Name: Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie ein kostengünstiges ex vivo Retina-Modell zur Bewertung von Blut-Retina-Barriere-Schäden und Lipoxin A4 als potenzielles Medikament. Diese Methode ermöglicht schnelles Drug Screening in der Neurodegenerationsforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) ist für ihre aufrichtige Hilfe bei der Bereitstellung von Schweineaugen bekannt.

Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee gegebenenfalls durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die Stabilisierungsmedien mit 75% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 25% Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS). Gut mischen, aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und durch Autoklavieren sterilisieren. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Erwärmen Sie den PBS auf 37 ° C vor dem Experiment (5 ml pro Vertiefung). </li><li> Herstellung von 10%, 20% und 30% Saccharose in PBS. Filter alle Lösungen einzeln über getrennte 0,22 um Filter für die Sterilisation. Speichern Sie die Lösungen bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Histamin-Stammlösung in PBS auf eine Konzentration von 90 mM. Sterilisieren der Lösung durch Filtration über ein 0,22-um-Filter. Aliquot und die Lösung bei -80 ° C zu speichern. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-und-Auftau-Zyklen. </li><li> Machen Sie frisch 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor dem Experiment. Legen Sie sie auf Eis. Vorsicht: Halten Sie PFA in einem Abzug und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. </li><li> Auftauen Stabilisierungsmedium (20 ml pro Retina). Hinzufügen, Penicillin-Streptomycin in einer Endkonzentration von 100 U / ml. Warmen Teil des Mediums (15 ml pro Retina) bis 37 ° C im Inkubator vor dem Experiment. Lassen Sie den Rest des Mediums auf dem Eis. </li><li> Legen Sie die HBSS (10 ml pro Retina) auf Eis. </li></ol> 2. Retinal Organotypischen Kultur <ol><li> Übertragen Sie die Proben auf eine Gewebekultur Kapuze. Öffnen Sie die Augenmuschel von rund um das Objektiv zu schneiden. Mit einer Bürste, entfernen Sie den Glaskörper ohne auf der Netzhaut zu ziehen. Vorsichtig lösen mit einem Pinsel auf die Netzhaut von der Schnittkante der Papille zu belichten. Schwere der Sehnerv mit einer Rasierklinge und die Netzhaut lösen. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut in eine Petrischale und sorgfältig auf die Netzhaut einmal mit kaltem HBSS spülen. Die Probe wird in HBSS auf ice. nach Bedarf Präparieren wie viele Netzhäuten aus Schritt 2.1 und dieser Schritt wird wiederholt. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut in zwei Hälften symmetrisch mit einem Rasiermesser. Sanft übertragen Proben auf eine 6-Well-Platte mit 3 ml Stabilisierung Medien pro Vertiefung. Erlauben Äquilibrierung für 30 min bei 37 ° C in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien während der Inkubation bei Schritt 2.3: Verdünnen Sie die Histamin-Stammlösung auf die gewünschte Konzentration (450 &amp; mgr; M) in warmem Medium. Auflösen LXA4 (gespeichert unter Argon) in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 250 ng / ml. HINWEIS: Wenn die Wirkung von LXA 4 zu messen, die eine Hälfte von einer einzigen Netzhaut für Histamin allein verwendet wird, während die andere Hälfte für Histamin mit LXA 4 verwendet wird. </li><li> Saugen Sie das Stabilisierungsmedium sorgfältig und fügen Sie das fertige Medium zu jeder Vertiefung (3 ml pro Vertiefung). Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2. </li><li> Spülen Sie dieProben einmal in warmen, sterilen PBS. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Proben für Immunostaining <ol><li> Absaugen PBS von den Platten. In 4% PFA (3 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schnell die PFA absaugen. Spülen Sie die Proben einmal mit PBS. Übertragen Sie die Proben auf 10% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 2 bis 4 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf ein 30% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Mischen Sie einen Teil des kommerziellen Einfriermedium mit zwei Teilen von 20% Saccharose das Arbeits Einfriermedium zu machen. Lassen Sie es bei 4 ° C über Nacht oder länger, bis die Luftblasen verschwinden. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf das Arbeits Einfriermedium und ermöglichen Äquilibrierung während 5 min bei Raumtemperatur. Schneiden Sie jede Netzhaut in Rechtecke (ca. 3 mm bis 5 mm). </li><li> übertragen Sie sorgfältig die Proben in die Arbeits Einfrieren Medien in einem zylindrischen Behälter enthalten sind (etwa 1 cm Radius x 2 cm Höhe) devISED aus Aluminiumfolie. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut Scheiben vertikal sind (orientiert einen Querschnitt der Netzhaut zu schaffen, auf sectioning) und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Blöcke bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Abschnitt jeder Block auf einem Kryostaten in 14 &amp; mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren Sie die Abschnitte auf Glasplatten. Lagern Sie die Folien bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Immunostaining <ol><li> Waschen der Schnitte mit 5% Sucrose Phosphatpuffer (SPB, 5% Saccharose in PBS, pH 7,4) einmal. Blockieren die nicht-spezifischen Bindungsstellen durch Inkubation der Abschnitte in Blockierungspuffer (5% SPB mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100) 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte (auf Folien) mit dem entsprechenden primären Antikörper (GFAP oder MAP2, verdünnt auf 1: 500 in Blocking-Puffer) für 1 Stunde. Absaugen die Lösung. Waschen dreimal in 5% SPB. Für die endogene IgG-Färbung, diesen Schritt überspringen. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte mit dem entsprechenden SECON1 h: dary Antikörper (800 in Blockierungspuffer bei 1 Cyanine3 / FITC konjugiertem Esel-anti-Maus / anti-Kaninchen-IgG, verdünnt). </li><li> Waschen Sie die Abschnitte gründlich mit 5% SPB dreimal. Bereiten Sie die Proben für die Mikroskopie von ihnen Montagemedium, das DAPI in Montage und Abdecken mit Deckgläsern. </li><li> Mit einem Laser konfokalen Mikroskop, die Aufnahmen über ein 20fach - Objektiv unter identischen Parametern wie Laserintensität, Gain - Wert, Verweilzeit usw. in Gruppen. Festlegen der Anregungs- / Emissionswellenlängen für den blauen Kanal (zu detektieren DAPI) als 408/447 nm, für den roten Kanal (zu detektieren Cyanine3) als 561/785 nm und für den grünen Kanal (zu erkennen FITC) als 488/525 nm . </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Quantifizieren Prozentsatz von undichten Blutgefäße nach den folgenden Kriterien 12: Geben Sie nur die Blutgefäße mit endothelialen Zellkerne innerhalb der Ebene des Abschnitts in der Zählung; ein Blutgefäß undicht prüfen, ob es ag zeigtradient der Immunfärbung des Behälters umgibt. </li><li> Um das Expressionsniveau bestimmen, wählen Sie Bereiche von Interesse und messen Sie den mittleren Grauwert unter Verwendung der Bildanalyse-Software. </li><li> Um die Breite des Prozesses zu messen, einen Bereich des Abschnitts zu wählen, wo die Prozesse unterscheiden (die äußere Kernschicht, ONL, zum Beispiel). Dann wählen Sie ein optisches Feld, wo solche Prozesse sichtbar und kontinuierlich sind. Stellen Sie den Maßstab entsprechend der mikroskopischen Einstellung, eine Linie über den Prozess ziehen und die Messung durchzuführen. </li><li> Um die Kontinuität des Prozesses, wählen Sie Bereiche von Interesse zu analysieren, wenden Sie den Filter genannt Varianz, die die Kanten im Bild verbessert, indem jedes Pixel mit seiner Nachbarschaft Varianz zu ersetzen, passen sich automatisch den Kontrast und die Helligkeit, die Linien zu zählen und die Zählung durch die Normalisierung Bereich. </li><li> Berechnen statistische Bedeutungen unter Verwendung eines two-tailed t - Test nach Student. * P &lt;0,05; ** P &lt;0,01; *** P &lt;0,001. Plot das Ergebnis als Mittelwert ± SEM. </li></ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Bericht stellen wir ein aussagekräftiges ex vivo akutes Netzhautmodell der BRB-Dysfunktion anhand der Schweinenetzhaut vor. Dieses Modellsystem erfordert keine speziellen Instrumente und kann unter den meisten Laborumgebungen leicht angepasst werden. Um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen, sind jedoch mehrere Schritte genau erforderlich. Nachdem die Augäpfel von der Quelle gewonnen wurden, müssen sie bei 4 °C oder auf Eis aufbewahrt und so schnell wie möglich verarbeitet werden. Bei der Analyse der ...

Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstützt die Existenz von Blut Retina - Schranke (BRB) 1-5 und seine Ähnlichkeit mit dem Blut - Hirn - Schranke (BBB) ​​6,7. Kompromiss der BBB wurde ursächlich oder als diagnostischer Marker für chronische neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) 8,9 und akuter Erkrankungen wie Delirium 10 fest verbunden. Mechanistische Einblicke in diese Pathologien und Entdeckungen für potentielle Arzneimittelziele werden durch die begrenzte Zugänglichkeit und Netzwerk Kompliziertheit des Gehirns im Allgemeinen behindert. Alternativen , wie beispielsweise in vivo - Bildgebung 11, Gehirn organotypische Kultur 12, primären Zellkulturen 13,14 und Co-Kultursysteme 15 erzeugt worden sind . Allerdings sind die meisten dieser Modelle erfordern spezielle Instrumente, lange Versuchszeiten oder mehrere Marker-Zellen zu identifizieren. Funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen BBB und BRB sowie eine Korrelation zwischen der dysfunctions der beiden wurden 16-19 argumentiert. Zusätzlich leichteren Zugang, gut definierte Zelltypen und eine Schichtstruktur haben, die gut charakterisierten Netzhaut als ein Fenster zum Gehirn erlaubt. Die strukturellen und funktionellen Identität der BBB und BRB bleiben im Detail verglichen werden. Jedoch retinale Pathologien, insbesondere die BRB Verletzung, wurden ebenfalls mit dem Fortschreiten von verschiedenen Krankheiten eng in Verbindung gebracht worden, einschließlich Diabetes 18-19 und AD 21,22. Somit ist es von Interesse, eine BRB Dysfunktion System zu etablieren, nicht nur den Mechanismus zu beschreiben, sondern auch potentielle Arzneimittel zu screenen. In diesem Bericht wird ein Protokoll ermöglicht BRB Dysfunktion eine einfache akute retinale Kultur unter Verwendung entwickelt und präsentiert. Erhöht BBB Permeabilität und AD-ähnliche pathologische Veränderungen wurden in einem Gehirn organotypischen Kultur etabliert mit Histamin inkubiert, einem pro-inflammatorischen Mediators 12. Daher wird in dem dargestellten System war Histamin applied zur ex - vivo - Retinal Kultur BRB Dysfunktion zu induzieren. Retinas von mehreren Arten, wie Mus musculus und Bos Taurus, getestet wurden. Aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichem Gewebe, frisch wurden Schweine Augäpfel verwendet, um die Daten hier berichtet zu liefern. Nach Inkubation mit Histamin und / oder andere Medikamente wurden die Retinas zur Auswertung verarbeitet durch Immunfärbung für mehrere Proteine ​​12, wie Immunoglobulin G (IgG), eine der Hauptkomponenten des Blutes; glial fibrillary acidic protein (GFAP), ein bekannter Marker für Gliazellen Aktivierung; und Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), ein Neuron-spezifischen Zytoskelettprotein essentiell für Mikrotubuluszusammenbau. Darüber hinaus ermöglicht die geschichtete Struktur der Netzhaut, eine detaillierte Analyse der Prozesse der Müller-Zellen und Ganglionzellen, wie beispielsweise Veränderungen in ihrer Breite und Kontinuität. So einige zusätzliche Parameter zur Verfügung, die Folgen der zu bewertenBRB Verletzung in einem frühen Stadium und auch die Umkehrung Auswirkungen möglicher Behandlungen zu bewerten. In diesem Protokoll werden mögliche Umkehrung Wirkungen gescreent Drogen aus drei Perspektiven bewertet: das Austreten von Blutgefäßen (BVs), die Aktivierung von Gliazellen und beschädigungs Reaktion von neuronalen Zellen. Mehrere Quantifizierungsverfahren werden verwendet, zum Beispiel die Expressionsniveaus von einem Verbesserungsfilter dargestellt durch Intensität der Immunfärbung Breitenmessung eines Prozesses und die Kontinuität der neuronalen Prozesse gezeigt. Zum besseren Verständnis der Methode veranschaulichen und zu helfen , Ergebnisse zu interpretieren, Lipoxin A4 (LXA 4) eine Verbindung synthetisiert endogen als Reaktion auf entzündliche Verletzungen und mildernde endotheliale Dysfunktion 23, wurde zu Demonstrationszwecken gewählt.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermedien&nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Lasermikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

eine akute retinal modell zur bewertung von blut retinal barrier breach und potenzielle medikamente für die behandlung

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Ein kostengünstiges, einfach zu bedienendes und leistungsfähiges Modellsystem wurde etabliert, um potenzielle Behandlungen zu bewerten, die die Verletzung der Netzhautschranke im Blut verbessern könnten. Es wurde gezeigt, dass ein Entzündungsfaktor, Histamin, die Integrität der Gefäße in der kultivierten Netzhaut durch positive Färbung von IgG außerhalb der Blutgefäße beeinträchtigt. Die Auswirkungen von Histamin selbst und die von Medikamentenkandidaten für mögliche Behandlungen, wie z. B. Lipoxin A4, werden anhand von drei Parametern bewertet: Blutgefäßleckage durch IgG-Immunfärbung, Aktivierung von Müller-Zellen durch GFAP-Färbung und Veränderung der neuronalen Dendriten durch Färbung für MAP2. Darüber hinaus ermöglicht die schichtweise Organisation der Netzhaut eine detaillierte Analyse der Prozesse von Müller- und Ganglienzellen, wie z.B. Veränderungen der Breite und Kontinuität. Obwohl die vorgelegten Daten mit Netzhautkulturen von Schweinen stammen, ist das System auf mehrere Spezies anwendbar. Somit bietet das Modell ein zuverlässiges Werkzeug, um die frühen Auswirkungen einer beeinträchtigten retinalen Gefäßintegrität auf verschiedene Zelltypen zu untersuchen und potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Behandlung zu bewerten.

Wir stellen eine kostengünstige, zeitsparende und einfach zu bedienendes System, mögliche Behandlungen zu bewerten, die gegen die BRB Verletzung durch Histamin induzierte schützen könnte. IgG wird in den Gefäßen in Kontrollnetzhaut (Abbildung 1A) beschränkt, sondern tritt aus der Blutgefäße auf Histamin - Exposition (Abbildung 1B), was bestätigt , dass das Modell erfolgreich etabliert. LXA 4 w...

Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Das übergeordnete Ziel dieses ex vivo-Retinamodells besteht darin, Wirkstoffe zu testen, die die Schädigung der blut-neuralen Barriere verbessern können. Diese Methode kann mehrere zentrale Fragen auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen beantworten, beispielsweise, um welche frühen Ereignisse es sich dabei handelt und wie wir Wirkstoffe identifizieren können, die zur Behandlung dieser Patienten beitragen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie kostengünstig, einfach anzuwenden, schnell und anpassungsfähig ist.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Gewinnung zuverlässiger und reproduzierbarer Daten von den technischen Fähigkeiten zur Herstellung guter Proben abhängt. Zunächst werden Schweineretinas verwendet, die von einer kommerziellen Quelle bezogen werden. Nach der Beschaffung müssen die Augäpfel bei vier Grad oder auf Eis aufbewahrt und so schnell wie möglich verarbeitet werden.Beginnen Sie die Dissektion in einer Zellkultursicherheitswerkbank, indem Sie rund um die Linse schneiden, um die Augenkappe zu öffnen. Entfernen Sie dann vorsichtig mit einem Pinsel das Glaskörpermaterial, ohne am Netzhautgewebe zu ziehen. Lösen Sie die Netzhaut mit dem Pinsel vorsichtig von der Schnittkante, um die Austrittsstelle des Sehnervs freizulegen.Sezieren Sie den Sehnerv mit einem Rasiermesser und lösen Sie die Netzhaut. Überführen Sie die Netzhaut in eine Petrischale und spülen Sie sie vorsichtig einmal mit kaltem HBSS aus. Legen Sie die Probe in HBSS auf Eis.Als Nächstes verwenden Sie ein Rasiermesser, um die Netzhaut symmetrisch in zwei Hälften zu schneiden. Wenn Behandlungen erforderlich sind, wird eine Hälfte der Netzhaut behandelt, während die andere Hälfte derselben Netzhaut verarbeitet werden muss, um eine Grundlinie festzulegen und tierbedingte Variationen zu berücksichtigen. Überführen Sie die Proben vorsichtig in eine sechswellige Platte, die pro Mulde drei Milliliter Stabilisierungsmedium enthält.Äquilibrieren Sie die Netzhäute 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit einer Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält. Nach der Inkubation saugen Sie vorsichtig das Stabilisierungsmedium ab und geben drei Milliliter Medium, das Histamin und LXA4 enthält, in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Proben weitere eine Stunde lang.Nach dem Spülen mit warmer steriler PBS, drei Milliliter 4 % PFA pro Mulde hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, das PFA schnell abziehen und die Proben einmal mit PBS spülen. 10 % Saccharose zu den Mulden hinzufügen und zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.Als Nächstes ersetzen Sie den 10%igen Saccharose durch 30%igen Saccharose und inkubieren über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend mischen Sie ein Teil handelsübliches Einfriermedium mit zwei Teilen 20%igem Saccharose, um das Arbeits-Einfriermedium herzustellen. Lassen Sie es, bis die Luftblasen verschwinden, über Nacht oder länger bei vier Grad Celsius stehen.Am nächsten Tag das 30 %ige Saccharose durch das Arbeits-Friermittel ersetzen und fünf Minuten bei Raumtemperatur equilibrieren lassen. Nach der Equilibrierung jede Netzhaut in Rechtecke von drei Millimetern mal fünf Millimetern schneiden, anschließend die Netzhautschnitte einfrieren, indem sie in das in einem Zylinder aus Aluminiumfolie enthaltene Friermittel gegeben werden. Sicherstellen, dass die Netzhautschnitte senkrecht stehen, um bei der Schnittführung eine Querschnittsdarstellung der Netzhaut zu erhalten, und sie in flüssigem Stickstoff einfrieren.Schneiden Sie jeden Block in einem Kryostaten in 14&nbsp;Mikrometer dicke Schnitte und bringen Sie die Schnitte auf Objektträgern auf. Lagern Sie die Objektträger bei minus 80&nbsp;Grad Celsius bis zur Verwendung. Beginnen Sie die Immunfärbung, indem Sie die Schnitte mit 5&nbsp;% Phosphatpuffer mit Saccharose, oder SPB, waschen.Dann blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen, indem Sie die Schnitte eine Stunde bei Raumtemperatur mit Blockierpuffer inkubieren. Anschließend inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde mit dem entsprechenden primären Antikörper. Sobald die Stunde abgelaufen ist, aspirieren Sie die Lösung und waschen die Schnitte dreimal in 5 % SPB.Anschließend inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang mit den entsprechenden sekundären Antikörpern, wobei sie vor Licht geschützt werden müssen. Nach dreimaligem Waschen der Schnitte mit 5 % SPB bereiten Sie die Proben zur Mikroskopie vor, indem Sie sie in einem Medium mit DAPI einbetten und mit Deckgläsern abdecken. Schließlich nehmen Sie die Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.Um die Breite des Prozesses zu messen, verwenden Sie das Lupe-Werkzeug, um einen Bereich des Schnitts auszuwählen, in dem die Prozesse am stärksten ausgeprägt sind, beispielsweise die äußere Nuclearschicht. Wählen Sie dann ein optisches Feld aus, in dem solche Prozesse sichtbar und kontinuierlich verlaufen. Klicken Sie im Hauptmenü auf das Analyse-Werkzeug und anschließend im Untermenü auf „Skala festlegen“, um die Maßstabsleiste gemäß der mikroskopischen Einstellung zu kalibrieren.Wählen Sie die Linienfunktion im Hauptmenü aus und zeichnen Sie eine Linie über den Prozess. Klicken Sie auf Analysieren im Hauptmenü und dann auf Messen im Untermenü, um die Messung durchzuführen. Um die Kontinuität des Prozesses zu analysieren, kehren Sie zum Hauptmenü zurück und verwenden die Polygonfunktion, um die innere Plexiformschicht als interessierende Region auszuwählen.Messen Sie die Fläche, indem Sie auf „Analyze“ und dann auf „Measure“ klicken. Klicken Sie auf „Process“, „Filter“ und dann auf „Variants“, um die Kanten im Bild zu verstärken, indem jeder Pixel durch die Variante seiner Nachbarschaft ersetzt wird. Anschließend passen Sie automatisch den Kontrast und die Helligkeit an, indem Sie im Untermenü auf „Image“, „Adjust“, „Brightness and Contrast“ und dann auf „Auto“ klicken.Danach zählen Sie die Linien. In diesen Bildern ist die IGG-Immunreaktivität in Rot zu sehen. In den Kontrollgruppen ist IGG auf die Blutgefäße beschränkt.In der Histamingruppe wird IGG außerhalb der Blutgefäße nachgewiesen, wo es Austrittswolken bildet, die durch gestrichelte Kreise angezeigt werden. In den mit LXA4 behandelten Gruppen ist IGG erneut auf das Innere der Blutgefäße beschränkt. Die zusätzliche Gabe von LXA4 stellt die durch Histamin induzierte Gefäßfunktion wieder her.Dieses Histogramm zeigt den Prozentsatz von undichten Blutgefäßen in den getesteten Gruppen. In diesen Bildern ist die Immunfärbung für GFAP dargestellt, die Müller-Zellen anfärbt. Eine positive Färbung wird in den Fortsätzen der Müller-Zellen über die gesamte Retina und um die Blutgefäße herum beobachtet.Die Breite der Müller-Zellfortsätze aus allen Gruppen wird dargestellt. Die Behandlung mit Histamin oder LXA4 allein verringerte die Prozessbreite. Wenn jedoch beide Reagenzien zusammen angewendet wurden, wurde die Prozessbreite wiederhergestellt.In diesen Bildern wird die Immunfärbung für MAP2 dargestellt. Positives Färbungsmuster in den Fortsätzen und Zellkörpern der Ganglienzellen ist erkennbar. Die Dichte kontinuierlicher, MAP2-positiver Ganglienzellfortsätze aus allen Gruppen wird gezeigt.Die Behandlung mit Histamin verringert die Kontinuität der dendritischen Fortsätze, während LXA4 keine signifikanten Effekte hat. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann das Experiment bei korrekter Durchführung in drei bis fünf Tagen durchgeführt werden, mit fünf Minuten pro Netzhaut für die Dissektion, sechs Minuten für die Behandlung, gefolgt von Schnittung, Immunfärbung und Analyse. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisches Gewebe und geeignete Kontrollen zu verwenden.Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Live-Bildgebung hinzugefügt werden, um Echtzeitveränderungen der Kalziumspiegel und mitochondriale Eigenschaften zu verfolgen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieses ex vivo akute Netzhautkulturmodell verwendet wird, um eine BRB-Funktionsstörung zu erzeugen, die Schäden zu bewerten und auf potenzielle Wirkstoffe zu screenen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Erstellen experimentellen Netzhautablösungen mit einer reproduzierbaren und anhalt Höhe Ablösung, und ohne subretinalen Blutung, ist wichtig für die Erforschung der Pathophysiologie der Photorezeptorzellverlust in der Netzhauterkrankungen und Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen. Hier ist ein solches Verfahren im Detail beschreiben wir.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für die retinale Ischämie-Reperfusionsverletzung von erhöhtem Augeninnendruck bei Mäusen zu induzieren. Retinaler Ischämie-Reperfusionsschaden durch erhöhten Augeninnendruck dient menschlichen Krankheiten zu modellieren, indem kompromittiert Sauerstoff- und Nährstoffversorgung in der Retina gekennzeichnet, so dass die Forscher potentielle zelluläre Mechanismen und Therapien für menschliche Erkrankungen der retinalen Gefäß-Nerven-Einheit zu untersuchen.

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Es wurde ein Schutzassay entwickelt, um die Widerstandsfähigkeit des retinalen Gefäßsystems gegen den Tod durch Diabetes/diabetische Retinopathie-bedingte Beleidigungen wie oxidativen Stress und Zytokine zu überwachen.

Ein Assay zum Nachweis des Schutzes des Netzhautgefäßsystems vor diabetesbedingtem Tod bei Mäusen

Dieses Protokoll modelliert die retinale Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Mausauge, indem es eine retinale Ischämie über eine Vorderkammerkanülierung und eine Erhöhung des Augeninnendrucks induziert, gefolgt von einer Intraokulardrucknormalisierung, um die Reperfusion zu initiieren.

Induktion einer retinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Mausaugenmodell

Diese Studie stellt eine Methodik für die Verabreichung von Therapeutika in die Netzhaut und die Sehnerven der erwachsenen Ratte vor. Darüber hinaus wird eine einzigartige Gewebeentnahmemethode für eine Top-Down-Entnahme des Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte eingeführt.

Okuläre therapeutische Verabreichung und fortgeschrittene Gewebeentnahme bei erwachsenen Ratten

Erfahren Sie ein kostengünstiges ex vivo Retina-Modell zur Bewertung von Blut-Retina-Barriere-Schäden und Lipoxin A4 als potenzielles Medikament. Diese Methode ermöglicht schnelles Drug Screening in der Neurodegenerationsforschung.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

Weitere Videos entdecken