Messung der Steifigkeit von Ex Vivo Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verfahren für die Verwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Messung des Ex-vivo-Elastizitätsmoduls von Maus-Aorten zu beschreiben. Diese Methode hilft bei der Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich der vaskulären Biomechanik und Krankheiten, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Alterung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Rasterkraftmikroskop die biomechanischen Eigenschaften weicher biologischer Proben wie Arterien und Zellen mit einem hohen Maß an Genauigkeit auf Danoskala charakterisiert.

Ich werde die AFM-Verfahren vorstellen, und Dr. Shu-lin Liu, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, wird zeigen, wie man Aorten von Mäusen isoliert. Zu Beginn euthanasieren Sie eine Maus und präparieren sie bis zur Aorta, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Fassen Sie mit einer kleinen Pinzette das Fett, das die Aorta umgibt, und schneiden Sie mit einer kleinen Schere vorsichtig das Fett ab, das sich um die Aorta herum befindet.

Fassen Sie dann vorsichtig mit einer Zange nach der Aorta und machen Sie einen Schnitt durch das Gefäß am Anfang der aufsteigenden Aorta und einen weiteren Schnitt am Ende der absteigenden Aorta, direkt über der Bauchaorta. Übertragen Sie die präparierte Aorta in eine 60-Millimeter-Schale, die PBS ohne Kalzium oder Magnesium enthält. In der Schale fahren Sie damit fort, das restliche Fettgewebe von der Aorta zu trennen und öffnen Sie dann die Aorta in Längsrichtung.

Schneiden Sie als Nächstes ein 2 Millimeter x 4 Millimeter großes Stück aus der absteigenden Aorta und ein gleich großes Stück aus dem Aortenbogen für die Analyse mit dem Rasterkraftmikroskop ab. Legen Sie diese Taschentuchstücke in eine frische 60-Millimeter-Plastikschale und halten Sie sie in einem Tropfen PBS feucht. Entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einem Labortuch aus dem Gewebe, ohne die Aorta zu berühren.

Stellen Sie sicher, dass die luminale Seite des Gewebes nach oben zeigt, und verwenden Sie fünf bis 10 Mikroliter Cyanacrylat-Klebstoff, um jedes Ende der geöffneten Aorta vorsichtig auf die Platte zu kleben. Es ist wichtig, dass die Aorta während dieses Prozesses nicht gedehnt wird. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie, ob die geklebte Aorta nicht gefaltet oder schwebend ist.

Nachdem Sie den Kleber 30 bis 60 Sekunden lang an der Luft getrocknet haben, fügen Sie vorsichtig PBS hinzu und tauchen Sie die Probe ein. Schieben Sie mit einer Pinzette eine Silikonnitrat-AFM-Sonde mit einer kugelförmigen Spitze auf den Sondenhalter. Befestigen Sie dann den Sondenhalter fest an der ZScanner-Halterung des AFM-Kopfes.

Öffnen Sie als Nächstes die AFM-Software. Wählen Sie den Experimenttyp aus, indem Sie zur Kategorie Experiment wechseln und Kontaktmodus auswählen. Wechseln Sie dann zu Experimentgruppe, und wählen Sie Kontaktmodus in Fluid aus, und wechseln Sie schließlich zu Experiment, und wählen Sie Kontaktmodus in Fluid aus.

Sobald diese ausgewählt sind, klicken Sie auf Experiment laden. Dadurch wird der Laser eingeschaltet. Bereiten Sie als Nächstes eine Probe vor, die zum Ausrichten des Lasers verwendet wird, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben.

Legen Sie die Probe auf das AFM. Positionieren Sie den Laserspot auf der Spitze der AFM-Sonde, indem Sie die Laserpositionierungsknöpfe einstellen. Verwenden Sie dann die Positionierungsknöpfe des Detektors, um die Position der Fotodiode anzupassen, bis die Werte für die vertikale Auslenkung zwischen null und minus einem Volt liegen und die horizontale Auslenkung nahe null Volt liegt.

Überprüfen Sie als Nächstes, ob das Lasersummensignal maximiert ist. Passen Sie bei Bedarf die Position des Laserstrahls auf der AFM-Spitze und die Position der Fotodiode an, um das maximale Summensignal zu erhalten. Um mit der Kalibrierung zu beginnen, wählen Sie Prüfparameter und setzen Sie den Parameter für Scangröße auf Null.

Stellen Sie die Abtastrate auf ein Hertz ein. Stellen Sie die Probe/Leitung auf 256 und den Deflektionssollwert auf 20 Nanometer ein. Wählen Sie dann Engage aus.

Sobald die Sonde Kontakt mit der Oberfläche der Platte aufnimmt, klicken Sie auf Rampe. Wählen Sie als Nächstes den erweiterten Modus im Menü der Scan-Symbolleiste aus und stellen Sie die Parameter wie hier gezeigt ein. Wählen Sie in der Werkzeugleiste der Rampe die Option Verlaufskontinuus aus, und rufen Sie eine Kraftkurve auf der Platte auf.

Stellen Sie in dieser Kraftkurve Kanal 1 auf Ablenkfehler ein, damit die Software die Ergebnisse als vertikale Auslenkung gegenüber der Z-Position grafisch darstellen kann. Klicken Sie am linken oder rechten Ende der Kraftkurve und ziehen Sie den Cursor, um einen linearen Bereich der Kraftkurve zu umfassen, der an die gerade Linie angepasst wird. Wählen Sie dann in der Symbolleiste Rampe aus und klicken Sie auf Empfindlichkeit aktualisieren.

Notieren Sie den aktuellen Wert. Wählen Sie anschließend Kalibrieren und klicken Sie auf Detektor. Eingabe und Durchschnittswert aus den fünf Messungen im Feld Ablenkempfindlichkeit.

Klicken Sie zwei- bis dreimal auf Ziehen, um den AFM-Kopf anzuheben und eine Wechselwirkung zwischen der AFM-Spitze und der Platte während des thermischen Abstimmungsvorgangs zu verhindern. Klicken Sie dann in der Symbolleiste auf Thermal Tune. Stellen Sie den Thermal Tune-Bereich auf einen Wert zwischen einem und 100 Kilohertz ein und stellen Sie die Korrektur der Ablenkungsempfindlichkeit auf 1,144 für V-förmige Ausleger und 1,166 für rechteckige Ausleger ein.

Klicken Sie im Menü "Thermal Tune" auf "Daten erfassen", um eine Thermal Tune-Kurve zu erhalten. Platzieren Sie als Nächstes einen roten Strich auf den Linien auf beiden Seiten der Kurve, und wählen Sie entweder das Lorentzsche oder das einfache harmonische Oszillatormodell aus, je nachdem, welches Modell besser zu den Daten passt. Klicken Sie dann auf Daten anpassen und wählen Sie Feder K berechnen, um diesen Wert zu speichern.

Stellen Sie eine 60-Millimeter-Kulturschale mit dem Aortengewebe auf den Mikroskoptisch und befestigen Sie die Platte mit dem magnetischen Plattenhalter. Sobald die Aorta in den Ausleger eingerastet ist, stellen Sie sicher, dass das Piezozentrum stabil ist, und klicken Sie auf Rampe. Legen Sie die Rampengröße auf drei Mikrometer, den Trigger-Modus auf Relativ und den Trigger-Schwellenwert auf 100 Nanometer fest.

Wählen Sie dann Rampe kontinuierlich aus. Beachten Sie, dass der Kontaktpunkt zwischen der Sonde und der Probe ungefähr in der Mitte der unteren drei Viertel des Z-Rampenzyklus auftritt. Wenn dies nicht beachtet wird, lösen Sie die Probe, passen Sie die Rampengröße nach Bedarf an und greifen Sie die Probe wieder ein.

Klicken Sie anschließend in der Menüleiste auf Mikroskop und wählen Sie Engage-Einstellungen. Ändern Sie die SPM-Entnahme auf 30 Mikrometer und klicken Sie dann auf OK. Nachdem Sie die Kraftkurve beobachtet haben, klicken Sie in der Menüleiste auf Capture und wählen Sie Capture Filename. Geben Sie einen gewünschten Dateinamen ein, der auf OOO endet, wählen Sie einen bestimmten Ordner aus und speichern Sie die Daten.

Um mit der Analyse zu beginnen, öffnen Sie die Kraftkurvenanalysesoftware, laden Sie die zu analysierende Datei und ändern und glätten Sie die Daten, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie als Nächstes in der Menüleiste Baseline-Korrektur aus, und legen Sie die Eingaben wie hier gezeigt fest. Passen Sie dann die vertikale gestrichelte blaue Linie im Diagramm so an, dass sie den flachen Teil der Kraftkurve umfasst, und klicken Sie auf Ausführen.

Klicken Sie anschließend im Symbolleistenmenü auf Einzug und legen Sie die Eingaben wie hier gezeigt fest. Speichern Sie diese Werte, und analysieren Sie den Elastizitätsmodul jedes der interessierenden Bereiche, indem Sie fünf Kraftkurven pro Fläche messen, die in geringem Abstand zueinander gemessen werden. Um die Gesamtsteifigkeit der Gewebeprobe zu bestimmen, sollten bis zu 25 Messungen über fünf verschiedene Bereiche des Probenbereichs innerhalb des Gewebes durchgeführt werden.

Diese Bereiche können verwendet werden, um Gewebe an verschiedenen Stellen zu vergleichen, wie z. B. dem Aortenbogen und der absteigenden Aorta. In diesen Diagrammen sind repräsentative Kraftkurven der absteigenden Aorta und des Aortenbogens aus derselben Stichprobe der Mausaorta dargestellt. Basierend auf diesen Daten kann der Elastizitätsmodul für jede Gruppe berechnet und zum Vergleich zwischen verschiedenen Regionen oder Bedingungen verwendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein gutes Verständnis dafür, wie man die Aorta von Mäusen richtig isoliert und den Elastizitätsmodul durch Rasterkraftmikroskopie misst. Nachdem Sie dieses Verfahren ausprobiert haben, ist es wichtig, daran zu denken, die AFM-Messung unmittelbar nach der Gewebeisolierung durchzuführen. Einmal gemeistert, kann die Isolierung der Aorten in etwa 45 Minuten pro Maus abgeschlossen werden, und die AFM-Messung und -Analyse kann in eineinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunfluoreszenz- oder Proliferationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Gefäßumbau oder zur Proliferation der vaskulären glatten Muskelzellen zu beantworten.