In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses in-vivo Matrix-Gel-Assays ist es, die Interaktion von Endothelzellen mit Parasiten zu untersuchen. Dieser Matrigel-Assay soll Forschern helfen, die wichtigsten Schritte der Androgenese zu untersuchen. Es wird auch die Identifizierung von Signalwegen ermöglichen, die für wichtige Schritte in der Blutgefäßbildung verantwortlich sind, sowie von Genen, deren Funktionsstörung zu Gefäßerkrankungen und anderen Aberrationen der Androgenese führen kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Bildung von Blutgefäßen in vivo zu untersuchen, an denen sowohl Endothelzellen als auch ihre Stützzellen, die Perizyten, beteiligt sind. Züchten Sie zunächst humane Endothel- und Parasitenzellkulturen auf 100-Millimeter-Platten mit 10 Millilitern des entsprechenden Mediums. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.

Um die Matrixgellösung für die Vermischung mit den Zellen vorzubereiten, tauen Sie einen Vorrat an Matrixgel über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Stellen Sie dann 1,5-Milliliter-Aliquots für die langfristige Lagerung bei minus 20 Grad Celsius oder bei vier Grad Celsius für bis zu zwei Wochen her. Für jeden experimentellen Plug werden 200 Mikroliter Matrixgel benötigt.

Ein vorrätiger Schlauch kann also sechs Stecker mit einem Überschuss von 25% versorgen. Jedes erforderliche Aliquot wird durch Zugabe von 15 Mikrolitern aufgetautem 100x beta-FGF-Material für die Verwendung vorbereitet. Mischen Sie das beta-FGF durch Pipettieren in die Lösung und inkubieren Sie es dann mindestens 30 Minuten lang auf Eis, bevor Sie Zellen hinzufügen.

Kühlen Sie zu diesem Zeitpunkt einige 28-Gauge-Insulinspritzen mit 1 ml für die Injektionen. Um die Zellen aus den Kulturplatten zu entnehmen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Nachdem Sie das PBS entfernt haben, fügen Sie einen Milliliter Trypsinlösung hinzu und stellen Sie die Platten für eine Minute in den Inkubator.

Pipettieren Sie dann zwei Milliliter Nährmedium über die Platten, um die Zellen zu lösen und das Medium in ein 15-Liter-Röhrchen zu füllen. Überprüfen Sie nun die Konzentration der Ansammlungen mit einem Hämozytometer. Bereiten Sie dann Aliquots von Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen vor.

Eine Kombination aus einer Million Endothelzellen und 200.000 Parasiten wird hier für die Versuchsgruppe verwendet. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellaliquote bei 400 g für fünf Minuten. Geben Sie dann das berechnete Volumen des Matrixgels zum Zellpellet und mischen Sie es mit leichtem Pipettieren, so dass kein Schaum entsteht, da keine Luftblasen injiziert werden können.

Halten Sie nun die Präparate auf Eis, bis die Mäuse zur Injektion bereit sind. Nachdem Sie eine Maus mit Isofluran betäubt und den anästhesierten Zustand mit einem Zehenkneifen bestätigt haben, befestigen Sie die Maus an das nicht rückatmende System, das Isofluran liefert, und legen Sie sie mit der Bauchseite nach unten auf das Heizkissen. Entferne nun etwa einen Quadratzentimeter Haare aus beiden seitlichen Hinterregionen.

Wischen Sie dann die exponierte Haut mit 70%igem Alkohol sauber. Als nächstes wird ein Milliliter der vorbereiteten Zelllösung in eine gekühlte Spritze gefüllt, was für vier Stopfen ausreicht. Um eine Injektion vorzunehmen, heben Sie die Rückenhaut an, um den Unterhautraum zu lokalisieren.

Injizieren Sie dann langsam 200 Mikroliter gleichmäßig in den subkutanen Raum hinter dem Brustkorb und entfernen Sie langsam die Nadel, um ein Auslaufen zu verhindern. Nach der Injektion bildet sich an der Stelle eine Beule. Wischen Sie die Stelle mit Alkohol ab und umreißen Sie die Beule dann mit einem Permanentmarker, damit sie später gefunden werden kann.

Wiederholen Sie dann den Injektionsvorgang auf der anderen Seite der Maus. Achten Sie darauf, alle Zellen innerhalb von drei Minuten zu injizieren, sonst fangen sie an, an der Spritze zu kleben. Der Injektionsschritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich der Matrix-Gel-Plug zwischen der Haut und den Muskelschichten bildet, damit der Plug eine gute Form behält und nicht diffus wird.

Bevor Sie mit der Injektion der nächsten Maus fortfahren, lassen Sie die injizierte Maus eine Minute lang auf dem Heizkissen bleiben, damit die Matrix Zeit zum Gelieren hat. Nach der Euthanasie stellen Sie die Maus auf den Operationstisch. Nachdem du alle nachgewachsenen Haare von der Injektionsstelle entfernt hast, suche die Markierungslinien, die die Position des Plugs identifizieren.

Machen Sie dann mit einer feinen chirurgischen Schere einen Schnitt entlang des markierten Randes des Plugs, senkrecht zur Haut und durch den darunter liegenden Muskel. Den Rand des markierten Randes vorsichtig umschneiden. Entfernen Sie dann den Plug und halten Sie ihn zwischen der Haut und den Muskelschichten eingeklemmt.

Spülen Sie den Stopfen sofort in einem kleinen Becherglas PBS ab, um das Blut zu entfernen. Legen Sie dann den gesamten Plug in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern 4%-Paraformaldehyd. Lassen Sie es 24 Stunden lang bei Raumtemperatur ohne Rühren fixieren.

Übertragen Sie die Stopfen am nächsten Tag für 24 Stunden in 25 Milliliter 70%iges Ethanol. Fahren Sie dann mit der Paraffineinbettung fort. Schnitte von Pfropfen, die nur Endothelzellen enthalten, zeigen, dass einige Gefäße nach 14 Tagen in-vivo nicht mit dem Blut des Wirts durchblutet werden.

Im Gegensatz dazu weisen Pfropfen, die sowohl Endothelzellen als auch Parasiten enthalten, nach 14 Tagen in-vivo viele durchblutete Gefäße auf. Diese Pfropfen haben Zellen, die positiv für die Aktinfärbung der glatten Muskulatur sind, siehe rot, unmittelbar neben CD31-positiven Endothelzellen, die in grün zu sehen sind. Daher können Parasiten eine wesentliche Rolle bei der Bildung von entstehenden Blutgefäßen spielen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese leistungsstarke In-vivo-Technik anwenden können, um die Bildung von Blutgefäßen in mehreren Zelltypen zu untersuchen. Diese Technik wird den Forschern den Weg ebnen, verschiedene Themen der Gefäßbiologie in Mausmodellen zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden, wie z. B. quantitative PCR und Western Immunblotting, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Veränderungen der Genexpression und Proteomik zu beantworten.

Diese leistungsstarke Technik wird es dem Forscher ermöglichen, in vivo zu untersuchen, wie Endothelzellen und Parasiten während der Bildung von Blutgefäßen interagieren. Dies ist ein wichtiger Schritt in der Androgenese. Diese leistungsstarke Technik wird es dem Forscher auch ermöglichen, andere Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen, die für das Verständnis von Gefäßerkrankungen wie unter anderem pulmonaler Hypertonie relevant sind.