Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.

Das übergeordnete Ziel dieses ex vivo retinalen Modellsystems ist es, Medikamente zu screenen, die die Verletzung der neuronalen Schranke im Blut verbessern. Diese Methode kann mehrere Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neuronalen degenerativen Erkrankungen beantworten, z. B. was die frühen Ereignisse sind und wie wir nach Medikamenten suchen können, die bei der Behandlung dieser Patienten helfen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie kostengünstig, einfach zu bedienen, schnell und anpassungsfähig ist.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Gewinnung zuverlässiger und reproduzierbarer Daten von den technischen Fähigkeiten abhängt, um gute Proben zu generieren. Hier werden zunächst Netzhäute von Schweinen verwendet, die aus einer kommerziellen Quelle gewonnen werden. Nach der Beschaffung von der Quelle müssen die Augäpfel bei vier Grad oder auf Eis gehalten und so schnell wie möglich verarbeitet werden.

Beginnen Sie die Dissektion in einer Gewebekulturhaube, indem Sie um die Linse herum schneiden, um die Augenkappe zu öffnen. Entfernen Sie dann mit einem Pinsel vorsichtig den Glaskörper, ohne an der Netzhaut zu ziehen. Löse die Netzhaut mit einer Bürste vorsichtig von der Schnittkante, um die Papille freizulegen.

Durchtrennen Sie den Sehnerv mit einem Rasiermesser und geben Sie die Netzhaut frei. Übertragen Sie die Netzhaut in eine Petrischale und spülen Sie die Netzhaut vorsichtig einmal mit kaltem HBSS aus. Legen Sie die Probe in HBSS auf Eis.

Schneiden Sie anschließend mit einem Rasierer die Netzhaut symmetrisch in zwei Hälften. Wenn Behandlungen erforderlich sind, wird eine Hälfte der Netzhaut behandelt, während die andere Hälfte derselben Netzhaut bearbeitet werden muss, um die Ausgangsbasis festzulegen und die tierischen Unterschiede zu korrigieren. Übertragen Sie die Proben vorsichtig auf eine Sechs-Well-Platte mit drei Millilitern Stabilisierungsmedium pro Well.

Äquilibrieren Sie die Netzhaut 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, in dem die Atmosphäre 5 % Kohlendioxid enthält. Nach der Inkubation das Stabilisierungsmedium vorsichtig ansaugen und drei Milliliter Histamin- und LXA4-haltiges Medium in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie die Proben für eine weitere Stunde.

Nach dem Spülen mit warmem, sterilem PBS drei Milliliter 4 %iges PFA in jede Vertiefung geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, aspirieren Sie das PFA schnell und spülen Sie die Proben einmal mit PBS. Geben Sie 10 % Saccharose in die Vertiefungen und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius.

Ersetzen Sie anschließend die 10%ige Saccharose durch 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Mischen Sie dann einen Teil handelsübliches Gefriermedium mit zwei Teilen 20% Saccharose, um funktionierendes Gefriermedium herzustellen. Über Nacht bei vier Grad Celsius oder länger einwirken lassen, bis die Luftblasen verschwunden sind.

Ersetzen Sie am nächsten Tag die 30%ige Saccharose durch funktionierendes Gefriermedium und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ausgleichen. Schneiden Sie nach der Äquilibrierung jede Netzhaut in drei x fünf Millimeter große Rechtecke und frieren Sie die Netzhautscheiben ein, indem Sie sie in ein Gefriermedium legen, das sich in einem Zylinder aus Aluminiumfolie befindet. Stellen Sie sicher, dass die Netzhautschnitte vertikal sind, um beim Schneiden einen Querschnitt durch die Netzhaut zu erhalten, und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.

Teilen Sie jeden Block auf einem Kryostaten in 14-Mikrometer-Scheiben und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Beginnen Sie mit der Immunfärbung, indem Sie die Schnitte mit 5 % Saccharosephosphatpuffer oder SPB waschen.

Blockieren Sie dann die unspezifischen Bindungsstellen, indem Sie die Abschnitte inkubieren und den Puffer eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockieren. Inkubieren Sie anschließend die Schnitte eine Stunde lang mit dem entsprechenden Primärantikörper. Nach Ablauf der Stunde die Lösung ansaugen und die Abschnitte dreimal in 5%%SPB waschen.

Anschließend inkubieren Sie die Schnitte mit den entsprechenden Sekundärantikörpern eine Stunde lang lichtgeschützt. Nachdem Sie die Schnitte dreimal mit 5 % SPB gewaschen haben, bereiten Sie die Proben für die Mikroskopie vor, indem Sie sie in ein DAPI-haltiges Medium einbetten und mit Deckgläsern abdecken. Nehmen Sie abschließend Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.

Um die Breite des Prozesses zu messen, wählen Sie mit der Lupe einen Bereich des Abschnitts aus, in dem die Prozesse ablaufen, z. B. die äußere Kernschicht. Wählen Sie dann ein optisches Feld, in dem solche Prozesse sichtbar und kontinuierlich sind. Klicken Sie im Hauptmenü auf das Analysewerkzeug und dann im Untermenü auf Maßstab festlegen, um die Maßstabsleiste entsprechend der mikroskopischen Einstellung festzulegen.

Wählen Sie im Hauptmenü die Linienfunktion aus und ziehen Sie eine Linie quer durch den Prozess. Klicken Sie im Hauptmenü auf Analysieren und dann im Untermenü auf Messen, um die Messung durchzuführen. Um die Kontinuität des Prozesses zu analysieren, kehren Sie zum Hauptmenü zurück und verwenden Sie die Polygonfunktion, um die innere plexiforme Schicht als Interessenbereich auszuwählen.

Messen Sie die Fläche, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messen klicken. Klicken Sie auf Verarbeiten, Filtern und dann auf Varianten, um die Kanten im Bild zu verbessern, indem Sie jedes Pixel durch seine Nachbarschaftsvariante ersetzen. Passen Sie dann den Kontrast und die Helligkeit automatisch an, indem Sie im Untermenü auf Bild, Anpassen, Helligkeit und Kontrast und dann auf Auto klicken.

Zählen Sie dann die Zeilen. In diesen Bildern ist die IGG-Immunreaktivität in rot zu sehen. In Kontrollgruppen ist IGG in den Blutgefäßen eingeschränkt.

In der Gruppe der Histamine wird IGG aus den Blutgefäßen nachgewiesen, wo es Leckagewolken bildet, die durch gestrichelte Kreise angezeigt werden. In den mit LXA4 behandelten Gruppen ist IGG wiederum in den Blutgefäßen eingeschränkt. Eine weitere Zugabe von LXA4 rettet die durch Histamin induzierte Funktion der Gefäße.

Dieses Histogramm zeigt den prozentualen Anteil undichter Blutgefäße in den getesteten Gruppen. In diesen Bildern ist die Immunfärbung für GFAP, die Müller-Zellen färbt, dargestellt. Die positive Färbung wird in den Prozessen der Müller-Zellen, über die Netzhaut und um die Blutgefäße herum erzielt.

Die Breite der Müller-Zellprozesse, aus allen Gruppen wird dargestellt. Die Behandlung mit Histamin oder LXA4 allein reduzierte die Prozessbreite. Wenn jedoch beide Reagenzien zusammen aufgetragen wurden, konnte die Prozessbreite gerettet werden.

In diesen Bildern ist die Immunfärbung für MAP2 dargestellt. Es wird eine positive Färbung der Fortsätze und Zellkörper von Ganglienzellen beobachtet. Die Dichte kontinuierlicher MAP2-positiver Ganglienzellprozesse aus allen Gruppen wird dargestellt.

Die Behandlung mit Histamin verringert die Kontinuität der dendritischen Prozesse, während LXA4 keine signifikanten Auswirkungen hat. Sobald dieses Experiment gemeistert ist, kann es bei richtiger Durchführung in drei bis fünf Tagen durchgeführt werden, mit fünf Minuten pro Netzhaut für die Dissektion, sechs Minuten für die Behandlung, gefolgt von Schnitten, Immunfärbung und Analyse. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, frisches Gewebe und die richtigen Kontrollen zu verwenden.

Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Live-Imaging hinzugefügt werden, um Veränderungen des Kalziumspiegels und der mitochondrialen Eigenschaften in Echtzeit zu verfolgen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Ex-vivo-Modell für akute Netzhautkulturen verwenden, um eine BRB-Dysfunktion zu erzeugen, den Schaden zu beurteilen und nach potenziellen Medikamenten zu suchen. Vielen Dank fürs Zuschauen und alles Gute für Ihre Experimente.