Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, z. B. wie einzelne spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu den Funktionen eines bestimmten Neurons beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Funktion von Ionenkanälen auf subzellulärer Ebene in Neuronen abzubilden. Beginnen Sie diesen Eingriff, indem Sie das Gehirn auf eine 9 Zentimeter große Petrischale legen, deren Boden mit einer Schicht SiliGuard bedeckt ist.

Als nächstes umgeben Sie das Gehirn mit eiskalter Saccharose-ACSF. Um koronale Schnitte vorzubereiten, machen Sie zwei Schnitte, um das Kleinhirn und den rostralen Teil des Gehirns zu entfernen. Tragen Sie dann Cyanacrylatkleber auf die Probenschale auf und kleben Sie den Gehirnblock so auf die Schale, dass der rostrale Teil zum Schneiden zeigt.

Tragen Sie anschließend ein paar Tropfen Saccharose-ACSF auf das Gehirn auf und tauchen Sie das Tablett langsam in die Schneidkammer ein. Stellen Sie anschließend die Rasierklinge in einem Winkel von 15 Grad in Bezug auf die horizontale Ebene ein. Schneiden Sie koronale Hirnschnitte von etwa 500 Mikrometern in Nasenrichtung, bevor Sie die Substantia nigra erreichen.

Passen Sie dann die Dicke an, um 300-Mikrometer-Scheiben zu schneiden, die den interessierenden Bereich enthalten. Trennen Sie die Scheiben vom Gewebeblock mit einer sehr dünnen Profusionsnadel, die parallel zum Rand der Rasierklinge an einer Spritze befestigt ist. Anschließend werden die Scheiben für eine Stunde bei 34 Grad Celsius in die Reservekammer überführt.

Bei diesem Verfahren wird ein Hirnschnitt in die Aufnahmekammer übertragen. Verankern Sie die Scheibe mit einem Platinring am Boden der Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass die Scheibe von guter Qualität ist und eine glatte, ebene Oberfläche hat. Wählen Sie dann ein Neuron mit einem Dendriten aus, der sich über eine große Strecke in derselben Ebene erstreckt, und stellen Sie sicher, dass der interessierende Dendrit bis zu einem gut definierten Soma verfolgt werden kann.

Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit Elektrodenlösung. Um den Dendriten im zellgebundenen Modus zu flicken, identifizieren und fokussieren Sie sich auf einen Teil des Dendriten. Üben Sie Überdruck auf die Pipette aus und senken Sie ihn mit dem Mikromanipulator.

Positionieren Sie dann die Pipette nahe an der Membran und stellen Sie den Druck so ein, dass ein kleines Grübchen entsteht. Lassen Sie anschließend den Druck auf die Pipettenspitze ab und flicken Sie den Dendriten, während Sie den Pipettenwiderstand steuern. Versuchen Sie, einen Dichtungswiderstand von mehr als einem Gigaohm zu erreichen, bestenfalls zwischen drei und zehn Gigaohm, für Aufnahmen mit Zelle.

Ziehen Sie anschließend die Pipette um einige Mikrometer von der Membran weg, um eine Verformung des Dendriten zu vermeiden. Die hier zu sehenden Aktionsströme repräsentieren die spontanen Aktionspotentiale von nigralen Neuronen. Um die Aktionsströme zu unterdrücken, wenden Sie Kalzium- und Natriumkanalblocker auf ACSF an.

Legen Sie dann einen Spannungsschritt von 90 Millivolt von einem Haltepotential von null Millivolt an, um den hyperpolarisationsaktivierten Kationenstrom hervorzurufen. Am Ende der Aufzeichnung brechen Sie das Pflaster, um den Ganzzellenmodus zu erreichen. Ziehen Sie danach die dendritische Pipette langsam und vorsichtig aus der neuronalen Membran zurück, um ein Outside-Out-Pflaster zu erhalten.

Um im Ganzzellmodus vom entsprechenden Soma aufzunehmen, lokalisieren Sie das entsprechende Soma des Dendriten. Senken Sie eine Pipette mit einem Widerstand zwischen fünf und zehn Megaohm mit einer intrazellulären Lösung auf Kaliumbasis auf den Zellkörper ab. Üben Sie dann einen kurzen Unterdruck auf die Pipettenspitze aus, um die Membran aufzureißen und den Ganzzellmodus zu erreichen.

Überprüfen Sie die Identität des Neurons im Strom-Clamp-Modus, indem Sie lange hyper- und depolarisierende Stromschritte anwenden und Biocytin aus der Pipette entlang der Dendriten diffundieren lassen. Ziehen Sie die Pipette nach 10 Minuten heraus, um ein Pflaster nach außen zu erhalten. Verwenden Sie eine Abfolge von kurzen seitlichen Aufwärtsbewegungen, um das korrekte Schließen der Zellmembran zu begünstigen, sobald sich die Pipette über der Scheibe befindet, um vollständig aus der Aufnahmekammer herauszukommen.

Lassen Sie die Scheibe weitere 15 Minuten in der Aufnahmekammer in der Standard-ACSF, um eine Äquilibrierung des Biocytins und des aufgezeichneten Neurons zu ermöglichen. Füllen Sie die Scheibe dann vorsichtig in eine 25-Milliliter-Braunglasflasche um, die Standard-ACSF für die Histologie enthält. Bei diesem Verfahren lokalisiert man grob das fluoreszenzmarkierte Neuron in der Scheibe mit Epifluoreszenz.

Untersuchen Sie kurz den dendritischen Dorn von Neuronen und lokalisieren Sie das Axon und die Axonblase mit einem 10X-Objektiv. Wechseln Sie als Nächstes zum konfokalen Mikroskop und wählen Sie die 488-Nanometer-Laserdiode aus, um das markierte Neuron anzuregen. Verfolgen Sie die Ausdehnung des Axons und der Dendriten in der Z-Achse und nehmen Sie aufeinanderfolgende Bilder auf, um einen Z-Stapel für die gesamte Zelle zu erhalten.

Passen Sie die Auflösung der Z-Achse an und erfassen Sie die konfokalen Bilder der Zelle bei niedriger und hoher Vergrößerung. Öffnen Sie am Ende die Bilddatei des Neurons mit einer Bildgebungssoftware. Vergleichen Sie das Z-Projektionsbild mit einem IR-DGC-Bild mit dem Auge, um die genaue Position der Patch-Pipette während der elektrophysiologischen Aufzeichnung zu lokalisieren.

Hier ist das IR-DGC-Bild eines Dopamin-Neurons und einer Pipette auf dem proximalen Dendriten zu sehen. Die Stromkurve zeigt die Kapazität der EN-Leckströme als Reaktion auf einen Fünf-Millivolt-Spannungsbefehl in zellengebundener Konfiguration mit einem Dichtungswiderstand von fünf Gigaohm. Ein hyperpolarisierender Spannungsschritt induzierte aus einem Membranpotential von null Millivolt einen langsam aktivierenden hyperpolarisationsaktivierten Kationenstrom.

Die Stromkurve wurde invertiert und mit einer einzigen Exponentialfunktion versehen, was eine Zeitkonstante von 632 Millisekunden ergibt. Hier sind die Spannungsantworten der gesamten Zelle, die Soma auf eine Sekunde hyper- und depolarisierende Stromimpulse in Gegenwart von spannungsgesteuerten Natrium- und Kalzium-Stromblockern aufgezeichnet haben, um Aktionspotentiale während der zellgebundenen Aufzeichnung zu entfernen. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesundes Gewebe und stabile Aufzeichnungsbedingungen zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Immunhistochemie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Identität des aufgezeichneten Neurons zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurophysiologie, um die Funktion und Rolle von spannungsgesteuerten Ionenkanälen in erregbaren Zellen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Verteilung der Ströme, die durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle in Dendriten fließen, aufzeichnen und untersuchen können.