Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Das Ziel dieses chirurgischen Eingriffs besteht darin, die Mechanismen der Gliedmaßeninduktion im Hühnerembryo aufzuklären, indem verhindert wird, dass Signalmoleküle von medialen Geweben zu Zellen im lateralen Mesodermplatte diffundieren, und indem deren Einfluss auf die Genexpression untersucht wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise welche induktiven Signale die Initiierung des Gliedmaßenanlagen steuern. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass das Hühnerembryo für chirurgische Manipulationen gut zugänglich und sehr robust ist; außerdem dient die nicht operierte kontralaterale Kontrollanlage als äußerst nützliche interne Kontrolle.

Susan Wilde wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie damit, ein 1 cm großes Quadrat aus 0,013 mm dickem Aluminiumfolie auszuschneiden und es durch Abwischen mit 70 %igem Ethanol zu sterilisieren. Anschließend legen Sie das Quadrat auf eine sterile 6 cm große Kunststoff-Petri-Schale.

Um statische Aufladung zu vermeiden, entsorgen Sie den Deckel und fertigen Sie einen neuen Deckel für die Schale aus derselben Folie an. Stellen Sie anschließend die Petrischale auf ein Objektmikrometer unter einem Binokularmikroskop mit 1,6facher Vergrößerung. Verwenden Sie ein kleines Skalpell mit Nummer-15-Klinge, um 1,3 mm breite Streifen der Folie mit einer Länge von 2 mm zu schneiden.

Trennen Sie die Folienstreifen mit zwei Paar Uhrmacherzangen der Größe vier. Biegen Sie anschließend die Mitte der Folienbarriere im rechten Winkel so, dass sie einem Scharnier ähnelt. Richten Sie die Barrieren in der Mitte der Petrischale aus, wobei eine Seite flach auf der Schale liegt und die andere Seite nach oben aus der Schale herausweist. Bereiten Sie am Tag vor dem Experiment 20 oder mehr Barrieren vor.

Legen Sie den Folienverschluss über die Schale und bewahren Sie die Barrieren an einem Ort auf, wo sie nicht gestört werden. Fassen Sie, während das Ei seitlich liegt, ein Paar kräftige Pinzette des Typs AA fest an und stechen Sie kontrolliert in das stumpfe Ende des Eis, das den Luftbeutel enthält, wobei Sie das Ei mit der freien Hand halten. Stellen Sie sicher, dass die innere Schalenhaut durchbrochen wurde.

Nehmen Sie als Nächstes das Ei mit beiden Händen und drehen Sie es um 180 Grad entlang seiner horizontalen Achse. Danach nehmen Sie ein Stück durchsichtiges Klebeband, etwa 5 cm quadratisch, und kleben es dicht über die oberste Oberfläche des Eis, um zu verhindern, dass die Eierschale beim Öffnen des Eis auf den Embryo bröckelt. Verwenden Sie eine Schere mit gebogenen Spitzen, um vorsichtig durch die Schale und die zugehörigen inneren Zellmembranen in der Mitte des obersten Teils des Eis zu schneiden.

Erzeugen Sie mit einer Scherenklinge ein sehr kleines Loch, damit Luft über dem Embryo in das Ei eindringen kann. Vergrößern Sie mit der Schere das Loch in der Schale zu einem Kreis mit einem Durchmesser von etwa 1 cm. Entfernen Sie dieses Stück Eischale aus dem Ei.

Bedecken Sie das Loch im Ei mit einem etwa 5 cm² großen Stück durchsichtigem Klebeband. Drücken Sie das Band nur am Rand des Lochs fest, sodass der restliche Teil des Bandes lose bleibt. Der lose hängende Teil kann dann leicht angefasst werden, um das Ei problemlos wieder zu öffnen.

Nehmen Sie ein Embryo im Stadium 15 aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf eine Eiruhestütze unter ein Binokularmikroskop, das auf eine 3,2-fache Vergrößerung oder höher eingestellt ist. Entfernen Sie anschließend die obere Schicht durchsichtigen Klebebands. Führen Sie mit einem Stahl-Mikromesser einen Schnitt durch die Vitellinmembran und das laterale Mesoderm neben den Somiten 26–32 auf der rechten Seite des Embryos.

Nehmen Sie die Barriere mit Nr. 5 Mikrozangen an einem Ende auf und drehen Sie sie, um das freie Ende in den Einschnitt einzuführen. Versiegeln Sie das Ei so schnell wie möglich mit durchsichtigem Klebeband und stellen Sie es in den Inkubator zurück. Falls eine Kugel zusammen mit einer Barriere eingebracht werden soll, bereiten Sie zunächst mit Retinsäure getränkte Kugeln gemäß der beiliegenden Textanleitung vor.

Nehmen Sie anschließend die Perle und ein Paar Mikrozangen der Größe 5 und führen Sie sie in die Schnittfläche des seitlichen Placodenmesoderms auf der distalen Seite des Einschnitts ein. Danach wird die Barriere in den Einschnitt proximal zur Perle eingeführt. Versiegeln Sie das Ei und bringen Sie es umgehend in den Inkubator zurück.

Wenn eine Perle oder mehrere Perlen ohne Barrieren eingesetzt werden sollen, führen Sie keinen langen Einschnitt durch. Stattdessen führen Sie einen kleinen Einschnitt durch die Vitellinmembran und in das laterale Plattenmesoderm an der Stelle durch, an der die Perle platziert werden soll. Nehmen Sie dann die Perle und eine Nr. 5 Mikrozange und führen Sie sie in die Öffnung im lateralen Plattenmesoderm ein.

Schieben Sie es mit den geschlossenen Enden der Pinzette etwas weiter hinein. Nehmen Sie einen fenestrierten Embryo des Stadions zehn aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf eine Eierhalterung unter ein Binokularmikroskop, das auf eine 3,2-fache Vergrößerung oder höher, falls gewünscht, eingestellt ist. Anschließend machen Sie mit einem Stahl-Mikromesser einen Schnitt durch die Vitellinmembran und das laterale Plattenmesoderm seitlich zur Keimbahn am kaudalen Ende des Embryos entlang der Somiten, etwa über die Länge von sechs Somiten.

Nehmen Sie anschließend die Barriere mit einer Nr. 5 Mikrozange am aus der Petrischale herausragenden Ende auf und drehen Sie die Hand, um das freie Ende der Barriere in den Einschnitt einzuführen. Versiegeln Sie das Ei so schnell wie möglich mit durchsichtigem Klebeband und bringen Sie es zurück in den Inkubator. Wenn eine Perle ohne Barriere eingeführt werden soll, führen Sie einen kleinen Einschnitt durch die Vitellinmembran hindurch in das laterale Plattenmesoderm an der Stelle, an der die Perle platziert werden soll.

Danach nehmen Sie die Perle und ein Paar Mikrozangen der Größe 5 und führen sie in das Loch im lateralen Plattenmesoderm ein. Schließlich schieben Sie sie mit den geschlossenen Enden der Zange etwas weiter hinein. Gezeigt ist hier die Barriereposition auf der Höhe der beinbildenden Somiten 26–32 in einem Embryo des Stadiums 15.

Diese Barriere führt dazu, dass sowohl die Expression von Fhf10 als auch die von Fhf8 im Beinanhängegebiet auf der operierten Seite fehlt, während sie auf der nicht operierten linken Seite vorhanden ist. Die Expression von Tbx4 hingegen wird sowohl im Stadium 19 als auch im Stadium 23 auf der operierten Seite beobachtet. Dies bedeutet, dass die Expression von Tbx4 allein nicht ausreicht, um das Wachstum des Hinterbeins aus dem seitlichen Plattenmesoderm (lpm) zu initiieren.

Wenn mit Retinsäure behandelte Kügelchen distal zur Barriere im Stadium 15 platziert werden, werden Tbx4, Fgf10 und Fgf8 auf der operierten Seite ebenso exprimiert wie auf der linken Kontrollseite. Daher ist Retinsäure aus den Somiten in der normalen Entwicklung unerlässlich, bevor die Anlage des Gliedmaßenknospen beginnen kann. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man undurchlässige Barrieren und mit Wirkstoffen behandelte Kügelchen verwendet, um zu untersuchen, wie induktive Signale die Initiierung des Gliedmaßenknospen im Hühnerembryo regulieren.