Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentrationen organischer Säuren in Pflanzengeweben zu quantifizieren. Diese Methode kann verwendet werden, um Fragen in der pflanzlichen Biochemie und Physiologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Auswirkungen von Umweltreizen auf die Wurzelentwicklung, die Kulturpflanzenentwicklung sowie die Qualität von Lebensmitteln oder Getränken. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode liegen in der geringen Probenvorbereitung, der hohen Durchsatzkapazität und der kostengünstigeren Durchführung mittels Kapillarelektrophorese im Vergleich zur Massenspektrometrie.

Obwohl diese Methode zur Aufklärung pflanzlicher physiologischer Reaktionen verwendet wird, kann sie auch in der Lebensmittelforschung und -qualität eingesetzt werden, wo organische Säuren geschmackliche Eigenschaften, Sicherheit und Stabilität entscheidend beeinflussen. Beginnen Sie damit, Proben für die Extraktion kurzkettiger Carbonsäuren, oder SCCA, zusammenzustellen. Bereiten Sie jeweils ein Gramm Kaffeekorn vor, um sicherzustellen, dass nach der Aufbereitung genügend Probe übrig bleibt.

Um eine einheitliche Partikelgröße für eine maximale SCCA-Extraktionseffizienz zu erreichen, kühlen Sie zunächst einen Mörser und einen Stößel mit flüssigem Stickstoff vor. Geben Sie die Probe in eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs im Mörser. Fügen Sie mithilfe eines Schöpfers so viel flüssigen Stickstoff zum Mörser hinzu, dass die Probe vollständig bedeckt ist.

Fügen Sie schwer zu mahende Proben, wie beispielsweise rohe Kaffeesamen, der Flüssigstickstoff hinzu. Lassen Sie sie 10 bis 30 Sekunden lang einfrieren, bevor Sie sie mahlen. Zerkleinern Sie das Gewebe durch eine vertikale Zerkleinerungsbewegung in kleinere Fragmente.

Anschließend das vollständige Zerkleinern des Gewebes durch eine kreisförmige Mahlbewegung abschließen. Die Schritte zum Einfrieren und Mahlen insgesamt zweimal wiederholen, sodass die Proben insgesamt dreimal gemahlen werden. In der Regel führen drei aufeinanderfolgende Mahlgänge dazu, dass die Proben zu einem Pulver mit mehligem Zustand zerkleinert werden.

Überführen Sie das Pulver in Glasfläschchen oder 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Beginnen Sie unverzüglich mit der nachgeschalteten Verarbeitung nach dem Mahlen oder lagern Sie die Proben bei -80 Grad Celsius, bis sie zur Extraktion bereit sind. Stellen Sie authentische Referenzstandards für die betreffenden SCCAs zusammen, um externe und interne Standardlösungen herzustellen, die zur Bestimmung der SCCA-Konzentrationen verwendet werden.

Bei Kaffee-Proben citrische, Apfel-, Essig- und Milchsäure als interessierende Säuren sowie Weinsäure als internen Standard einbeziehen. Eine 10 Milligramm pro Milliliter Stammlösung herstellen, indem 100 Milligramm Standard in einen 10-Milliliter-Messkolben gegeben werden. Den Messkolben bis zur 10-Milliliter-Marke mit ultrareinem Wasser auffüllen, um die Säure aufzulösen.

Jede Stammlösung in ein sauberes 15-Milliliter-Glasrohr mit einem mit Polytetrafluoroethylen beschichteten Verschluss überführen und mit Parafilm abdichten. Die Stammlösungen können eine Woche lang bei vier Grad Celsius in verschlossenen Röhrchen aufbewahrt werden. Bereiten Sie 50 Milliliter der SCCA-Extraktionslösung vor, indem Sie die Stammlösung des internen Standards in ultrareinem Wasser auf 0,05 Milligramm pro Milliliter verdünnen.

Führen Sie dies durch, indem Sie 250 µL der internen Standard-Stammlösung zu 49,75 mL Wasser hinzufügen. Bereiten Sie anschließend die Standardkurvenproben für die betreffenden SCCAs vor. Verwenden Sie mindestens fünf Punkte mit Konzentrationen im linearen Antwortbereich, die den erwarteten SCCA-Konzentrationen in den Proben entsprechen.

Verdünnen Sie jedes SCCA in neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit ultrareinem Wasser auf das ermittelte Konzentrationsniveau auf ein Volumen von einem Milliliter. Stellen Sie sicher, dass jeder Konzentrationspunkt alle vier Säurestandards sowie den internen Standard in der korrekten Konzentration enthält. Entnehmen Sie die zu extrahierenden Proben der Lagerung und stellen Sie sie auf Eis.

Wiegen Sie 100 Milligramm Probe für die SCCA-Extraktion ab. Messen Sie eine Probenmenge, die so nahe wie möglich an der Zielmasse liegt, um die Variabilität zu verringern. Nach dem Abwiegen jeder Probe überführen Sie das Gewebe in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Verfolgen Sie die Masse jeder gemessenen Probe, da die Mengen der nachgewiesenen SCCAs anhand der Probenmasse normalisiert werden. Nachdem alle Proben gewogen wurden, geben Sie ein Milliliter Extraktionslösung zu jedem der Probengefäße hinzu. Halten Sie das Verhältnis von Extraktionslösung zur Gewebemasse bei allen Extraktionen gleich.

Gut durch Mischen im Vortex für 10 Sekunden verrühren. Die Proben eine Stunde bei Raumtemperatur stehen lassen. Während dieser Stunde jede Probe alle 15 Minuten durch Mischen im Vortex für 10 Sekunden erneut homogenisieren.

Nach einer Stunde der Extraktion mischen Sie die Proben ein letztes Mal und überführen die Probengefäße in eine Mikrozentrifuge. Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius mit 10.000 × g für 10 Minuten, um das feste Material auszufällen. Um die Proben zu filtrieren, bereiten Sie auf Spritzen montierte Scheibenfilter vor und stellen Sie sicher, dass jeder Filter korrekt an der Spritze befestigt ist.

Bereiten Sie für jede Probe, die analysiert werden soll – einschließlich der Proben für die Standardkurve – eine Spritze mit einem Scheibenfilter vor. Filtrieren Sie die Überstände direkt in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Schließen Sie nach der Filtration das Röhrchen mit dem Filtrat und entsorgen Sie die Spritzenfiltervorrichtung.

Übertragen Sie ein Milliliter Probe in jedes Kapillarelektrophorese- oder CE-Gefäß, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe nicht in den Hals des Gefäßes spritzt. Nach dem Übertragen der Probe setzen Sie eine CE-Kappe auf jedes Gefäß. Richten Sie den SCCA-Nachweislauf gemäß der schriftlichen Anleitung ein.

Laden Sie die Gefäße mit den Standardkurvenpunkten und die Gefäße mit den zu analysierenden Proben gemäß den Herstelleranweisungen in das Probeneingabefach ein. Notieren Sie die Position jedes Gefäßes für die Programmierung des Autosamplers. Nach der in der Versuchsbeschreibung beschriebenen Konditionierung starten Sie die Probentrennung, indem Sie im Softwaremenü die Steuerung öffnen und „Run Sequence“ auswählen.

Überwachen Sie das Photodioden-Array oder die PDA-Schalen, um eine ordnungsgemäße Trennung sicherzustellen. Beobachten Sie die erste Spur und stellen Sie sicher, dass sie eine flache Basislinie aufweist und die einzelnen Säurepeaks sauber auflöst. Öffnen Sie zur Integration der Probenpeaks die erste Datei und legen Sie die automatischen Integrationschritte so fest, dass die ersten drei Minuten des Laufs ausgeschlossen werden.

Legen Sie im selben Menü die Kriterien für die Peakauswahl auf eine minimale Peakbreite von 50 Einheiten und eine Peakfläche von 100 Einheiten fest, um ein mäßig hohes Maß an Selektivität zu erreichen und Säurepeaks vom Hintergrundrauschen in der Spur zu trennen. Führen Sie die Datenanalyse wie im Textprotokoll beschrieben durch. Hier gezeigt ist ein Vergleich von PDA-Spuren, der eine überlastete Probe hervorhebt.

Wenn die Analytkonzentration ansteigt, kann die Geometrie einzelner Peaks zunehmend asymmetrisch werden. Bei 0,05 Milligramm pro Milliliter weist Essigsäure einen gut definierten, beidseitig symmetrischen Peak auf. Mit steigender Konzentration von Essigsäure auf 0,07 oder 0,10 Milligramm pro Milliliter wird der Peak asymmetrisch, und es bildet sich eine Peak-Schwanzbildung.

Dieses Peak-Zerlaufen ist ein guter Hinweis darauf, dass die Probe überlastet ist. Hier dargestellt sind Beispiel-PDA-Spuren, die organische Säuren in grünen Kaffeeextrakten zeigen. Die Proben aus grünem Kaffee wurden vor der Zugabe in die CE-Gefäße 1:10 verdünnt.

Zu den untersuchten Säuren gehören Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Apfelsäure und als interner Standard Adipinsäure. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Proben gleichmäßig zu pulverisieren und sorgfältig pipettieren, um die Reproduzierbarkeit zu maximieren und experimentelle Fehler zu minimieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man organische Säuren aus Pflanzenproben mittels Kapillarelektrophorese (CE) quantifiziert. Sie sollten in der Lage sein, Pflanzenproben zu pulverisieren, organische Säuren zu extrahieren und die Pflanzenextrakte für die nachfolgende CE-Analyse vorzubereiten.