Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die vorhersagbare Reihe morphologischer Veränderungen zu veranschaulichen, die während der Regeneration eines vollständigen Polypen aus einem winzigen Gewebeabschnitt auftraten, der von der aboralen Spitze von Nematostella vectensis entfernt wurde. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Regenerationsbiologie zu beantworten, z. B. wie sich Zellen an der Stelle einer Wunde reorganisieren und einsetzen, um die fehlenden Strukturen wieder herzustellen. Die Idee zu dieser Methode hatte ich zuerst, weil ich sehen wollte, wie sich ein relativ komplexer Polyp mit der geringsten Menge an morphologischer Information wieder zusammensetzen kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Fortschreiten des Stadiums nach der ersten Verwundung manchmal durch eine Schleimhaut verdeckt wird.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, eine vollständige Trennung des Gewebes an der Wundstelle zu erreichen, da der Polyp weich, klebrig und gallertartig ist. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Konditionierung von Nematostella vectensis, wie im Textprotokoll beschrieben. Bei dieser Technik ist es besonders wichtig, dass die ausgewählten Tiere gleich groß sind und die gleiche Kulturgeschichte haben, wie z. B. identische Fütterung und andere Zustandsparameter.

Nehmen Sie die Schale ausgewählter Tiere mindestens eine Stunde vor der Amputation aus dem Brutapparat ins Raumlicht. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette mit breitem Durchgang, um die fünf Tiere aus dem zu amputierenden Becken in den Boden einer sterilen Glasschneideschale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern zu übertragen, die künstliches Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Promille enthält. Stellen Sie die Schüssel auf den Tisch eines Stereomikroskops mit variabler Vergrößerung zwischen 10 und 40x.

Wählen Sie größenangepasste Polypen von ungefähr gleicher Länge aus und legen Sie sie vor der Amputation drei Tage lang in eine von der Kolonie getrennte Schale. Amputieren Sie mit einem sterilen Skalpell die aborale Physa von jedem Polypen, um einen Abschnitt der Physa zu erhalten, der ungefähr so lang wie breit ist und kein Mesenterium enthält. Um dies zu erreichen, platzieren Sie die Skalpellklinge in Kontakt mit dem Tier an der gewünschten Amputationsstelle.

Tun Sie dies entweder ohne Hilfe oder indem Sie den Körper des Tieres vorsichtig mit einer Zange mit der Nummer fünf greifen. Schneiden Sie durch das Gewebe, indem Sie die gebogene Klinge des Skalpells in einer schaukelnden Bewegung über den Körper hebeln. Entferne jeden amputierten Spenderpolypen aus der Schale und lege ihn zurück in eine separate Schüssel mit der Aufschrift "gepoolte Amputierte".

Nachdem Sie die Schale datiert haben, geben Sie sie an die Lagerkultur zurück. Spülen Sie die herausgeschnittene Physa, die in der Schneidschale verbleibt, in künstlichem Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Teilen pro 1.000 ab. Übertragen Sie dann jede Physa in eine separate sterile Vertiefung in einer Zellkulturplatte mit mehreren Vertiefungen, die 10 Milliliter künstliches Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Teilen pro 1.000 in jeder Vertiefung enthält.

Wiederholen Sie diese Schritte, um mindestens fünf Physa in jeder Vertiefung zu sammeln, die für jede experimentelle Behandlung reserviert werden sollen. Legen Sie die Platte mit der Physa in einen temperaturgeregelten Inkubator bei einer festen Temperatur, die durch die gewünschte Regenerationsgeschwindigkeit bestimmt wird. Bewerten Sie die Physa mit einem Stereo-Verbundmikroskop mit variabler Vergrößerung.

Bewerten Sie die frisch geschnittene Nematostella physa als Stadium Null und setzen Sie die Bewertung jeden Tag nach der Amputation (DPA) mit dem NRSS zur gleichen Zeit fort. Bewerten Sie die Physa als Stadium Null, wenn eine frisch geschnittene Physa als becherförmige Masse erscheint, die einem schlaffen Ballon mit einer offenen Wundstelle ähnelt, die wahrscheinlich sichtbar ist. Bewerten Sie eine Physa als Stufe eins, wenn die Amputationswunde geschlossen erscheint.

Bewerten Sie eine Physa als zweite Stufe, wenn die Oberfläche des Ohrstabs aufgebläht erscheint und acht erhabene Bögen sichtbar sind, die in einem radialsymmetrischen Muster angeordnet und durch Rillen getrennt sind. Im zweiten Stadium beobachten Sie kleine halbkugelförmige Bläschen an der Spitze der Bögen, die etwa so hoch wie breit sind, wahrscheinlich vorübergehend sind und ursprünglich aus einer einzigen ektodermalen Zellschicht bestehen. Mit zunehmendem Alter kann die Physa von Schleim umhüllt werden, der vorsichtig mit einer Pinzette entfernt werden sollte.

Bewerten Sie eine Physa als Stufe drei, wenn die Knospen der Tentakel, die endodermale und ektodermale Gewebeschichten enthalten, am auditiven Ende zumindest einiger radialer Bögen stabil ausgebildet sind. Bewerten Sie eine Physa als Stufe vier, wenn die Physa acht verschiedene sichtbare Mesenterien enthält, die sich in einem Coelenteron von Insertionen in der Körperwand erstrecken, mit auditiven aboralen Längen, die mehr als doppelt so groß sind wie ihre radiale Breite, gemessen von der Stelle, an der sie an seinem aboralen Ende mit dem Pharynx verbunden zu sein scheinen, oder Enterostomom. Bewerten Sie schließlich eine Physa als Stufe fünf, wenn die Physa mehr als vier Mesenterien mit Falten hat und die Falten voller und gewundener sind als im vierten Stadium.

Im fünften Stadium hat das Tier ein fast normales erwachsenes Aussehen, aber es gibt keine sichtbaren Gonadenzellen. Diese Gruppe von Kontrollnematostella physa, die mit 0,1 Prozent DMSO behandelt wurden, hat sich vollständig bis zum fünften Stadium regeneriert. Mit Chloroquin behandelte Physa konnte jedoch keine vollständigen Mesenterien bilden.

Eine Nahaufnahme zeigt sowohl das Vorhandensein als auch das Fehlen von Falten in den Mesenterien in einer Physa, die mit Chloroquin inkubiert wurde. Diese Grafik veranschaulicht die Gesamtergebnisse der Chloroquin-Behandlung. Jede Behandlung zwischen 10 und 50 Mikromolaren verursachte ähnliche Defekte, vor allem das Fehlen einer vollständigen Reformation der Mesenterien, da die Mesenterien keine Falten aufweisen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde für jede Sechs-Well-Platte mit 30 geschnittenen Physa durchgeführt werden. Die Bewertung erfolgt schnell und erfordert möglicherweise eine halbe Stunde für jede Replikatplatte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Physa amputiert wird, um die morphologischen Veränderungen zu visualisieren, die während der Regeneration eines vollständigen Polypen aus einem winzigen Abschnitt des aboralen Gewebes auftreten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie morphologische Stadien liefert, in denen die molekularen Ereignisse, die der Regeneration eines vollständigen Polypen zugrunde liegen, aus einem Becher visuell einheitlichen Gewebes festgelegt werden können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Tiere in Bezug auf die Ernährungsanamnese vorzukonditionieren, zu halbieren, um adulte Mesenterien auszuschließen, und die Größe des regenerierenden Körpers zu standardisieren, um Schwankungen innerhalb der Behandlungen zu reduzieren. Mit diesem Verfahren könnten beispielsweise die Auswirkungen von genetischen Mutationen oder Störungen des Signalwegs mit kleinen Molekülen bewertet werden.

Oder morphogenetische Veränderungen könnten mit mikroskopischen Analysen der Selbstproliferation, der Abstammungsverfolgung oder der Genexpression an der zweiten Stelle korreliert werden. Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Regenerationsbiologie den Weg ebnen, die Zellbiologie, die Signalwege und die morphogenetischen Prozesse zu erforschen, die der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit dieses Modellorganismus zugrunde liegen.