Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mäuse zu erzeugen, die das Gen der Interesse in hämatopoetischen Zellen exprimieren, unter Verwendung der Transduktions-Transplantations-Methode. In kurzer Zeit kann mit dieser Methode geklärt werden, ob Ihr Gen des Interesses eine hämatologische Malignität auslöst. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose hämatologischer Malignitäten hinein, da durch die beschleunigte Erstellung von Mausmodellen potenzielle Therapeutika getestet werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in hämatologische Erkrankungen ermöglichen kann, lässt sie sich auch dazu verwenden, die Rolle eines Gens von Interesse für die normale Hämatopoese zu untersuchen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Experiment sind, Schwierigkeiten, da es mehrere Schritte erfordert. Außerdem ist die Erzeugung eines Virus mit hoher Titration entscheidend für den Erfolg dieses Experiments.

Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist wichtig, da die Arbeit mit Mäusen schwierig sein kann und Übung erfordert. Nach der Anästhesie einer Maus und Überprüfung der Anästhesietiefe gemäß dem schriftlichen Protokoll positionieren Sie die Maus auf die Seite und fixieren Sie das Tier mit Daumen und Zeigefinger so, dass das Auge leicht aus dem Kopf hervorsteht. Um 150 Milligramm pro Kilogramm 5-Fluorouracil oder 5-FU über eine retroorbitale Injektion zu verabreichen, führen Sie eine halbzöllige Nadel mit 27 Gauge unter einem Winkel von 45 Grad mit der Schräge nach oben in medialer Richtung ein und stoppen Sie, wenn die Nadel zur Hälfte eingeführt ist.

Injizieren Sie die Lösung langsam und entfernen Sie die Nadel anschließend vorsichtig. Untersuchen Sie die Maus auf Anzeichen von Verletzungen, wie Schwellungen oder Blutungen, und stellen Sie sicher, dass die Maus sich erholt und zu laufen beginnt. Fünf Tage später, nach Tötung des Tieres gemäß dem Textprotokoll, sterilisieren Sie die Maus mit 70 % Ethanol, indem Sie großzügig sprühen, bis das Fell nass ist.

Erstellen Sie mit einer Schere einen Schnitt in die Haut und dissezieren Sie die Faszie von den Beinmuskeln. Trennen Sie anschließend das Bein von der Maus, indem Sie den Femur am Hüftgelenk und die Tibia am Sprunggelenk durchtrennen. Biegen Sie das Bein zu einer L-Form und verwenden Sie die Schere, um jeden Beinknochen am Kniegelenk zu trennen.

Dann vorsichtig den Muskel entlang des Beinknochens bis zu einem Ende schaben, bis der Knorpel gelöst ist. Anschließend jeden Beinknochen mit einer Spritze, die eine halbzöllige Nadel mit 27 Gauge aufweist, in PBS ergänzt mit 2 % FBS über eine 100-Mikrometer-Nylonmembran in ein 50-Milliliter-Konischglas durchspülen, bis der Knochen weiß wird, um die Anzahl der gewonnenen Zellen zu maximieren. Mit dem Kolben einer Spritze die Zellen durch die Nylonmembran in das 50-Milliliter-Konischglas zerdrücken, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Bein der Maus. Zentrifugieren Sie die gewonnenen Zellen bei 400 × g und 4 °C für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie dann fünf Milliliter Ammonium-chlorid-potassium, auch ACK genannt, hinzu, um das Knochenmark erneut aufzuschwemmen.

Die Zellsuspension 10 Minuten auf Eis inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Um die Lyse zu stoppen, das Gefäß mit PBS auffüllen. Anschließend die Zellen erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter PBS und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers nach der Trypanblau-Ausschlussmethode. Geben Sie nun 2x Prä-Stammzell-Cocktail hinzu, um die Zellen in einer Konzentration von zweimal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter zu suspendieren. Anschließend pipettieren Sie zwei Milliliter in die Vertiefungen von 6-Loch-Platten.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation geben Sie zwei Milliliter virales Überstand zu jedem Well hinzu, gefolgt von acht Mikrogramm pro Milliliter Polybrene. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1500 × g bei 30 Grad Celsius für 90 Minuten.

Bringen Sie die Platten anschließend über Nacht in den Inkubator zurück. Pipettieren Sie die Zellsuspension in kegelförmige Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 400 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Wiederresuspendieren Sie die Zellen mit 2x Prä-Stammzell-Cocktail pro Vertiefung und geben Sie sie in die ursprünglichen Vertiefungen zurück.

Nach der Vorbereitung der Empfänger-Mäuse für die Transplantation gemäß dem Textprotokoll werden die transduzierten Donorzellen aus den Sechs-Well-Platten gewonnen, indem das Überstandmedium vorsichtig in kegelförmige Röhrchen pipettiert wird. Jede Vertiefung wird mit einem Milliliter PBS gewaschen, und die verbleibenden Zellen in den Röhrchen gesammelt. Anschließend werden 0,5 Milliliter 0,05 %igem Trypsin zu den Vertiefungen gegeben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter D-10 zu den Vertiefungen hinzu und lösen Sie die restlichen Zellen durch vorsichtiges Pipettieren ab. Danach geben Sie die Zellen in die entsprechenden Röhrchen und pelletieren sie bei 400 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen erneut mit PBS.

Danach die Zellen nach dem Zentrifugieren mit fünf Milliliter PBS resuspendieren und mit der Trypanblau-Ausschlussmethode sowie einem Hämozytometer zählen. Für die Injektion in Mäuse fünf mal 10 hoch 5 bis zwei mal 10 hoch 6 Zellen in 50 bis 100 Mikroliter PBS resuspendieren. Die Maus seitlich lagern und mit Daumen und Zeigefinger fixieren, sodass das Auge leicht aus dem Kopf hervortritt.

Setzen Sie die Nadel mit der Schräge nach oben seitlich zum medialen Augenwinkel in einem Winkel von 45 Grad ein und injizieren Sie. Untersuchen Sie danach die Maus auf Anzeichen von Verletzungen wie Schwellung oder Blutung an der Injektionsstelle und beachten Sie den schriftlichen Protokollabschnitt für die zusätzliche Nachsorge nach der Injektion. Analysieren Sie abschließend die GFP-Expression im Blut gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Diese Abbildung veranschaulicht die Berechnung der relativen Virus-Titrierung, wobei der Prozentsatz an GFP aus den Ereignissen berechnet wird, die aus dem Live-Zell-Gate erfasst wurden. Dargestellt ist hier ein Titer mit mehr als einem Viruspartikel pro Zelle, und diese Proben repräsentieren Titrierungen mit jeweils einem einzelnen Viruspartikel pro Zelle. Im Idealfall würden mindestens 50 % der GFP-positiven Zellen bei einer Verdünnung des viralen Überstandes im Verhältnis 1 zu 30 nachgewiesen werden.

In diesem Experiment wird ein erfolgreicher Transplantationsempfänger vorgestellt, bei dem CALRdel52-Mäuse ein MPN-Phänotyp mit erhöhten Thrombozyten, vermehrten Megakaryozyten im Knochenmark und Knochenmarkfibrose aufweisen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von acht Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, jeden Schritt des Protokolls genau zu befolgen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern den Weg, um die Auswirkungen spezifischer Gene in der Hämatopoese zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse herstellt, die Ihr Gen der Interesse in hämatopoetischen Zellen exprimieren.