Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, die Mechanismen der Induktion der Gliedmaßen im Hühnerembryo aufzuklären, indem verhindert wird, dass Signalmoleküle aus dem medialen Gewebe zu den Zellen im Mesoderm der lateralen Platte diffundieren, und deren Einfluss auf die Genexpression untersucht wird. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. welche induktiven Signale es gibt, um die Initiierung der Gliedmaßenknospen zu kontrollieren. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass der Hühnerembryo für chirurgische Manipulationen zugänglich und sehr robust ist, außerdem dient die nicht operierte kontralaterale Kontrolle der Gliedmaßenknospe als sehr nützliche interne Kontrolle.

Susan Wilde wird das Verfahren demonstrieren. Schneiden Sie zunächst ein 1 cm großes quadratisches Stück 0,013 mm dicke Aluminiumfolie ab und sterilisieren Sie es, indem Sie es mit 70% Ethanol abwischen. Legen Sie dann das Quadrat auf eine 6 cm große sterile Petrischale aus Kunststoff.

Um statische Aufladung zu verhindern, entsorgen Sie den Deckel und machen Sie einen neuen Deckel für die Schüssel aus der gleichen Folie. Setzen Sie dann die Petrischale auf ein Raster unter einem binokularen Mikroskop, das auf 1,6-fache Vergrößerung eingestellt ist. Schneiden Sie mit einem kleinen Skalpell mit der Nummer 15 1,3 mm breite Streifen der Folie ab, die 2 mm lang sind.

Trennen Sie die Folienstreifen mit zwei Paaren Uhrmacherzangen der Nummer vier. Machen Sie dann eine rechtwinklige Biegung in der Mitte der Folienbarriere, so dass sie einem Scharnier ähnelt. Richten Sie die Barrieren in der Mitte der Petrischale so aus, dass eine Seite flach gegen die Schale und die andere nach oben aus der Schale zeigt, und bereiten Sie 20 oder mehr Barrieren vor dem Operationstag vor.

Setzen Sie den Foliendeckel über die Schüssel und bewahren Sie die Barrieren an einem Ort auf, an dem sie nicht gestört werden. Halten Sie das Ei auf der Seite liegend, halten Sie eine starke Pinzette vom Typ AA fest und stechen Sie mit einer kontrollierten Stichbewegung in das stumpfe Ende des Eies mit dem Luftsack, während Sie das Ei mit der freien Hand halten. Stellen Sie sicher, dass die Innenschalenmembran aufgebrochen ist.

Nehmen Sie dann das Ei in beide Hände und drehen Sie es um 180 Grad entlang seiner horizontalen Achse. Nehmen Sie als Nächstes ein Stück durchsichtiges Klebeband, etwa 5 cm im Quadrat, und kleben Sie es dicht über die oberste Oberfläche des Eies, um zu verhindern, dass die Eierschale beim Öffnen des Eies auf den Embryo bröckelt. Verwende eine gebogene Schere, um die Schale und die zugehörigen inneren Zellmembranen in der Mitte des obersten Teils des Eies vorsichtig zu durchbrechen.

Machen Sie mit einer Klinge der Schere ein sehr kleines Loch, damit Luft in die Eizelle über dem Embryo eindringen kann. Vergrößern Sie mit der Schere das Loch in der Schale auf einen Kreis mit einem Durchmesser von ca. 1 cm. Entferne dieses Stück eigroße Schale aus dem Ei.

Decken Sie das Loch auf dem Ei mit einem Stück durchsichtigem Klebeband von ca. 5 cm im Quadrat ab. Drücken Sie das Klebeband, um es nur an den Rand des Lochs zu kleben und das restliche Klebeband frei zu lassen. Das freie Klebeband kann dann gegriffen werden, um das Ei leicht zu entsiegeln.

Nehmen Sie einen Embryo im Stadium 15 aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf eine Eiablage unter einem binokularen Mikroskop, das auf eine 3,2-fache Vergrößerung oder höher eingestellt ist. Entfernen Sie dann die obere Schicht des durchsichtigen Klebebandes. Machen Sie mit einem Mikromesser aus Stahl einen Schnitt durch die Vitellinmembran und platzieren Sie das Mesoderm seitlich neben den Somiten 26-32 auf der rechten Seite des Embryos.

Nehmen Sie die Barriere mit der Mikrozange Nummer 5 an einem Ende auf und drehen Sie die Barriere, um das freie Ende in den Schnitt einzuführen. Verschließen Sie das Ei so schnell wie möglich mit durchsichtigem Klebeband und legen Sie es wieder in den Brutkasten. Wenn eine Perle in Verbindung mit einer Barriere eingesetzt werden soll, bereiten Sie zunächst in Retinsäure getränkte Kügelchen her, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Nehmen Sie als nächstes die Perle und ein Paar Mikrozangen Nummer 5 und führen Sie sie in die Schnittfläche des Mesoderms lateral auf der distalen Seite des Schnitts ein. Führen Sie dann die Barriere in den Einschnitt proximal der Perle ein. Verschließen Sie das Ei und legen Sie es umgehend wieder in den Brutschrank.

Wenn eine oder mehrere Perlen ohne Barriere eingeführt werden sollen, machen Sie den langen Schnitt nicht. Machen Sie stattdessen einen kleinen Schnitt durch die Vitellinmembran und in das Mesoderm der lateralen Platte an der Stelle, an der die Perle platziert werden soll. Nehmen Sie dann die Perle und die Mikrozange Nummer 5 und führen Sie sie in das Loch in der Seitenplatte Mesoderm ein.

Schiebe sie mit den geschlossenen Enden der Pinzette noch ein Stück weiter hinein. Nehmen Sie einen Embryo im zehnten Stadium mit Fenstern aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf eine Eiablage unter einem binokularen Mikroskop, das auf eine 3,2-fache Vergrößerung oder höher eingestellt ist, falls gewünscht. Dann machen Sie mit einem Mikromesser aus Stahl einen Schnitt durch die Vitellinmembran und das Mesoderm der lateralen Platte, lateral des primitiven Streifens am kaudalen Ende des Embryos in einer Linie mit den Somiten, die etwa sechs Somitenlängen lang sind.

Nehmen Sie dann die Barriere mit einer Mikrozange Nummer 5 auf, die am Ende aus der Petrischale herausragt, und drehen Sie die Hand, um das freie Ende der Barriere in den Schnitt einzuführen. Verschließen Sie das Ei so schnell wie möglich mit durchsichtigem Klebeband und legen Sie es wieder in den Brutkasten. Wenn eine Perle ohne Barriere eingeführt werden soll, machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Vitellinmembran und in das Mesoderm der lateralen Platte an der Stelle, an der die Perle platziert werden soll.

Nehmen Sie dann die Perle und ein Paar Mikropinzetten Nummer 5 und führen Sie sie in das Loch in der lateralen Platte Mesoderm ein. Zum Schluss schiebst du sie mit den geschlossenen Enden der Pinzette noch etwas weiter hinein. Hier ist die Barriereposition auf Höhe der präsumtiven Beine der Somiten 26-32 in einem Embryo im Stadium 15 dargestellt.

Diese Barriere führt dazu, dass sowohl die Fhf10- als auch die Fhf8-Expression im Bereich der Beinknospen auf der operierten Seite fehlen und auf der nicht operierten linken Seite vorhanden sind. Die Tbx4-Expression wird jedoch sowohl im Stadium 19 als auch im Stadium 23 auf der operierten Seite beobachtet. Dies impliziert, dass die Tbx4-Expression allein nicht ausreicht, um das Auswachsen der hinteren Gliedmaßen aus dem lpm zu initiieren.

Wenn mit Rhetinsäure getränkte Kügelchen distal zur Barriere in Stufe 15 platziert werden, werden Tbx4, Fgf10 und Fgf8 alle auf der operierten Seite exprimiert, wie sie sich auf der linken Kontrollseite befinden. Daher ist in der normalen Entwicklung die Retinsäure aus den Somiten unerlässlich, bevor das Wachstum der Gliedmaßenknospen eingeleitet werden kann. Nachdem Du Dir dieses Video angesehen hast, solltest Du ein gutes Verständnis dafür haben, wie Du undurchlässige Barrieren und Kandidaten für getränkte faktorisierte Kügelchen verwenden kannst, um zu untersuchen, wie induktive Signale die Initiierung der Gliedmaßenknospen im Hühnerembryo regulieren.