gesunden DA Neuron zu Beginn der Aufzeichnung. (F) Das gleiche Neuron , wie in Tafel E mit eine geschwollene Zellkörper nach 17 min ~. Notieren Sie sich die vollständige Abwesenheit von Kontrast, die kugelartige Erscheinung des Somas und die Anwesenheit des großen Kern , die nicht offensichtlich in gesunden Neuronen ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figur 2. </strong&gt; Simultane Doppel Somatic Aufnehmen von einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild während der Doppel somatischen Aufnahme von einem DA Neuron. (B) hyperpolarisierender und depolarisierende 1 s lang Strominjektionen (-160 bis 80 pA, erhöhen 80 pA) und entsprechenden Spannungsänderungen gleichzeitig mit beiden Patch-Pipetten aufgezeichnet. Beachten Sie das Vorhandensein des Durchhangs in der Spannungsverlauf mit dem langen hyperpolarisierender aktuellen Schritt und die große After-Hyperpolarisation nach dem AP während des depolarisierenden Stromimpuls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Abbildung 3. Doppel - S omatodendritic Aufnahme in einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen dem dendritischen und Somatic Pipette ist 29 &amp; mgr; m. (B) Konfokale Z-Projektionsbild des Neurons in Feld A mit Avidin an Fluoresceinisothiocyanat markiert konjugiert (FITC). Das Neuron wurde während der Aufnahme mit biocytin gefüllt. Das Axon stammt von einem proximalen Dendriten der Nähe des soma , wie durch den Pfeil angezeigt. (C) Simultaneous Dual somatodendritische Ganzzellspannung Aufnahme von dem Neuron in der Abdeckung A. AP im soma (schwarz Spannungsspuren) und Dendriten (rot Spannung aufgezeichnet in Reaktion Spuren) auf eine lange Strominjektions Schritt s 1 über die somatischen (links, schwarz Stromspur) und alternativ dendritischen Pipette (rechts, rot aktuelle Trace) (D) somatische und dendritischen AP in gedehnten Zeitskala angezeigt.. Mit entweder somatischen oder dendritische Strominjektion, die somatische AP (schwarz) voran die dendritische AP (rot). Die Verzögerung zwischen APs in diesem Neuron betrug 120 &amp; mgr; s und 210 &amp; mgr; s mit somatischen und dendritischen Stromeinspeisung sind. Verzögerungenwurden bei AP halb-maximale Amplitude während der Anstiegsphase des AP gemessen. Der AP wird zunächst der Nähe in der Kammer beobachtet , auf die das Axon auftaucht, bestätigt frühere Beobachtungen 25,26. In diesem Fall wird die dendritische Aufnahme von einer Axon-Dendrit fehlt gemacht. Ein Beispiel für eine Aufnahme von einem Axon-Lager Dendriten ist in Ref. 13 (in ihrer Abb. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Ausbreitung von Artificial EPSPe Entlang der somatodendritische Achse des DA Neurone. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen der dendritischen und somatische Pipette 45 um. Beide Patch - Pipetten sind in der gesamten Zellenstrom-Clamp - Aufnahmemodus. (B) Strommit der dendritischen Pipette in Current-Clamp aufgezeichnet und verwendet, um die künstliche EPSP (oben) zu erzeugen. (; Τ Zerfalls = 3 ms, Amplitude = 100 pA τ Anstieg = 0,6 ms) über die dendritischen Aufzeichnungspipette 55 wird der Strom durch die Injektion eines EPSC artigen Wellenform erhalten. Am unteren propagierte aEPSPs im SoMa in Kontrollbedingungen (schwarz) aufgezeichnet und nach dem Bad Anwendung des I h - Blocker ZD7288 (30 &amp; mgr; M; rote Kurve). Jede Spannungsverlauf ist der Mittelwert von 40 Einzel fegt. Beachten Sie die große Zunahme der EPSP Dauer in Gegenwart von ZD7288 anzeigt , den Beitrag von I h zu dem zeitlichen Verlauf der EPSPs. (C) Spannungs Spuren von Soma in Kontrollbedingungen aufgezeichnet (schwarz) und nach der Anwendung von 30 uM ZD 7288 ( rot) in Reaktion auf einen langen (30 pA; 1 s) Hyperpolarisieren aktuellen Schritt. Bemerke die Abwesenheit des Membranpotentials Rektifikation (SAG) nach der Blockierung des I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Abbildung 5. Das Vorhandensein von I h in Dendriten von DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron und Pipette auf proximalen Dendriten. (B) Kapazitive und Leckströme während einer 5 mV Spannungsbefehl in Cell-Attached - Konfiguration. Der Dichtungswiderstand betrug 5 GOhm in diesem Beispiel (C) hyperpolarisierender Spannungsstufe. (90 mV; oben) aus einem Membranpotential von 0 mV einen langsam aktivierenden I h induziert. Die aktuelle Spur wurde umgedreht und mit einer einzigen Exponentialfunktion ausgerüstet , der eine Zeitkonstante von τ = 632 ms zu geben. (D) SpannungAntworten der whole-cell aufgezeichnet soma (Panel A) bis 1 s hyper- und depolarisiert Stromimpulse (-160 bis 120 pA, 40 pA Inkrement). Die somatischen Ganzzell Aufnahme wurde nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung durchgeführt. Beachten Sie die Abwesenheit von APs durch die extrazelluläre Applikation von TTX und Cd 2+ spontane Zündung während Cell-Attached - Aufzeichnung zu unterdrücken. Diese spannungsgesteuerten Na + und Ca 2+ Strom - Blocker wurden hinzugefügt Aktionsströme zu unterdrücken. Platten A - D von gleichen Neurons (E) IR-DIC Bild eines anderen Neurons DA und einer dendritischen Pipette (F) spannungsabhängig von einem Testimpuls auf 0 mV von einem 50 ms Vorimpuls bei -120 mV aktiviert Ströme.. in einem Outside-out von dem proximalen Dendriten der Neuronen in der Platte E. Haltepotential -80 mV ausgeschnittenen Patch. Notieren Sie sich die zeitabhängige Inaktivierung des Stroms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 310 mOsmol / L (optimale Reichweite: 314-325 mosmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Artificial Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Saccharose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Saccharose-ACSF vorzubereiten Scheiben schneiden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocytin </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 mit KOH eingestellt </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung für Dual - Aufnahmen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 290 mOsmol / l, eingestellt mit D-Glucose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Elektroden Lösung für Cell-Attached - Aufnahmen.

Subzelluläre Patch-Clamp-Aufzeichnungen bieten die Möglichkeit, die funktionellen Eigenschaften von Dendriten zu untersuchen. Diese feinen Strukturen sind jedoch aufgrund ihres geringen Durchmessers nicht leicht zugänglich. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Sammlung stabiler und zuverlässiger Aufzeichnungen von den Dendriten von Dopamin-Neuronen in Schnitten in vitro zu erleichtern.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie beantwortet werden, beispielsweise wie einzelne spannungsabhängige Ionenkanäle zur Funktion eines spezifischen Neurons beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Funktion von Ionenkanälen auf subzellulärer Ebene in Neuronen abgebildet werden kann. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie das Gehirn auf eine 9 cm große Petrischale legen, deren Boden mit einer Schicht aus SiliGuard bedeckt ist.Als Nächstes umgeben Sie das Gehirn mit eiskalter Saccharose-ACSF. Um koronare Schnitte herzustellen, führen Sie zwei Schnitte durch, um das Kleinhirn und den rostralen Teil des Gehirns zu entfernen. Tragen Sie dann Cyanoacrylat-Kleber auf dem Probenträger auf und befestigen Sie den Gehirnblock so am Träger, dass der rostrale Teil zur Schneidebühne zeigt.Anschließend einige Tropfen Sucrose-ACSF auf das Gehirn geben und das Tablett langsam in die Schneidekammer absenken. Danach das Rasiermesser in einem Winkel von 15 Grad zur horizontalen Ebene einstellen. Schneiden Sie koronare Gehirnschnitte von etwa 500 Mikrometern in nasaler Richtung, bevor die Substantia nigra erreicht wird.Danach die Dicke so einstellen, dass 300 Mikrometer dicke Schnitte den Bereich von Interesse enthalten. Die Schnitte mit einer sehr feinen Perfusionsnadel, die parallel zur Schneide der Rasierklinge an einer Spritze befestigt ist, vom Gewebestück lösen. Anschließend die Schnitte für eine Stunde in die Reservkammer bei 34 Grad Celsius überführen.Überführen Sie bei diesem Verfahren eine Gehirnschnitt in die Ableitungskammer. Befestigen Sie die Schnitt mit einem Platinschlauch am Boden der Ableitungskammer und stellen Sie sicher, dass die Schnitt von guter Qualität ist und eine glatte, gleichmäßige Oberfläche aufweist. Wählen Sie anschließend ein Neuron mit einem Dendriten aus, der sich über eine große Distanz in derselben Ebene erstreckt, und vergewissern Sie sich, dass dem interessierenden Dendriten bis zu einem klar definierten Soma gefolgt werden kann.Füllen Sie als Nächstes die Patch-Pipette mit Elektrolytlösung. Um den Dendriten im Zell-angehefteten Modus zu patchen, identifizieren und fokussieren Sie einen Abschnitt des Dendriten. Geben Sie positiven Druck auf die Pipette und senken Sie sie mithilfe des Mikromanipulators ab.Danach die Pipette nahe der Membran positionieren und den Druck so einstellen, dass eine kleine Delle entsteht. Anschließend den Druck an der Pipettenspitze verringern und die Dendritenmembran abdichten, während der Pipettenwiderstand kontrolliert wird. Versuchen Sie, einen Abschlusswiderstand von mehr als einem Gigohm zu erzielen, idealerweise zwischen drei und zehn Gigohm, für Aufzeichnungen im Zell-angehefteten Modus.Anschließend den Pipette um einige Mikrometer von der Membran zurückziehen, um eine Verformung des Dendriten zu vermeiden. Die hier sichtbaren Aktionsströme stellen die spontanen Aktionspotentiale nigraler Neuronen dar. Um die Aktionsströme zu unterdrücken, Calcium- und Natriumkanalblocker dem ACSF hinzufügen.Dann wenden Sie einen Spannungsschritt von 90 Millivolt, ausgehend von einem Haltepotential von null Millivolt, an, um den durch Hyperpolarisation aktivierte Kationenstrom hervorzurufen. Am Ende der Aufzeichnung durchbrechen Sie die Membran des Patches, um den Ganzzellmodus zu erreichen. Danach ziehen Sie die dendritische Pipette langsam und vorsichtig von der neuronalen Membran zurück, um einen outside-out-Patch zu erhalten.Um Aufnahmen vom entsprechenden Soma im Ganzzellmodus durchzuführen, lokalisieren Sie das dem Dendriten zugehörige Soma. Senken Sie eine Pipette mit einem Widerstand zwischen fünf und zehn Megaohm, die eine intrazelluläre Kalium-basierte Lösung enthält, auf den Zellkörper ab. Anschließend wird kurz ein Unterdruck an die Pipettenspitze angelegt, um die Membran zu rupturieren und so den Ganzzellmodus zu erreichen.Überprüfen Sie die Identität des Neurons im Strom-Klemm-Modus, indem Sie lange hyperpolarisierende und depolarisierende Stromschritte anwenden, und ermöglichen Sie die Diffusion von Biocytin aus der Pipette entlang der Dendriten. Nach 10 Minuten ziehen Sie die Pipette zurück, um eine Outside-out-Patch-Konfiguration zu erhalten. Verwenden Sie eine Abfolge kurzer lateraler Aufwärtsbewegungen, um das ordnungsgemäße Schließen der Zellmembran zu begünstigen, sobald sich die Pipette über dem Schnitt befindet, um vollständig aus der Ableitungskammer herauszukommen.Belassen Sie die Schnittprobe für zusätzliche 15 Minuten in der Aufzeichnungskammer in standardisierter ACSF, um die Equilibrierung von Biocytin und des aufgezeichneten Neurons zu ermöglichen. Überführen Sie die Schnittprobe dann vorsichtig in eine 25-Milliliter-Braunglasflasche, die standardisierte ACSF für die Histologie enthält. Lokalisieren Sie in diesem Verfahren das fluoreszenzmarkierte Neuron in der Schnittprobe grob mit Epifluoreszenz.Untersuchen Sie kurz den dendritischen Baum der Neuronen und lokalisieren Sie das Axon und den axonalen Bleb mit einem 10X-Objektiv. Wechseln Sie anschließend zum konfokalen Mikroskop und wählen Sie die 488 Nanometer Laserdiode aus, um das markierte Neuron anzuregen. Verfolgen Sie die Ausdehnung des Axons und der Dendriten entlang der Z-Achse und nehmen Sie nacheinander Bilder auf, um einen Z-Stack für die gesamte Zelle zu erhalten.Passen Sie die Auflösung der Z-Achse an und nehmen Sie die konfokalen Bilder der Zelle mit niedriger und hoher Vergrößerung auf. Öffnen Sie am Ende die Bilddatei des Neurons mit einer Bildverarbeitungssoftware. Vergleichen Sie das Z-Projektionsbild visuell mit einem IR-DGC-Bild, um die genaue Position der Patch-Pipette während der elektrophysiologischen Ableitung zu bestimmen.Hier ist das IR-DGC-Bild eines Dopaminneurons und einer Pipette an der proximalen Dendritenregion dargestellt. Die Stromspur zeigt die Fähigkeit der EN-Leckströme als Reaktion auf einen Fünf-Millivolt-Spannungsbefehl in der zellangehefteten Konfiguration mit einem Dichtwiderstand von fünf Gigohm. Ein hyperpolarisierender Spannungsschritt ausgehend von einem Membranpotenzial von null Millivolt induzierte einen langsam aktivierenden, durch Hyperpolarisation ausgelösten Kationenstrom.Die Stromspur wurde invertiert und mit einer einzelnen exponentiellen Funktion angepasst, wodurch eine Zeitkonstante von 632 Millisekunden ergab. Hier sind die Spannungsantworten des gesamten Zellkörper-Aufzeichnungs-Somas auf eine Sekunde dauernde hyperpolarisierende und depolarisierende Strompulse in Gegenwart von spannungsabhängigen Natrium- und Calciumstromblockern, um Aktionspotentiale während der Zell-angehefteten Aufzeichnung zu unterdrücken. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gesundes Gewebe zu erhalten und stabile Aufnahmebedingungen sicherzustellen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Identität des aufgezeichneten Neurons. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurophysiologie den Weg, um die Funktion, Eigenschaften und Rolle spannungsabhängiger Ionenkanäle in erregbaren Zellen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Verteilung von Strömen, die durch spannungsabhängige Ionenkanäle in Dendriten fließen, aufzeichnet und untersucht.

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