Name: Messung der Steifigkeit von Ex Vivo Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Lernen Sie die Messung des Elastizitätsmoduls von Mäuseaorten mit Rasterkraftmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise biomechanische Charakterisierung für die Erforschung kardiovaskulärer Erkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die AFM-Analyse wurde mit Hilfe des Pennsylvania Muscle Institute und des Institute for Translational Medicine and Therapeutics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse HL62250 und AG047373 unterstützt. YHB wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der American Heart Association unterstützt.

<ol><li>Kothapalli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Protection+by+ApoE+and+ApoE-HDL+Linked+to+Suppression+of+ECM+Gene+Expression+and+Arterial+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Protection by ApoE and ApoE-HDL Linked to Suppression of ECM Gene Expression and Arterial Stiffening.</a> Cell Rep. 2, 1259-1271 (2012).</li>
<li>Liu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-12+is+an+essential+mediator+of+acute+and+chronic+arterial+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-12 is an essential mediator of acute and chronic arterial stiffening.</a> Sci Rep. 5, 17189(2015).</li>
<li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+arterial+aging+and+the+epidemic+of+systolic+hypertension+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Central arterial aging and the epidemic of systolic hypertension and atherosclerosis.</a> J Am Soc Hypertens. 1, 302-340 (2007).</li>
<li>Stehouwer, C. D. A., Henry, R. M. A., Ferreira, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+in+diabetes+and+the+metabolic+syndrome%3A+a+pathway+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness in diabetes and the metabolic syndrome: a pathway to cardiovascular disease.</a> Diabetologia. 51, 527-539 (2008).</li>
<li>Steppan, J., Barodka, V., Berkowitz, D. E., Nyhan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Stiffness+and+Increased+Pulse+Pressure+in+the+Aging+Cardiovascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular Stiffness and Increased Pulse Pressure in the Aging Cardiovascular System.</a> Cardiol Res Pract. 2011, 263585(2011).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Stiffness+and+Cardiovascular+Events%3A+The+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial Stiffness and Cardiovascular Events: The Framingham Heart Study.</a> Circulation. 121, 505-511 (2010).</li>
<li>Sutton-Tyrrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Aortic+Pulse+Wave+Velocity%2C+a+Marker+of+Arterial+Stiffness%2C+Predicts+Cardiovascular+Events+in+Well-Functioning+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elevated Aortic Pulse Wave Velocity, a Marker of Arterial Stiffness, Predicts Cardiovascular Events in Well-Functioning Older Adults.</a> Circulation. 111, 3384-3390 (2005).</li>
<li>Klein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Cycle+Control+by+Physiological+Matrix+Elasticity+and+In+Vivo+Tissue+Stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Cycle Control by Physiological Matrix Elasticity and In Vivo Tissue Stiffening.</a> Curr Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li>
<li>Bae, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FAK-Cas-Rac-lamellipodin+signaling+module+transduces+extracellular+matrix+stiffness+into+mechanosensitive+cell+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">A FAK-Cas-Rac-lamellipodin signaling module transduces extracellular matrix stiffness into mechanosensitive cell cycling.</a> Sci signal. 7, ra57(2014).</li>
<li>Thyberg, J., Hedin, U., Sjölund, M., Palmberg, L., Bottger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+differentiated+properties+and+proliferation+of+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 10, 966-990 (1990).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Regulation+of+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+in+Development+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Differentiation in Development and Disease.</a> Physiol Rev. 84, 767-801 (2004).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Intimal+Stiffening+Enhances+Endothelial+Permeability+and+Leukocyte+Transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-Related Intimal Stiffening Enhances Endothelial Permeability and Leukocyte Transmigration.</a> Sci Transl Med. 3, 112ra122(2011).</li>
<li>Safar, M. E., Levy, B. I., Struijker-Boudier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Arterial+Stiffness+and+Pulse+Pressure+in+Hypertension+and+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Arterial Stiffness and Pulse Pressure in Hypertension and Cardiovascular Diseases.</a> Circulation. 107, 2864-2869 (2003).</li>
<li>Raffetto, J. D., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+vascular+remodeling+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease.</a> Biochem Pharmacol. 75, 346-359 (2008).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotechnol. 3, 261-269 (2008).</li>
<li>Hsu, B. Y., Bae, Y. H., Mui, K. L., Liu, S. -L., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E3+Inhibits+Rho+to+Regulate+the+Mechanosensitive+Expression+of+Cox2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E3 Inhibits Rho to Regulate the Mechanosensitive Expression of Cox2.</a> PLoS ONE. 10, e0128974(2015).</li>
<li>Johnson, K. L., Kendall, K., Roberts, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Energy+and+the+Contact+of+Elastic+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">Surface Energy and the Contact of Elastic Solids.</a> Proc R Soc Lond A. 324, 301-313 (1971).</li>
<li>Derjaguin, B. V., Muller, V. M., Toporov, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+deformations+on+the+adhesion+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of contact deformations on the adhesion of particles.</a> J Colloid Interface Sci. 53, 314-326 (1975).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Rev Sci Instrum. 64, 1868-1873 (1993).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch+EJP%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Arch EJP. 440, 653-666 (2000).</li>
<li>Pogoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-sensing+analysis+of+cytoskeleton+organization+based+on+AFM+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data.</a> Eur Biophys J. 41, 79-87 (2012).</li>
<li>Mendez, M. G., Restle, D., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Enhances+Cell+Elastic+Behavior+and+Protects+against+Compressive+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vimentin Enhances Cell Elastic Behavior and Protects against Compressive Stress.</a> Biophys J. 107, 314-323 (2014).</li>
<li>Moreno-Flores, S., Benitez, R., Md Vivanco,, Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relaxation+and+creep+on+living+cells+with+the+atomic+force+microscope%3A+a+means+to+calculate+elastic+moduli+and+viscosities+of+cell+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components.</a> Nanotechnology. 21, 445101(2010).</li>
<li>Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+human+mesenchymally-derived+stem+cells+and+primary+osteoblasts%2C+chondrocytes%2C+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.</a> J Biomech. 41, 454-464 (2008).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Elastic+Moduli+of+Thin+Layers+of+Soft+Material+Using+the+Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope.</a> Biophys J. 82, 2798-2810 (2002).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Käs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe-Based+Frequency-Dependent+Microrheology+of+Polymer+Gels+and+Biological+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe-Based Frequency-Dependent Microrheology of Polymer Gels and Biological Cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li>
<li>Amin, M., Le, V. P., Wagenseil, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Testing+of+Mouse+Carotid+Arteries%3A+from+Newborn+to+Adult%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult.</a> J Vis Exp. , e3733(2012).</li>
<li>Laurent, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document+on+arterial+stiffness%3A+methodological+issues+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications.</a> Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nat Nano. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Raman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanomechanical+properties+of+live+cells+using+multi-harmonic+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy.</a> Nat Nano. 6, 809-814 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

AFM Einbuchtung kann verwendet werden, um die Steifigkeit (Elastizitätsmodul) von Zellen und Geweben zu charakterisieren. In diesem Beitrag stellen wir ausführliche Schritt- für -Schritt - Protokolle , um die absteigende Aorta und Aortenbogen in der Maus und bestimmen die Elastizitätsmoduli dieser arteriellen Regionen ex vivo zu isolieren. Wir haben jetzt zusammenfassen und die technischen Probleme und Einschränkungen des Verfahrens in diesem Papier beschrieben diskutieren. Verschie...

Die biomechanischen Eigenschaften von Arterien sind eine entscheidende Determinante für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und das Altern. Die arterielle Steifigkeit, ein wichtiger cholesterinunabhängiger Risikofaktor und ein Indikator für das Fortschreiten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, nimmt mit Gefäßverletzungen, Arteriosklerose, Alter und Diabeteszu 1-8. Die Versteifung der arteriellen Wand ist mit einer erhöhten Dedifferenzierung, Migration und Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen verbunden9-12. Darüber hinaus wurde eine erhöhte arterielle Steifigkeit mit einer verbesserten Makrophagenadhäsion1, einer endothelialen Permeabilität und Leukozytentransmigration13 sowie einem Gefäßwandumbau14,15 in Verbindung gebracht. Daher könnten Therapien, die eine arterielle Versteifung bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder im Alter verhindern könnten, die derzeit verfügbaren pharmakologischen Interventionen zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ergänzen, indem sie einen hohen Cholesterinspiegel im Blut senken. 
AFM ist ein leistungsstarkes Analysewerkzeug, das für verschiedene physikalische und biologische Anwendungen verwendet wird. AFM wird zunehmend eingesetzt, um hochauflösende Bilder zu erhalten und die biomechanischen Eigenschaften von weichen biologischen Proben wie Geweben und Zellen1,2,10,16,17 mit einem hohen Maß an Genauigkeit auf nanoskaliger Ebene zu charakterisieren. Ein großer Vorteil des AFM ist die Tatsache, dass es mit lebenden Zellen verwendet werden kann.
Dieser Artikel beschreibt unsere Methode zur Messung des Elastizitätsmoduls von Mausarterien ex vivo mit Hilfe von AFM. Die beschriebene Methode zeigt, wie wir 1) Mausarterien (absteigende Aorta und Aortenbogen) richtig isolieren und 2) den Elastizitätsmodul dieser Gewebe mittels AFM messen. Messungen von unbelasteten elastischen Modulen in Arterien können helfen, Veränderungen in der extrazellulären Matrix (ECM) aufzuklären, die als Reaktion auf Gefäßverletzungen, CVD und Alterung auftreten.

<table><tbody><tr><td>BioScope Catalyst AFM-System</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE 200 inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliziumnitrid-AFM-Sonde</td><td>Novascan Technologies</td><td>PT. SI02. SN.1</td><td>0,06 N/m Ausleger; 1 & Mikro; m SiO2 Partikel</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Siehe Abschnitt 1.4</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Siehe Abschnitt 1.8</td></tr><tr><td>Feine Schere-ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Siehe Abschnitt 1.4 (mittelgroß)</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Bingen Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td>Siehe Abschnitt 1.6 (kleine Größe)</td></tr><tr><td>60 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Krazy Glue Instant Allzweckflüssigkeit</td><td>Krazy Glue</td><td>KG58548R</td><td>Siehe Abschnitt 2.2</td></tr><tr><td>Gel-Ladespitzen, 1 - 200 & Mikro; l</td><td>Fisher</td><td>02-707-139</td><td>Siehe Abschnitt 2.2</td></tr><tr><td>Pinzette für</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>78092-CP</td><td>Siehe Abschnitt 3.2</td></tr><tr><td>50-mm-Glasbodenschalen mit klarer Wand</td><td>TED PELLA</td><td>14027-20</td><td>Siehe Abschnitt 4.4</td></tr></tbody></table>

messung der steifigkeit von<em&gt; ex vivo</em&gt; maus aorten mit rasterkraftmikroskopie

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterielle Versteifung ist ein signifikanter Risikofaktor und Biomarker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und ein Markenzeichen des Alterns. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein vielseitiges Analysewerkzeug für viskoelastische mechanischen Eigenschaften für eine Vielzahl von Materialien zu charakterisieren die von harten (Kunststoff, Glas, Metall, etc.) Oberflächen auf Zellen , die auf jedem Untergrund. Es wurde in großem Umfang verwendet, um die Steifigkeit der Zellen zu messen, aber weniger häufig verwendet, um die Steifigkeit des Aorten messen. In diesem Beitrag werden wir die Verfahren für die Verwendung von AFM im Kontaktmodus beschreiben die ex vivo - Elastizitätsmodul von unbelastetem Maus Arterien zu messen. Wir beschreiben unsere Verfahren zur Isolierung von Maus Aorten und dann detaillierte Informationen für die AFM-Analyse liefern. Dazu gehören die Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Ausrichtung des Laserstrahls eine Kalibrierung der Federkonstante und Ablenkung Empfindlichkeit der AFM-Sonde, und den Erwerb von Kraftkurven. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll für die Daten Analysis der Kraftkurven.

<html> 5A zeigt ein Phasenkontrastbild des absteigenden (Thorax) Aorta aus einem 6-Monate alten, männlichen C57BL / 6 - Maus. Die AFM - Cantilever ist an Ort und Stelle direkt über dem Gewebe und bereit für den Einzug. 5B und 5C zeigen repräsentative Kraftkurven durch AFM Vertiefung im Kontaktmodus erhalten. Grüne Linien in den 5B und 5C gezeigt stellen die besten Fitkurven für eine Kugel mit dem Hertzian Modell erhalten. In 5D</...

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Isolierung von Aorten aus der Maus und die Messung ihres Elastizitätsmoduls mittels Rasterkraftmikroskopie.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Verfahren zur Anwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Bestimmung des ex vivo elastischen Moduls von Mausaorten zu beschreiben. Diese Methode hilft, zentrale Fragen auf dem Gebiet der vaskulären Biomechanik und Erkrankungen wie kardiovaskuläre Erkrankungen und Alterung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Rasterkraftmikroskopie (AFM) die biomechanischen Eigenschaften weicher biologischer Proben wie Arterien und Zellen mit hoher Genauigkeit auf Nanoskala charakterisieren kann.Ich werde die AFM-Verfahren vorstellen, und Doktor Shu-lin Liu, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, wird zeigen, wie man Aorten von Mäusen isoliert. Beginnen Sie damit, eine Maus zu töten und sie gemäß der beigefügten textlichen Anleitung bis zur Aorta zu präparieren. Greifen Sie mit einem Paar kleiner Pinzetten das umgebende Fettgewebe der Aorta und schneiden Sie vorsichtig mit einer kleinen Schere das Fettgewebe um die Aorta herum ab.Als Nächstes fassen Sie vorsichtig die Aorta mit einer Pinzette und führen einen Schnitt durch das Gefäß am Anfang der aufsteigenden Aorta sowie einen weiteren Schnitt am Ende der absteigenden Aorta, knapp oberhalb der Aorta abdominalis, durch. Überführen Sie die präparierte Aorta in eine 60-Millimeter-Schale, die PBS ohne Calcium oder Magnesium enthält. In der Schale entfernen Sie weiterhin das verbleibende Fettgewebe von der Aorta und öffnen anschließend die Aorta longitudinal.Schneiden Sie anschließend ein 2 Millimeter mal 4 Millimeter großes Stück aus der Aorta descendens und ein gleich großes Stück aus dem Aortenbogen zur Analyse mittels Rasterkraftmikroskop aus. Legen Sie diese Gewebestücke in eine frische 60 Millimeter große Plastikschale und halten Sie sie in einem Tropfen PBS feucht. Entfernen Sie vorsichtig das PBS um das Gewebe herum mit einem Laborabwisch, ohne die Aorta zu berühren.Stellen Sie sicher, dass die luminalen Seite des Gewebes nach oben zeigt, und verwenden Sie fünf bis 10 Mikroliter Cyanoacrylat-Klebstoff, um jedes Ende der geöffneten Aorta vorsichtig an der Platte zu befestigen. Es ist entscheidend, dass die Aorta während dieses Vorgangs nicht gedehnt wird. Überprüfen Sie anschließend, ob die geklebte Aorta weder gefaltet noch schwebend ist.Nach dem Lufttrocknen des Klebers an der Aorta für 30 bis 60 Sekunden vorsichtig PBS hinzufügen und die Probe untertauchen. Mit einer Pinzette einen kugelförmigen Silikon-Nitrat-AFM-Kolben auf den Kolbenhalter schieben. Anschließend den Kolbenhalter fest auf der ZScanner-Halterung des AFM-Kopfes befestigen.Öffnen Sie als Nächstes die AFM-Software. Wählen Sie den Experimenttyp aus, indem Sie zu Experiment Category gehen und Contact Mode auswählen. Gehen Sie dann zu Experiment Group und wählen Contact Mode in Fluid, und wählen Sie schließlich unter Experiment Contact Mode in Fluid aus.Wenn diese ausgewählt sind, klicken Sie auf „Experiment laden“. Dadurch wird der Laser eingeschaltet. Bereiten Sie anschließend eine Probe zur Justierung des Lasers vor, wie in der begleitenden textbasierten Anleitung beschrieben.Platzieren Sie die Probe auf dem AFM. Positionieren Sie den Laserfleck auf der Spitze der AFM-Sonde, indem Sie die Laserpositionierknöpfe justieren. Anschließend verwenden Sie die Detektorpositionierknöpfe, um die Position der Photodiode so einzustellen, dass die Werte für die vertikale Ablenkung zwischen null und minus eins Volt liegen und die horizontale Ablenkung nahe bei null Volt ist.Als Nächstes überprüfen Sie, ob das Lasersummensignal maximiert ist. Falls erforderlich, stellen Sie die Position des Laserstrahls auf der AFM-Spitze und die Position der Photodiode erneut ein, um das maximale Summensignal zu erhalten. Um mit der Kalibrierung zu beginnen, wählen Sie die Parameterüberprüfung aus und stellen den Parameter für die Scan-Größe auf null ein.Stellen Sie die Abtastrate auf ein Hertz ein. Stellen Sie die Probe/Zeile auf 256 und den Ablenkungssollwert auf 20 Nanometer ein. Wählen Sie dann „Engage“.Sobald die Sonde mit der Oberfläche der Platte in Kontakt kommt, klicken Sie auf Ramp. Wählen Sie anschließend den erweiterten Modus im Scan-Werkzeugleistenmenü und stellen Sie die Parameter wie hier gezeigt ein. Wählen Sie in der Ramp-Werkzeugleiste Ramp continuus und nehmen Sie eine Kraftkurve auf der Platte auf.Stellen Sie in dieser Kraftkurve Kanal 1 auf „Deflection Error“ ein, damit die Software die Ergebnisse als vertikale Auslenkung in Abhängigkeit von der Z-Position darstellen kann. Klicken Sie an die linken oder rechten Enden der Kraftkurve und ziehen Sie den Cursor, um einen linearen Bereich der Kraftkurve zu markieren, der mit einer Geraden angepasst wird. Wählen Sie dann im Menüband „Ramp“ aus und klicken Sie auf „Update Sensitivity“.Notieren Sie den aktuellen Wert. Wählen Sie anschließend Kalibrieren aus und klicken Sie auf Detektor. Geben Sie den Mittelwert aus den fünf Messungen in das Feld „Ablenkungsempfindlichkeit“ ein.Klicken Sie zwei bis drei Mal auf „Withdraw“, um den AFM-Kopf anzuheben und eine Wechselwirkung zwischen der AFM-Spitze und der Platte während des thermischen Abgleichs zu verhindern. Klicken Sie dann in der Symbolleiste auf „Thermal Tune“. Stellen Sie den Bereich für den thermischen Abgleich auf einen Wert zwischen ein und 100 Kilohertz ein und setzen Sie die Korrektur der Auslenksempfindlichkeit auf 1,144 für V-förmige Cantilever und auf 1,166 für rechteckige Cantilever.Im Menü „Thermal Tune“ auf „Acquire Data“ klicken, um eine thermische Abstimmungskurve zu erhalten. Anschließend rote Strichlinien auf beiden Seiten der Kurve platzieren und je nachdem, welches Modell besser zu den Daten passt, entweder das Lorentz- oder das einfache harmonische Oszillatormodell auswählen. Danach auf „Fit Data“ klicken und „Calculate Spring K“ auswählen, um diesen Wert zu speichern.Platzieren Sie eine 60-Millimeter-Kulturschale mit dem Aortengewebe auf dem Mikroskopständer und sichern Sie die Schale mit dem magnetischen Plattenhalter. Sobald die Aorta mit dem Cantilever verbunden ist, stellen Sie sicher, dass der Piezo-Mittelpunkt stabil ist, und klicken Sie auf Ramp. Stellen Sie die Rampen-Größe auf drei Mikrometer, den Auslösemodus auf Relativ und die Auslöseschwelle auf 100 Nanometer ein.Danach „Ramp kontinuierlich“ auswählen. Beobachten Sie, dass der Kontakt zwischen der Sonde und der Probe ungefähr in der Mitte bis zu den unteren drei Vierteln des Z-Rampen-Zyklus erfolgt. Falls dies nicht der Fall ist, die Probe freigeben, die Rampengröße gegebenenfalls anpassen und erneut mit der Probe koppeln.Klicken Sie anschließend in der Menüleiste auf Mikroskop und wählen Sie Einstellungen aktivieren. Ändern Sie den SPM-Rückzug auf 30 Mikrometer und klicken Sie dann auf OK. Nachdem Sie die Kraftkurve beobachtet haben, klicken Sie in der Menüleiste auf Aufnehmen und wählen Sie Aufnahmedateiname. Geben Sie einen gewünschten Dateinamen ein, der auf OOO endet, wählen Sie einen bestimmten Ordner aus und speichern Sie die Daten.Um die Analyse zu beginnen, öffnen Sie die Software zur Kraftkurvenanalyse, laden die zu analysierende Datei und modifizieren sowie glätten die Daten wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie anschließend im Menüleistenpunkt „Baseline Correction“ und stellen Sie die Eingaben wie hier gezeigt ein. Passen Sie danach die vertikale gepunktete blaue Linie im Diagramm so an, dass sie den flachen Bereich der Kraftkurve umfasst, und klicken Sie auf „Execute“.Klicken Sie anschließend im Symbolleistenmenü auf Einzug und stellen Sie die Eingaben wie hier gezeigt ein. Speichern Sie diese Werte und analysieren Sie das Elastizitätsmodul jedes interessierenden Bereichs, indem Sie fünf Kraftkurven pro Bereich messen, die in geringem Abstand zueinander aufgenommen werden. Um die Gesamtsteifigkeit der Gewebeprobe zu bestimmen, sollten bis zu 25 Messungen über fünf verschiedene Regionen des Probenbereichs innerhalb des Gewebes durchgeführt werden.Diese Bereiche können verwendet werden, um Gewebe an verschiedenen Stellen zu vergleichen, beispielsweise am Aortenbogen und an der absteigenden Aorta. In diesen Diagrammen sind repräsentative Kraftkurven der absteigenden Aorta und des Aortenbogens aus derselben Maus-Aortenprobe dargestellt. Anhand dieser Daten kann das Elastizitätsmodul für jede Gruppe berechnet und zur Untersuchung von Unterschieden zwischen verschiedenen Regionen oder Bedingungen herangezogen werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aorta der Maus korrekt isoliert und den elastischen Modul mittels Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) bestimmt. Nach Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die AFM-Messung unmittelbar nach der Gewebeisolation durchzuführen. Wenn man einmal Erfahrung gesammelt hat, kann die Isolation der Aorten innerhalb von etwa 45 Minuten pro Maus abgeschlossen werden, und die AFM-Messung sowie Analyse kann, bei ordnungsgemäßer Durchführung, innerhalb von eineinhalb Stunden abgeschlossen werden.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz oder Proliferationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Gefäßremodelierung oder zur Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen zu beantworten.

measuring-stiffness-ex-vivo-mouse-aortas-using-atomic-force

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix stark beeinflusst mehrere Verhalten von adhärenten Zellen. Matrix Steifigkeit variiert räumlich in einem Gewebe, und unterliegt Änderungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Hier entwickeln wir Methoden, um räumliche Veränderungen der Steifigkeit in normalen und fibrotische Maus Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie Mikroindentation charakterisieren.

Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Quelle: Canovic, E. P., et al. Charakterisierung der mehrskaligen mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Stoßeindringung und Rheometrie. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt den Einsatz der Rasterkraftmikroskopie (AFM) zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Hirngewebe, bei dem ein Cantilever-Sensor mit einer kugelförmigen Sonde mit dem Gewebe interagiert und sich unter den ausgeübten Kräften biegt. Ein Laserstrahl, der auf einen Detektor abgelenkt...

Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Wir beschreiben eine Technik zur Messung der Aortensteifigkeit anhand ihrer Druck-Durchmesser-Beziehung in vivo bei Mäusen. Der Aortendurchmesser wird mittels Ultraschall erfasst und der Aortendruck invasiv mit einem Festkörperdruckkatheter gemessen. Der Blutdruck wird schrittweise verändert und der resultierende Durchmesser gemessen.

Mess aufsteigende Aorta Steifigkeit In-vivo- In Mäuse Mit Ultraschall

Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Elastizitätsmodule von kollagenreichen Bereichen in normaler und kranker Leber mittels Rasterkraftmikroskopie. Der gleichzeitige Einsatz der Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision zur Lokalisierung kollagenreicher Areale in den Leberabschnitten.

Messung der Lebersteifigkeit mittels Rasterkraftmikroskopie gekoppelt mit Polarisationsmikroskopie

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Axolotl-Gewebe für die Rasterkraftmikroskopie (AFM) vorbereitet und Indentationsmessungen in intaktem und regenerierendem Gliedmaßenknorpel durchgeführt werden können.

Rasterkraftmikroskopische Messungen von Knorpel in intakten und regenerierenden Axolotl-Gliedmaßen

Wir präsentieren ein Protokoll zum Biegen filamentösen Bakterienzellen an eine Cover-Rutsch-Oberfläche mit einer optischen Falle auf die zelluläre Biegesteifigkeit zu messen.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

Lernen Sie die Messung des Elastizitätsmoduls von Mäuseaorten mit Rasterkraftmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise biomechanische Charakterisierung für die Erforschung kardiovaskulärer Erkrankungen.

Messung der Steifigkeit von

Weitere Videos entdecken