Name: In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Matrix-Gel-Plug-Assay-Methode zur Untersuchung humaner Endothel-Perizyt-Interaktionen in vivo. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Signalwegen bei der Blutgefäßbildung.

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Dr. K. Yuan wurde durch einen American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) und den Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940) unterstützt. Dr. V. de Jesus Perez wurde durch einen Karriereentwicklungspreis der Robert Wood Johnson Foundation, einen NIH K08 HL105884-01 Award, einen Pulmonary Hypertension Association Award, einen Biomedical Research Award der American Lung Association und einen Translational Research and Applied Medicine unterstützt Auszeichnung der Stanford University.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Stanford University School of Medicine zugelassen. HINWEIS: Die Tiere sind unter anesthetization mit 3% Verdampfer Isofluran und 3% Zufuhr von O 2 -Gas. Die Verwendung von Tierarzt Salbe auf die Augen kann helfen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern. 1. Zellpräparation <ol><li> Wachsen humanen Endothel- und Perizyten Zellkulturen in 100 mm-Platten mit 10 ml der geeigneten Medien. Ersetzen Sie 10 ml frisches Medium alle 2 - 3 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz. <ol><li> Kultur Endothelzellen (ECs) in kompletten endothelialen Zellmedien (ECM), ergänzt mit Firma geliefert 5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Penicillin / Streptomycin und 10% endothelialen Zellwachstumsergänzung. </li><li> Kultur pericytes in komplette pericyte Medien (PM), ergänzt mit Unternehmen lieferte 2% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin und 10% pericyte Wachstum zu ergänzen. </li&gt; </ol></li><li> Bereiten Zellgemischen <ol><li> Berechne die erforderliche Anzahl von Zellen für die Versuchs- und Kontrollgruppen. HINWEIS: Jeder Stecker in der experimentellen Gruppe enthält eine Million (1 × 10 6) menschlichen ECs und zweihunderttausend (2 x 10 5) pericytes. Für die Kontrollgruppe enthält jeder Stecker 1,2 Millionen menschliche ECs nur. Die negative Kontrollgruppe hat nur Matrix-Gel. Jede Gruppe sollte mindestens vier Stecker umfassen, die zwei Mäuse erfordern würde, als Stecker können in jeder Seite eine Maus unteren Rücken injiziert werden. Drei Stecker würde als dreifacher Ausfertigung für das Experiment dienen und das vierte im Fall verwendet werden könnte, ausfällt. Bereiten Sie 25% mehr Zellen das zusätzliche Volumen des Gels entsprechen. </li><li> Sammeln und Zählen Zellen aus Kulturplatten. <ol><li> Zum Abnehmen Zellen, entfernen Medien und waschen Sie einmal mit Raumtemperatur 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen PBS, 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, und nach 1 min. Wash-Zellen von der Platte durch 2 Hinzufügenml Medium und sammeln sich in einem 15-ml-Tube. </li><li> Zählzelle einer Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen zu einem Pellet bei 400 xg für 5 min. Für die Versuchsgruppe, Zentrifuge sowohl ECs und Perizyten nach unten zusammen in einem Pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix Gelzubereitung <ol><li> Auftauen Matrix Gel vollständig bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht eine homogene Lösung zu erhalten. Kein Mischen erforderlich. </li><li> Aliquotieren Matrix Gel in 1,5-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. </li><li> Pre-Chill-sterile 1,5 ml-Röhrchen und 28 G 1 cc Insulinspritzen bei 4 ° C. Vorsicht: Halten Sie Matrix-Gel auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Mischen Sie kalt Matrix-Gel mit bFGF bei einem Volumenverhältnis von 1: 100 (Endkonzentration von bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF Stammlösung = 50 &amp; mgr; g / ml) Nach dem Mischen Matrix-Gel-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, Inkubation auf Eis für 30 - 60 min before Mischen mit den Zellen in Schritt 3.1. HINWEIS: auftauen Lager bFGF vor dem Mischen. Berechnen Sie die Anzahl der Stecker für die Injektion benötigt. Zum Beispiel erfordert jeder Stopfen 200 &amp; mgr; l Matrix Gel. Daher 25% Extra-Gel herzustellen. </li></ol> 3. Mix Matrix Gel mit Zellen <ol><li> Für jede Gruppe Zellpellet mit dem berechneten Volumen der Matrix-Gel mit bFGF (geeignete Zellzahl enthält). Vorsichtig mischen Schäumen zu vermeiden und in der 15-ml-Röhrchen auf Eis belassen, bis Mäuse zur Injektion hergestellt werden. </li></ol> 4. Maus-Vorbereitung <ol><li> Anesthetize 1 SCID - Mäuse für 5 min in 3% Isofluran plus 3% O 2 in einer Induktionskammer. Konzentrieren Sie sich auf eine experimentelle Gruppe oder 2-Mäuse, zu einer Zeit. </li><li> Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer, auf ein nach unten Bauchseite Heizkissen und schnell eine Schnauze Düse mit der Maus Gesicht über eine nicht-Rückatmungssystem befestigen Anästhesie während des inje zu liefernction Verfahren. Schalten Sie den Gasstrom aus der Induktionskammer zu dem Nicht-Rückatmungssystem und senken den Gasdruck auf 1,5% Isofluran und 1,5% O 2. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den beiden seitlichen Hinter Regionen (etwa 1 cm Durchmesser) mit einem Rasierapparat oder Enthaarungscreme. </li><li> Wischen Sie den Hautbereich mit einer 70% igen Alkohol-Pad. </li><li> Bringen Sie die Maus an die Induktionskammer und wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,4 mit der zweiten Maus. </li></ol> 5. Matrix-Gel-Injektion <ol><li> Bereiten Sie eine Maus für die Injektion von der Nichtrückatmungssystem befestigt und nach unten auf das Heizkissen Bauchseite platzieren. </li><li> Legen Sie das Matrix-Gel in eine vorgekühlte 28 G 1 cc-Insulinspritze eine Maus zu einem Zeitpunkt. <ol><li> Laden Sie die komplette 500 &amp; mgr; l Volumen der Matrix-Gel für zwei Stecker (200 ul pro Stecker plus 25% extra) in die Spritze. </li><li> Achten Sie darauf, die Matrix-Gel in die Mäuse innerhalb von 3 Minuten des Ladens der Zellen in die Spritze zu injizieren, um die ce zu verhindernlls aus zur Seite der Spritze Absetzen und Matrix Gel zu verhindern Innenseite der Spritze verfestigt. </li></ol></li><li> Heben Sie die Rückenhaut subkutanen Raum zu lokalisieren, zu injizieren dann 200 &amp; mgr; l der Matrix Gel langsam und gleichmäßig in den subkutanen Raum von der Rückseite hinteren Teil des Brustkorbs. </li><li> Entfernen Sie die Injektionsnadel langsam, wobei darauf geachtet, Matrix Gel zu verhindern, dass ein Auslaufen der Injektionsstelle. Eine Beule wird bei der Injektionsstelle bilden. Wischen Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte Injektion 5,2-5,5 auf der anderen Seite der Maus zurück, dann mit der Maus auf dem Rücken lässt 1 min Gelieren der Matrix-Gel auf dem Heizkissen zu ermöglichen. </li><li> Skizzieren Sie die beiden Höcker einen Permanent-Marker mit der Beule nach 14 Tagen zu identifizieren. Nachdem ich einige Haare wieder wächst, wird es leichter sein, die Beule zu finden. </li></ol> 6. Matrix Gelpfropfen Isolation: 14 Tage nach der Injektion <ol><li> Euthanize die Mäuse auf humane Weise durch das Tier ausgesetzts bis&gt; 5 min Kohlendioxid Inhalation durch zervikale Dislokation gefolgt Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Matrix Gelpfropfen auf der Rückseite der Maus. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig nachgewachsenen Haare um Injektionsstelle, wo der Stecker durch Wiederholen von Schritt 4.3 befindet. Die Markierungslinie zeigt die Größe der ursprünglichen Beule unter der Haut. </li><li> Excise den Stecker zusammen mit den umgebenden Haut und Muskelschichten angebracht auf den oberen und unteren Seiten des Steckers sind. <ol><li> Mit feinen chirurgischen Schere, machen einen Einschnitt an der markierten Grenze des Steckers, die senkrecht zur Haut ist und geschnitten, um den Muskel unterhalb der Stecker durch. Dann sorgfältig entlang der markierten Rand um den Umfang des Stopfens geschnitten. </li><li> Ziehen Sie den Stecker, halten es zwischen der Haut und Muskelschichten eingebettet ist. sofort gründlich in einem kleinen Becher mit 1x PBS überschüssiges Blut abzuwaschen. Der Stecker ist nun bereit, festgelegt werden (nächster Schritt, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Befestigen Sie die plug in 4% Paraformaldehyd. <ol><li> Platzieren Sie den gesamten Stecker, einschließlich der Haut und Muskelschichten, in einem 50-ml-Röhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne zu schaukeln. Am nächsten Tag übertragen Sie den Stecker in 25 ml 70% Ethanol für weitere 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. HINWEIS: Die beim Umgang Paraformaldehyd mit Vorsicht. Trag Handschuhe. </li></ol></li></ol> 7. Paraffin Prozess der Matrix Gelpfropfen <ol><li> Bereiten Sie den Stecker für die Paraffineinbettung. <ol><li> Richten Sie den Stecker wie in 1a gezeigt; Platzieren Sie den Stecker in eine Gewebekassette, so dass die Seite des Steckers nach oben zeigt und die beiden Haut und Muskelschichten sind über die Oberfläche des Gewebeblocks sichtbar, die zuerst während des Schneidens geschnitten wird. </li></ol></li><li> Paraffin einbetten den Stecker nach Standardparaffineinbettung Protokolle 13. </li><li> Schneiden Sie 8 - 10 &amp; mgr; m dicke Abschnitte aus der Gewebeblock und montieren auf Mikroskop accor gleitetding Standard Paraffin sectioning Protokolle 13. </li><li> Lagern Sie die Folien in einem kühlen, trockenen Ort bei Raumtemperatur, bis sie bereit für die Färbung. </li></ol> 8. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin - Färbung (H &amp; E) 13 <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l H &amp; E-Lösung auf den Abschnitt und Inkubation für 1 bis 5 min, oder bis es klare Kontrast zwischen blauen Kernen und rosa Zytoplasma in einer Zelle, wie bei 10-facher Vergrößerung unter einem aufrechten Lichtmikroskop betrachtet. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, jede H &amp; E-Lösung das Ziel berühren. </li><li> Wash H &amp; E-Lösung von Dunking die Folie in einen großen Becher Leitungswasser, dann legen Sie die Folie in einem Rack in den Becher und bündig mit fließendem Wasser für 2 Minuten von der Folie ab. </li><li> Move 9,8 Schritt die Folien zu montieren. </li></ol> 9. Stain Andere Folien für Menschen Kapillaren und Perizyten <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Kochen Sie die Abschnitte in Antigen-Retrieval-Lösung. <ol><li> In einem 2-Liter-Becher, bereiten Antigen-Retrieval-Lösung unter Verwendung von 1x Citratpuffer (pH 7,0) bei 95 ° C auf einem Heizblock Sieden. </li><li> Nach dem Kochen legen Sie die Folien in einem Metallgestell und unterzutauchen für 20 Minuten in die siedende Antigen-Retrieval-Lösung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Becher aus dem Heizblock mit den noch unter Wasser gleitet und die Lösung zu langsam für etwa 30 min auf Raumtemperatur zurück. </li><li> Legen Sie die Folien in 1x PBS bis zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Blockieren Sie die Abschnitte in Blockierungspuffer (1x PBS, 5% Ziegenserum, 00,3% Triton X-100). <ol><li> Zeichnen Sie einen hydrophoben Kreis um die Ränder eines jeden Abschnitts mit einem PAP Stift. </li><li> Legen Sie die Folien in einer Luftfeuchtigkeit Schale mit destilliertem Wasser auf dem Boden des Fachs. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l Blockierungspuffer auf die Abschnitte dafür, dass das gesamte Gewebe von Flüssigkeit bedeckt ist (kann mehr als 100 &amp; mgr; l erfordern). </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Puffer für 1 h blockiert. </li></ol></li><li> Inkubieren Abschnitte mit dem primären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit zwei primären Antikörpern jeden Abschnitt Sonde für CD31 (ECs) und smooth muscle actin (Perizyten) verdünnt in Verdünnungspuffer (1 × PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). HINWEIS: Hier, anti-CD31-Konzentration ist 01.50 und anti-Glattmuskelaktin Konzentration ist 1: 300. </li><li> Inkubieren der Abschnitte über Nacht bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l primärer Antikörper in einer Feuchtigkeitsfach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) für jeweils 5 min waschen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit sekundären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit einem Fluorophor konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper der Anti-CD31-Kaninchen-Antikörper in Verdünnungspuffer verdünnt, zu erkennen. <ol><li> HINWEIS: Die Glattmuskelaktin primären Antikörper bereits mit einem Cy3 Fluorophor konjugiert ist, so ist keine sekundäre Antikörper-Färbung benötigt. Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperkonzentration beträgt 1: 250. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h mit 100 ul sekundären Antikörper in der Feuchtigkeit Fach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST für jeweils 5 min waschen. </li><li> Montieren Sie die Dias. <ol><li> Pipette 2 - 3 Tropfen (~ 40 - 60 &amp; mgr; l) von Antifade Montagelösung mit DAPI Kernfärbung auf jedem Abschnitt. </li><li> Sanft legen Sie eine Nr. 1.5 Deckglas über die Abschnitte und Montagelösung, so dass die Flüssigkeit über die Abschnitte, um sich auszubreiten und zu den Ränderndas Deckglas. Verwenden Sie vorsichtig mit einem Finger zu drücken aus Luftblasen, die über den Abschnitt befinden können. </li><li> Lassen Sie die Folien für mindestens 1 Stunde trocknen, bevor Handhabung. </li></ol></li></ol> 10. Quantify Kapillar - Dichte und Struktur 14 <ol><li> Zähle die Anzahl der Kapillaren in H &amp; E gefärbte Schnitte, ausgedrückt als # / mm 2. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern an einem aufrechten Lichtmikroskop unter 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Die Kapillaren als Rohre mit roten Blutkörperchen gefüllt identifiziert. </li><li> Alternativ kann anstelle der manuellen Zählen Kapillaren verwenden Bildanalysesoftware (zB Wimasis Image Analysis) verschiedene Angiogenese Parameter wie Gefäßzahl, mittlere Fahrzeuglänge und Durchmesser und Verzweigungspunkte zu quantifizieren. </li></ol></li><li> Analysieren kapillare Struktur in Immunofluoreszenz-gefärbten Schnitten. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskopmit FITC und TxRed Filterwürfel. <ol><li> Verwenden Sie ein FITC Würfel Bild ECs durch Anregung bei 488 nm Wellenlänge und mit einem TxRed Würfel Bild pericytes durch Anregung bei 594 nm Wellenlänge. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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Es sind keine konkurrierenden finanziellen Interessen enthalten.

Die Matrix Gelpfropfen Assay hat eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Bewertung der Genregulation in Angiogenese, angiogene und antiangiogene Verbindungen in vivo erwiesen, und in vitro - Tests zu ergänzen. Hier beschreiben wir im Detail eine neuartige Matrix Gelpfropfen Test der menschlichen Angiogenese, die die Interaktion zwischen Endothelzellen und Perizyten während Gefäßbildung untersucht. Es gibt einige neuartige und wichtige Schritte in diesem Protokoll. Die ...

Die Angiogenese ist der Prozess , durch den neue Blutgefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz gebildet werden 1 und steht im Mittelpunkt der laufenden Forschung in vielen Bereichen von der normalen Entwicklung von Krankheiten reichen. Dieser dynamische Prozess beinhaltet die Proliferation und Migration von endothelialen Zellen (ECs) und die Rekrutierung von Perizyten eines Gefäßrohr zu konstruieren , die in Richtung auf die Seite gerichtet ist , die zwei Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr benötigt. Zur Untersuchung dieser Prozess einen ebenso dynamischen Test erfordert, vor allem eine, die die dreidimensionale Natur der Schlauchbildung rekapitulieren kann. In - vitro - 3D - Matrix - Assays wurden entwickelt , um diesen Bedarf zu adressieren und gearbeitet haben und Forscher zu ermöglichen , die einzelnen Schritte in Raum und Zeit zu definieren , in denen die Angiogenese Platz 3 nimmt, 4, 5, 6. Allerdings sind diese in vitro 3D - Matrix - Modelle beschränkt auf das Studium nicht-durchbluteten Gefäßen eined fehlt daher kritische Komponenten relevant für die Prozess der Angiogenese (zB Wachstum zirkulierenden und hemmenden Faktoren, unnatürliche Spannung / Kräfte über das Gefäßbett) und nicht die komplexe Umwelt in lebendem Gewebe zu simulieren. Um dieser Einschränkung, mehrere in - vivo - Angiogenese - Assays wurden 7 entwickelt, einschließlich der Matrix Gelpfropfen Assay, der im Mittelpunkt unseres Berichts wird 8, 9. Die Matrix Gelpfropfen Assay ist ein etabliertes in vivo - Angiogenese - Test, der den Forschern anspricht , wie es eine robuste Plattform bietet die Rollen von verschiedenen Zellen und Substanzen in die Angiogenese zu testen. Matrix-Gel ist ein kommerziell erhältlicher Basalmembran Lösung, die von dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom-Zelllinie sekretiert wird, die bei 37 ° C in ein gelartiges Material erstarrt. Die Matrix-Gel kann mit Zellen und / oder Substanzen, wie Wachstumsfaktoren, gemischt werden und injesubkutan in die Maus cted. Der Host-ECs wird den Stecker über 14 Tage überfallen, ein Gefäßnetz bilden und mit dem Blut des Wirts durchblutet sind. Bislang Matrix Gelpfropfen Assays ausschließlich auf die Untersuchung der endothelialen Zellverhalten während der Angiogenese konzentriert sich jedoch auf bestem Wissen ist keine Anstrengung noch aus, um festzustellen, ob dieser Assay zur Kokultur Endothelzellen und Perizyten verwendet werden können, zu untersuchen, wie sich diese beiden Zelltypen während der Angiogenese zusammenwirken. Insbesondere ist wertvoll zwischen ECs und Perizyten die Beziehung Verständnis für Krankheiten zu studieren , wo Blutgefäßverlust pathologisch, einschließlich mikrovaskulären Ischämie und periphere Gefäßerkrankungen 10, 11, 12. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Perizyten Menschen stamm an die Matrix Gelmischung zusammen mit menschlichen ECs und Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) einführt. Diese Mischung kann dann i subkutan injiziert werdenn die dorsum von SCID-Mäusen die Bildung von voll funktionsfähig, pericyte beschichtet, Hybridgefäße zu ermöglichen. Unser Protokoll beschreibt, wie Matrix Gelpfropfen, die menschliches ECs vorzubereiten entweder mit oder ohne menschliches pericytes, Platzierung in SCID-Mäuse und wie die histologischen Schnitte für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/0,53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellmedien (ECM) Kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>enthält Medien, EC-Wachstumszusatz und Penicillin/Streptomycin, jeweils in der entsprechenden Menge zum einfachen Mischen geliefert</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) Kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>Enthält Medien, Pericyte Growth Supplement und Penicillin/Streptomycin, die jeweils in dem geeigneten Volumen zum einfachen Mischen</td></tr><tr><td>primärer humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen</td> geliefert werden<td>. Pulmonale Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>Dieser Zelltyp ist auch kommerziell erhältlich. Zellen, die an der Passage 1-4</td></tr><tr><td>verwendet werden primäre humane Lungenperizyten</td><td>Pulmonale Hypertonie Breakthrough Initiative</td><td></td><td>Dieser Zelltyp ist nicht kommerziell erhältlich, aber Gehirn-Paricyten sind es.&nbsp; Zellen, die an der Passage 1-4</td></tr><tr><td>verwendet werden bFGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Stammlösung beträgt 50 μm; g/ml in 0,1 % BSA in PBS, Aliquote bei 50 &mu; l und gelagert bei -20 Grad</td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Spritze</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. Der SCID IL2R Gamma-Knockout-Stamm ist der beste Stamm; Alter von 4-6 Wochen</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, steril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Schraubröhrchen, steril</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair Haarentfernungscreme</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD31-Primärantikörper</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>Arbeitslösung ist 1:50</td></tr><tr><td>Anti-Human-Aktin CY3 primärer fluoreszierender Antikörper</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Arbeitslösung ist 1:300</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper; 488/grün</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Arbeitslösung ist 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI Lösung</td><td>Zelle Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 1,5 Deckgläser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Citratpuffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra feine chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (Paraformaldehyd)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekassetten</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in - vivo - studie der menschlichen endothelial-pericyte interaktion mit dem matrix - gel - plug - assay in der maus

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenese ist der Prozess, durch den neue Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen gebildet werden. Das Wachstum neuer Gefäße erfordert eine koordinierte Proliferation, Migration und Ausrichtung von Endothelzellen, um röhrenförmige Strukturen zu bilden, gefolgt von der Rekrutierung von Perizyten, um die Wandmalerei zu stützen und die Gefäßreifung zu erleichtern. Derzeitige In-vitro-Zellkulturansätze können die komplexe biologische Umgebung, in der Endothelzellen und Perizyten interagieren, um funktionsfähige Gefäße zu produzieren, nicht vollständig reproduzieren. Wir präsentieren eine neuartige Anwendung des in vivo Matrix-Gel-Plug-Assays zur Untersuchung von Endothel-Perizyten-Interaktionen und der Bildung funktioneller Blutgefäße anhand von Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienzmutation (SCID). Kurz gesagt, wird das Matrixgel mit einer Lösung gemischt, die Endothelzellen mit oder ohne Perizyten enthält, gefolgt von einer Injektion in den Rücken von anästhesierten SCID-Mäusen. Nach 14 Tagen werden die Matrix-Gel-Pfropfen entfernt, fixiert und für die histologische Analyse geschnitten. Die Länge, Anzahl, Größe und das Ausmaß der Perizytenbedeckung reifer Gefäße (definiert durch das Vorhandensein roter Blutkörperchen im Lumen) können mit Hilfe kommerzieller statistischer Plattformen quantifiziert und zwischen Versuchsgruppen verglichen werden. Neben seiner Verwendung als Angiogenese-Assay kann dieser Matrix-Gel-Plug-Assay zur Durchführung genetischer Studien und als Plattform für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll es den Forschern ermöglichen wird, verfügbare In-vitro-Assays für die Untersuchung von Endothel-Perizyten-Wechselwirkungen und deren Relevanz für die systemische oder pulmonale Angiogenese zu ergänzen.

Repräsentative H &amp; E und Immunfluoreszenzanfärbung von Matrix Gelpfropfen Abschnitte sind in Abbildung 2 Abschnitte von EG nur Stecker einige Schiffe angezeigt werden gezeigt, die meist nicht durchblutet (Abbildung 2 oben links, schwarze Pfeile) , während Stecker , die sowohl ECs und Perizyten Anzeige mehrere perfundierter Schiffe mit größerem Durchmesser und vollständige pericyte Abdeckung, wie durch positive SMA Färbung unmittelbar angrenzend an CD...

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses In-vivo-Matrixgel-Assays besteht darin, die Wechselwirkung von Endothelzellen mit Parasiten zu untersuchen. Dieser Matrigel-Assay soll Forschern helfen, die wichtigsten Schritte der Androgenese zu analysieren. Außerdem ermöglicht er die Identifizierung von Signalwegen, die für wesentliche Schritte bei der Blutgefäßbildung verantwortlich sind, sowie von Genen, deren Funktionsstörung zu vaskulären Erkrankungen und anderen Abweichungen der Androgenese führen kann.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie uns die Untersuchung der in-vivo-Bildung von Blutgefäßen ermöglicht, an der sowohl Endothelzellen als auch ihre Stützzellen, die Perizyten, beteiligt sind. Zunächst kultivieren Sie humane Endothelzellen und Parasitenzellen auf 100-Millimeter-Platten mit jeweils 10 Milliliter geeignetem Kulturmedium. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.Um die Matrixgel-Lösung vorzubereiten, die mit den Zellen gemischt wird, tauen Sie eine Matrixgel-Probenvorratslösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Bereiten Sie anschließend Aliquots von jeweils 1,5 Milliliter für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius oder für die Lagerung bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen vor. Jeder experimentelle Gel-Plug benötigt 200 Mikroliter Matrixgel.Ein gefüllter Reagenzglas kann somit sechs Plugs mit einem Überschuss von 25 % versorgen. Bereiten Sie jeden benötigten Aliquot durch Zugabe von 15 Mikrolitern aufgetauten 100x Beta-FGF-Stammlösung vor. Verrühren Sie den Beta-FGF durch Pipettieren, und inkubieren Sie danach mindestens 30 Minuten auf Eis, bevor Sie die Zellen hinzufügen.Zu diesem Zeitpunkt einige 1-ml-Insulinspritzen mit 28er Kanüle zum Injizieren kühlen. Um die Zellen aus den Kulturplatten zu gewinnen, das Medium entfernen und die Zellen einmal mit PBS waschen. Nach dem Entfernen des PBS ein Milliliter Trypsin-Lösung hinzufügen und die Platten für eine Minute in den Inkubator zurückstellen.Dann pipettieren Sie zwei Milliliter Kulturmedium über die Platten, um die Zellen abzulösen, und sammeln das Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Überprüfen Sie nun die Konzentration der Proben mithilfe eines Hämozytometers. Bereiten Sie anschließend Aliquots der Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen vor.Hier wird für die experimentelle Gruppe eine Kombination aus einer Million Endothelzellen und 200.000 Parasiten verwendet. Zentrifugieren Sie danach die Zellaliquote bei 400g für fünf Minuten. Geben Sie anschließend das berechnete Volumen an Matrixgel zum Zellpellet hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren, sodass kein Schaum entsteht, da Luftblasen nicht injiziert werden dürfen.Halten Sie die Vorbereitungen nun auf Eis, bis die Mäuse bereit zur Injektion sind. Nachdem ein Maus mit Isofluran anästhesiert wurde und der anästhesierte Zustand mittels Zehenquetschung bestätigt wurde, befestigen Sie die Maus am Nicht-Rückatmungssystem, das Isofluran liefert, und legen Sie sie auf die Heizplatte, Bauchseite nach unten. Entfernen Sie nun jeweils etwa einen Quadratzentimeter Fell aus beiden seitlichen Hinterregionen.Reinigen Sie anschließend die freiliegende Haut mit 70 % Alkohol. Danach füllen Sie einen Milliliter der hergestellten Zellsuspension in eine gekühlte Spritze, was für vier Plugs ausreicht. Zum Durchführen einer Injektion heben Sie die Rückenhaut an, um den subkutanen Raum zu lokalisieren.Injizieren Sie dann langsam 200 Mikroliter gleichmäßig in den subkutanen Raum hinter dem Rippenkorb und ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um ein Auslaufen zu verhindern. Nach der Injektion bildet sich an der Einstichstelle eine Schwellung. Reinigen Sie die Stelle mit Alkohol und markieren Sie die Schwellung mit einem dauerhaften Stift, damit sie später wieder gefunden werden kann.Wiederholen Sie dann das Injektionsverfahren auf der anderen Seite der Maus. Achten Sie darauf, alle Zellen innerhalb von drei Minuten zu injizieren, da sie andernfalls an der Spritze haften bleiben. Der Injektionsschritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich der Matrixgel-Plug zwischen Haut- und Muskelschicht bildet, sodass der Plug eine gute Form behält und nicht diffus wird.Bevor mit der Injektion des nächsten Mäuses fortgefahren wird, sollte die injizierte Maus eine Minute lang auf der Heizplatte verbleiben, damit die Matrix Zeit zum Gelieren hat. Nach der Tötung die Maus auf dem Operationsstadium präparieren. Nach dem Entfernen eventuell nachgewachsener Haare an der Injektionsstelle die Markierungsstriche suchen, die die Position des Pfropfens kennzeichnen.Danach mit feinen chirurgischen Scheren einen Schnitt entlang der markierten Grenze des Gewebestückes vornehmen, senkrecht zur Haut und bis zum darunterliegenden Muskel. Vorsichtig entlang des peripheren Randes der markierten Begrenzung schneiden. Anschließend das Gewebestück entfernen, wobei es zwischen Haut- und Muskelschicht belassen wird.Spülen Sie den Pfropfen sofort in einem kleinen Becher mit PBS ab, um das Blut zu entfernen. Anschließend geben Sie den gesamten Pfropfen in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern 4 % Paraformaldehyd. Lassen Sie die Probe 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne jegliche Agitation fixieren.Am nächsten Tag überführen Sie die Gewebestücke in 25 Milliliter 70 %igem Ethanol für 24 Stunden. Anschließend führen Sie die Paraffineinbettung durch. Schnitte von Gewebestücken, die nur Endothelzellen enthalten, zeigen, dass einige Gefäße nach 14 Tagen in vivo nicht mit dem Blut des Wirts durchströmt werden.Im Gegensatz dazu weisen Plugs, die sowohl Endothelzellen als auch Parasiten enthalten, nach 14 Tagen in vivo viele durchblutete Gefäße auf. In diesen Plugs finden sich Zellen, die positiv auf die Färbung für glatte Muskel-Aktin (rot dargestellt) sind und unmittelbar benachbart zu CD31-positiven Endothelzellen (grün dargestellt) liegen. Daher könnten Parasiten eine wesentliche Rolle bei der Neubildung von Blutgefäßen spielen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese leistungsstarke In-vivo-Technik anwenden können, um die Blutgefäßbildung unter Verwendung mehrerer Zelltypen zu untersuchen. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, verschiedene Themen der Gefäßbiologie in Mausmodellen zu erforschen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können auch andere Methoden wie die quantitative PCR und die Western-Immunoblotting-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise Veränderungen in der Genexpression und der Proteomik.Diese leistungsstarke Technik ermöglicht es dem Forscher, in vivo zu untersuchen, wie Endothelzellen und Parasiten während der Blutgefäßbildung interagieren, was ein entscheidender Schritt in der Androgenese ist. Diese leistungsstarke Technik ermöglicht es dem Forscher außerdem, andere zelluläre Wechselwirkungen zwischen Zellen zu untersuchen, die für das Verständnis vaskulärer Erkrankungen wie beispielsweise der pulmonalen Hypertonie und anderer von Bedeutung sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

In diesem Video demonstrieren wir die Echtzeit-Visualisierung von Blutzell-Endothel-Wechselwirkungen in den Mesenterialvenen eines Mausmodells, das intraperitoneal mit Lipopolysaccharid injiziert wurde.

Intravitalmikroskopie zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel in einem Entzündungs-Mausmodell

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen...

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Wir beschreiben einen Matrigel-Plug-Assay, um das angiogene Potenzial eines Pools von Faktoren zu veranschaulichen, die von Krebszellen sezerniert werden, unter Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsmodalitäten, Ultraschall und Endomikroskopie. Das Matrigel, ein extrazelluläres Matrix (ECM)-Imigel, wird verwendet, um den Wirt (die Maus) mit angiogenen Faktoren vertraut zu machen, die an das konditionierte Medium (C.M.) sezerniert werden.

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Erfahren Sie die Matrix-Gel-Plug-Assay-Methode zur Untersuchung humaner Endothel-Perizyt-Interaktionen in vivo. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Signalwegen bei der Blutgefäßbildung.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

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