Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit

Das übergeordnete Ziel dieses auf einem fluoreszierenden Zelltracing basierenden Assays besteht darin, bestimmte Zellpopulationen von Interesse zu verfolgen und zu charakterisieren, während sie nach einer Infektion der Fußsohle mit Bacille Calmette-Guérin (BCG) von der Haut zum drainierenden Lymphknoten wandern. Mithilfe dieser Technik haben wir die Population der dendritischen Zellen identifiziert, die nach einer BCG-Infektion der Haut zum drainierenden Lymphknoten wandern. Diese Technik ermöglichte die Untersuchung der Zellmigration, indem Tumore innerhalb eines definierten 24-Stunden-Zeitraums injiziert wurden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Injektion in die Fußpolster und die Isolierung der Lymphknoten nur schwer allein aus Textbeschreibungen zu erlernen sind. Für die Injektion von Mikrobakterium Bovis BCG: Nach Überprüfung der geeigneten Sedierungstiefe durch Zehenquetschen verwenden Sie eine Spritze mit einer 29-Gauge-1/2-Zoll-Nadel, um das Hinterfußpolster einer acht bis zwölf Wochen alten Maus mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ kolienbildenden Einheiten der Bakterien in 30 µL PBS zu impfen. Injizieren Sie die Kontrollfußpolster ausschließlich mit PBS.

Überwachen Sie dann die Tiere, bis sie vollständig liegend sind und Gewicht auf das injizierte Fußpolster legen können. Für die CFSE-Injektion verdünnen Sie zum geeigneten Zeitpunkt nach der BCG-Injektion ein Gefäß mit zimmerwarmem, fünf Millimolar CFSE im Verhältnis 1:10 in PBS, wobei darauf zu achten ist, die Lösung gründlich zu resuspendieren. Laden Sie dann die Spritze mit dem verdünnten CFSE und verabreichen Sie 20 Mikroliter in denselben Hinterfußpolster, der die erste Injektion erhalten hat.

24 Stunden nach der CFSE-Injektion vorsichtig einen vertikalen Schnitt im hinteren Oberschenkel durchführen und das Muskel-Fettgewebe entfernen. Anschließend mit einer Schere und Pinzette den Popliteallymphknoten freilegen und herausschneiden, der tief im Fettbeutel der Kniekehle liegt. Den Lymphknoten in 0,5 Milliliter sterilem PBS auf Eis überführen und den Lymphknoten mithilfe des Kolbens einer 3-Milliliter-Spritze durch einen 70-Mikron-Zellsieb in eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte homogenisieren, die fünf Milliliter PBS enthält.

Spülen Sie das Sieb mit weiteren 5 Milliliter Puffer und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen Puffer. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie zu markieren, überführen Sie je eine bis zehn Mal zehn hoch sechs Zellen in 5-Milliliter-Rundboden-Polystyrol-Röhrchen und waschen Sie die Zellen mit frischem FACS-Puffer.

Suspendieren Sie die Pellets erneut in 50 bis 100 Mikroliter der geeigneten Antikörpercocktail-Lösung, die Anti-Maus-CD16/CD32 enthält, um unspezifische FC-vermittelte Wechselwirkungen im FACS-Puffer auf Eis zu blockieren, dabei vor Licht geschützt lagern. Nach 30 bis 45 Minuten waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer und suspendieren die Pellets erneut in 50 bis 100 Mikroliter frischem FACS-Puffer. Die Mehrheit der CFSE-Markierung im poplitealen Lymphknoten wird in MHC-II-hoch- und CD11c-positiv-niedrig-Zellen beobachtet, was mit kutanen dendritischen Zellen übereinstimmt, die in die Haut drainierende Lymphknoten migrieren.

Sowohl die Häufigkeit als auch die Gesamtanzahl dieser markierten Zellen scheinen in den poplitealen Lymphknoten von mit BCG infizierten Mäusen im Vergleich zu PBS-injizierten Kontrollen erhöht zu sein, was darauf hindeutet, dass BCG die Umverlagerung dieser Zellen zu den drainierenden Lymphknoten verstärkt. Hautdendritische Zellen gelangen weiterhin bis zu fünf Tage nach der Infektion in den drainierenden Lymphknoten, wodurch die Migration dendritischer Zellen im vorliegenden Modell deutlich über den Zeitrahmen hinaus verlängert wird, der für die initiale Aktivierung antigenspezifischer CD4-positiver T-Zellen im poplitealen Lymphknoten gilt. Darüber hinaus exprimieren wandernde Hautdendritische Zellen erhöhte Mengen an kostimulatorischen Molekülen, was die Vorstellung unterstützt, dass diese wandernden dendritischen Zellen aktiviert sind.

Wichtig ist, dass sowohl die lymphknotenresistenten monozytoïden als auch plasmazytoïden dendritischen Zellen, die über die hoch endothelialen Venulen und nicht über afferente Lymphgefäße in entzündete Lymphknoten eindringen, negativ für CFSE sind, was weiter bestätigt, dass die CFSE-Markierung hauptsächlich im Fußpolster erfolgt. Darüber hinaus zeigt eine zusätzliche Durchflusszytometrie-Analyse, dass eine Teilpopulation von EpCAM low CD11b high-Zellen die wichtigste migrierende Teilpopulation der dendritischen Hautzellen ist, die als Antwort auf eine BCG-Infektion zum poplitealen Lymphknoten abwandert. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Minuten durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig mit der Injektionsstelle und dem Injektionsvolumen umzugehen; besondere Vorsicht ist erforderlich, um den drainierenden Lymphknoten während der Präparation nicht zu beschädigen. Nach der Prozedur können weitere Methoden wie die Durchflusszytometrie oder die konfokale Mikroskopie zur weiteren Analyse der mikroexprimierten Zellen in spezifischen Subsets durchgeführt werden. Diese Technik ermöglichte es Forschern erstmals, Zellen innerhalb von 24 Stunden nach einer Infektion oder Impfung vom Hautgewebe bis hin zum drainierenden Lymphknoten zu verfolgen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fußpolstereinspritzungen durchführt und die drainierenden Lymphknoten zur Verfolgung und Charakterisierung migrierender dendritischer Zellpopulationen von Interesse lokalisiert und isoliert.