Name: Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie einen Fluoreszenz-basierten Assay zur Messung der Phospholipid-Scramblase-Aktivität in Liposomen mit rekonstituiertem Opsin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen des interzellulären Lipidtransports.

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Diese Studie wurde unterstützt von der Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) und dem österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) Projekt J3686 (B.P.).

1. Herstellung von Liposomen und Proteoliposomen <ol><li> Liposome Formation <ol><li> Verwendung einer Glasspritze, fügen 1.435 ul POPC (25 mg / ml, in Chloroform) und 160 &amp; mgr; l POPG (25 mg / ml, in Chloroform) auf einen Rundkolben wurden 52,5 umol Lipide in einem Molverhältnis POPC zu erhalten: POPG = 9: 1. </li><li> Trocknen der Lipide für 30 min unter Verwendung eines Rotationsverdampfer bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 145 rpm (kein Wasserbad wird für dieses Volumen an Lösungsmittel erforderlich), dann übertragen die Kolben auf einem Vakuum-Exsikkator für mindestens 3 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Hydratisieren des getrockneten Lipidfilms mit 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (nachfolgend bezeichnet als A-Puffer) durch vorsichtiges den Kolben, bis eine homogene, trübe Suspension Ergebnisse wirbelnden; HINWEIS: Die Lipidkonzentration in diesem Stadium wird erwartet, 5,25 mM zu sein, da keine Verluste sollten bisher aufgetreten sind. </li><li> Beschallen die Suspension in einem Wasserbad für 10 min bei Raumtemperatur mit einer Frequenz of 40 kHz. Die Lösung aussehen wird etwas klarer. </li><li> Unter Verwendung eines Extruders, übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine Membran mit einer 400 nm Porengröße, gefolgt von einem zweiten Zyklus der Extrusion mit 4 Durchgängen durch eine Membran mit einer 200 nm Porengröße. HINWEIS: Der mittlere Durchmesser der resultierenden LUVs von ~ 175 nm. Falls erforderlich, können die Größe und die Homogenität der LUVs durch dynamische Lichtstreuung überprüft werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Quantifizierung der Phospholipid-Konzentration des LUV-Suspension, wie in Abschnitt 1.2) beschrieben. ANMERKUNG: Aufgrund der Verluste während der Extrusion, die Konzentration ist in der Regel etwa 3,6 mM. </li><li> Speichern der LUVs bei 4 ° C für ca. 2 Wochen, wenn nicht sofort verwendet wird. </li></ol></li><li> Phospholipid Quantifizierung ANMERKUNG: Um die Phospholipid-Konzentration der LUV Suspension zur Rekonstitution sowie die der Proteoliposomen verwendet bestimmen, die schließlich erzeugt werden, ein Aliquot der Probe Ändected Oxidation durch Perchlorsäure. Dieses Verfahren bricht Phospholipide unten anorganisches Phosphat freizugeben , die dann durch einen kolorimetrischen Test im Vergleich mit Standards 23 quantifiziert. <ol><li> Bereiten Sie eine 40 mM Stammlösung von Natriumphosphat (Na 2 HPO 4) in entionisiertem , destilliertem Wasser. </li><li> Verdünnen der Stammlösung mit entionisiertem, destilliertem Wasser zu erhalten, 4 mM und 0,4 mM Arbeitslösungen, die als Kalibrierungsstandards dienen. </li><li> Unter Verwendung der Arbeitslösungen vorzubereiten Standards in 13 x 100 mm Glasröhrchen 2 im Bereich von 0 bis 80 nmol Natriumphosphat in einem Endvolumen von 50 ul. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul jeder der LUV und Proteoliposoms Proben quantifiziert und mit 40 ul ddH 2 O in 13 x 100 mm 2 Glasröhrchen verdünnen. Hinweis: Da die Lipidkonzentration der LUVs und Proteo im Bereich von 2,5-5 uM, die 10 ul Probe 25-50 nmol Lipid Phosphor enthalten.</li><li> Hinzufügen 300 ul Perchlorsäure zu jedem der Standards und Proben und Wärme für 1 h bei 145 ° C in einem Heizblock. Setzen Marmor auf den Rohren Verdampfung zu verhindern. </li><li> Lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen lassen und mit 1 ml ddH 2 O. </li><li> In 400 ul jeweils frisch zubereitet 12 g / l Ammoniummolybdat und 50 g / l Natriumascorbat und Wirbel zu mischen. </li><li> Hitze 10 min bei 100 ° C mit Murmeln oben auf die Rohre. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen lassen. </li><li> Die Extinktion der Proben gegen den Rohling (Standardprobe, die 0 nmol Natriumphosphat) mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 797 nm. </li><li> Bestimmen Sie den Phosphatgehalt der Proben gegen die Kalibrierung Standardkurve. </li></ol></li><li> Rekonstitution von Opsin HINWEIS: Es ist notwendig, die optimale Quellung Bedingungen für die Rekonstitution zu bestimmen, da diese abhängig von der Art des Waschmittels sowieals Lipidzusammensetzung und der Konzentration der LUVs. Als LUVs auf Schwellung des Prozesses ihre Lichtstreuungseigenschaften verändern kann durch Messung der Absorption (Abbildung 2) als rezensiert von Rigaud und Levy 24 und Geertsma et al überwacht werden. 25. <ol><li> Pipette 800 ul LUVs (aus dem Abschnitt 1.1, wie Lipid Erholung nach der Extrusion 70%, die erwartete Konzentration von LUVs ist 3,6 mM Phospholipid) in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen, 5,3 ul Puffer A und 34,7 &amp; mgr; l 10% (w / v) DDM in Puffer A gelöst </li><li> Inkubieren für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit end-over-end Mischen. </li><li> Vorbereitung der Zwischenzeit die Polystyrol-Kügelchen: <ol><li> Verwenden Sie 400 mg Kügelchen pro Probe und wiegen sie in einem Becherglas aus. </li><li> Waschen Sie zweimal mit Methanol, dreimal mit Wasser und einmal mit Puffer A. Für jeden Waschschritt Einsatz 5 ml Flüssigkeit und rühre langsam für 10 min. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Polystyrol herzustellenPerlen auf einmal für mehrere Proben, beispielsweise in 6 g Perlen wiegen und mit 75 ml Flüssigkeit zu waschen. Überschüssige Perlen können in einem Kühlschrank für mehrere Tage aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Während der letzten 30 Minuten der Vesikel Destabilisierung trocknen die NBD markierte Phospholipid in einem Schraubverschluss Glasrohr ( &quot;Rekonstitution Glasrohr &#39;): Pro Probe, 9,5 ul NBD-PC (1 mg / ml in Chloroform, wodurch man 0,4 Mol% der gesamten Phospholipiden) werden unter einem Stickstoffstrom in einem Glasröhrchen getrocknet und anschließend in 45 ul 0,1% (w / v) DDM in Puffer A gelöst </li><li> Nach 3 h Vesikel Destabilisierung fügen den gelösten-NBD-markiertes Phospholipid, das DDM-solubilisierten Protein und Puffer A , so dass das Endvolumen von 1 ml 0,36% (w / v), das heißt, 7 mM, DDM. <ol><li> Somit proteinfreien Liposomen (verwendet als Kontrollprobe) in 45 ul NBD-PC (gelöst in 0,1% DDM), 60 ul 0,1% DDM und 55 ul Puffer A zu erzeugen; für Proteo hinzufügen, für PrüfungB. 40 &amp; mgr; l Protein (aus einer typischen Stammlösung von ~ 110 ng / ul) in 0,1% DDM, 45 &amp; mgr; l von NBD-PC, (in 0,1% DDM) gelöst, 20 ul 0,1% DDM und 55 &amp; mgr; l Puffer A . Hinweis: Die Reihenfolge der Zugabe werden sollte, wie aufgelistet. </li></ol></li><li> Die Probe wird für eine zusätzliche Stunde Ende über Ende bei Raumtemperatur. </li><li> In 80 mg der hergestellten Polystyrol-Kügelchen und Inkubation der Probe mit end-over-end bei RT für 1 h gemischt werden. </li><li> Als nächstes fügen Sie eine zusätzliche 160 mg Polystyrol-Kügelchen und Inkubation mit End-over-end bei RT für weitere 2 Stunden gemischt wird. </li><li> Übertragen Sie die Probe (Abfahrt die verbrauchten Polystyrolkügelchen hinter) auf eine Glas Schraubverschluss Röhrchen mit 160 mg frisch Polystyrolkügelchen und über Nacht bei 4 ° C mischen. HINWEIS: Der einfachste Weg, um die Probe zu übertragen und zu vermeiden Ansaugen Perlen ist eine Pasteurpipette zu verwenden, die mit einem kleinen positiven Druck auf den Boden der Glasröhre gedrückt wird. Sobald die Spitze der Pipette ist fest an derBoden des Rohres, dann kann die Probe leicht, ohne von den Kügelchen Interferenz zurückgezogen werden. </li><li> Am nächsten Morgen, übertragen Sie die Probe auf ein Mikrozentrifugenröhrchen ohne Perlen und auf Eis in Vorbereitung auf die Scramblase Aktivitätstest Durchführung über. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Aktivitätstest HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität der Liposomen oder Proteoliposomen mit Puffer A verdünnt wird über die Zeit nach der Zugabe von Dithionit in einem Fluoreszenz-Spektrometer überwacht. Um eine stabile Ausgangsintensität zu erhalten, wird die Fluoreszenz für mindestens 50 sec aufgezeichnet (oder bis ein stabiles Signal erreicht wird), bevor Dithionit zu einer konstant gerührten Probe zugegeben und anschließend wird dann für mindestens 500 s nach Zugabe von Dithionit. <ol><li> In 1.950 ul Puffer A zu einer Plastikküvette ein Mini Rührstab enthält. </li><li> In 50 ul der vorbereiteten proteo (Liposomen) und lassen Sie die Probe in der Fluoreszenz SPECTRO äquilibrierenMeter unter ständigem Rühren für mehrere Sekunden. </li><li> Inzwischen bereiten eine Lösung von 1 M Dithionit in 0,5 M ungepufferte Tris (zB für zwei Proben 20 mg Dithionit in ein Mikrozentrifugenröhrchen abwiegen und in 114 ul eiskaltem 0,5 M Tris direkt vor dem Gebrauch und auf Eis halten für die nächste auflösen Sample). HINWEIS: Die Dithionit-Lösung muss frisch zubereitet werden und sollte nicht mehr als 20 min nach der Herstellung verwendet werden; wenn viele Messungen vorgenommen werden, Aliquots von Dithionit können im Voraus werden abgewogen und unmittelbar vor der Verwendung gelöst. </li><li> Starten Sie die Fluoreszenzüberwachung (Anregung 470 nm, Emission 530 nm, Spaltbreite 0,5 nm). </li><li> In 40 ul der 1 M Dithionitlösung in die Küvette 50 Sekunden nach der Fluoreszenz Starten der Aufnahme (mit dem Septum im Deckel der Küvette Kammer, wenn möglich) und weiterhin die Fluoreszenz für eine weitere 400-600 sec aufzeichnen. </li><li> Analysieren Sie die Daten, wie in Kapitel 3 beschrieben. </li></ol> 3.Datenanalyse <ol><li> Kinetik der Scrambling <ol><li> Charakterisieren Sie die Fluoreszenzspur jedes durch die Scramblase Aktivitätstest erhaltenen Probe durch die anfängliche Fluoreszenz definiert, F i, vor der Zugabe von Dithionit und der Endpunkt Fluoreszenz, F, erreichte nach&gt; 400 sec. F i wird für jede Probe als Mittelwert der Fluoreszenz für den Zeitraum von 30 sec bestimmt vor der Zugabe von Dithionit. </li><li> Bestimmen die Endpunktdaten entsprechend dem Ausmaß des Fluoreszenzreduktion, R = 100 • F / F i. Wir verwenden die Begriffe R L für proteinfreien Liposomen und R P für Opsin enthaltenden Proteo. </li></ol></li><li> Bestimmung des Molekulargewichts des Funktionell Rekonstituiertes Scramblase <ol><li> Konvertieren der Fluoreszenzreduktionsdaten gemäß der folgenden Gleichung: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Gleichung 1) HINWEISWobei R max die maximale Reduktion ist , die erhalten wird , wenn ausreichend Protein, rekonstituiert wird , dass alle Vesikel in der Probe mindestens eine funktionelle scramblase besitzen, und p ist die Wahrscheinlichkeit , dass ein bestimmter Vesikel in einer rekonstituierten Probe wird als &quot;Scramblase-aktiv&quot;, dh sie besitzt mindestens eine funktionelle scramblase. Der Wert für R L beträgt typischerweise 45% 3 , während R max ist typischerweise 82,5% 3, anstelle des erwarteten 100% (R max kann experimentell für Opsin Proteoliposomen mit einem PPR von&gt; 1 mg / mmol bestimmt werden). Als R max &lt;100% wird davon ausgegangen , dass eine Subpopulation von Vesikeln zur Rekonstitution refraktären ist. Für R max = 82,5%, der Anteil an Vesikeln , die Protein nicht annehmen kann ist 0.35. </li><li> Beschreiben Sie die Beziehung zwischen p (≥1 Scramblase) und PPR (mg Protein / mmol Phospholipid) durch Poisson-Statistik wie folgt: p (≥1 Scramblase) = 1 - e <sup&gt; -m = 1 - exp (-PPR / α) (Gleichung 2) ANMERKUNG: wo m = Anzahl der scramblases pro Vesikel und α = mono-exponentiellen Anpassung konstant in Einheiten von mg Protein / mmol Phospholipid. </li><li> Als ein Teil der Vesikel trägt nicht auch bei hohen PPR (siehe Diskussion) zu kriechen, ändern Sie die Gleichung: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Gleichung 3) HINWEIS: Wenn PPR * = PPR / (1 ​​- f), wobei f die feuerfeste Population von Vesikeln oder in diesem Fall, PPR = * PPR / 0,65 (Gleichung 4). HINWEIS: Die Passform Konstante α wird durch den Einbau eines Graphen von p bestimmt (≥1 Scramblase) im Vergleich zu PPR * mit einem Mono-Exponentialfunktion. Wenn Opsin (Molekulargewicht 41,7 kDa) rekonstituiert funktionell in 175-nm-Durchmesser Vesikel (jedes Vesikel besitzt 280.000 Phospholipide 26) als ein Monomer, α = 0,187 mg mmol -1. Wenn Opsin dimerisiert vor 3 der Rekonstitution Scramblase aktive Vesikel zu erhalten, dann α= 0,37 mg mmol -1. Wenn PPR nicht PPR * für die Analyse verwendet werden würde, dann würden die entsprechenden α Werte 0,122 und 0,244 mg mmol -1 sein. Diese vorhergesagten Werte für α annehmen, dass alle Opsinmoleküle funktionell zuständig sind. Wenn nur ein Bruchteil der Moleküle befähigt ist, Lipide zu verwürfeln, dann werden die entsprechenden Werte von α größer sein. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Scramblase Aktivitätstest konnten wir ursprünglich das Opsin Phospholipid Scramblase zu bestimmen Aktivität 2 hat. Der Assay auch erlaubt uns Opsin der scramblase Aktivität zu charakterisieren , indem die Spezifität zu testen (verwendeten wir eine Vielzahl von NBD-markierten Reporter Lipiden wie NBD-Phosphatidylethanolamin, mit NBD an einer Acylkette markiert , wie für NBD-PC in Figur 1A gezeigt ist , oder auf die Kopfgruppen-, NBD-Sphingomyelin oder NBD- Phosphatidylserin 2), ...

Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G - Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung 1) ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert 2,3. Scramblases sind Phospholipid - Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise 4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran - Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine Vielzahl von Glycosylierungswege 5. Reguliert Phospholipid Verwürfelung benötigt Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten , wo es als ein &quot;eat-me&quot; -Signal für Makrophagen 7 und stellt eine prokoagulierende Oberfläche auf aktivierten Blutplättchen die Bildung von Proteinfaktor zu katalysierens für die Blutgerinnung benötigt. In Photorezeptorscheibenmembranen hat Scrambling Aktivität des Rhodopsin vorgeschlagen worden , das Phospholipid Ungleichgewicht zwischen den beiden Membran Blättchen der Bilayer entgegenzuwirken , die durch den ATP-abhängigen, unidirektionale Lipid erzeugt wird Flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Trotz der physiologischen Bedeutung von scramblases, ihre Identität blieb schwer bis Rhodopsin als Scramblase in Photorezeptor Scheiben berichtet wurde 2, die Mitglieder des TMEM16 Proteinfamilie wurden als Ca 2+ identifiziert -abhängigen scramblases für PS - Exposition an der Plasmamembran benötigt (in Bezug prüft 13) und das bakterielle Protein FTSW wurde vorgeschlagen , wie ein Lipid II für Peptidoglycansynthese 14 erforderlich Scramblase. Diese Entdeckungen wurden basierend auf der Rekonstitution von gereinigten Proteinen in Liposomen und Demonstration scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo die Methodik describ Verwendunghier ed. Andere potenzielle scramblases 15-21 - die MurJ und amj Proteine ​​in Peptidoglycan - Biosynthese beteiligt, WzxE und verwandte Proteine ​​verwickelt in Scrambling O-Antigen - Vorläufer, MPRF Protein benötigt aminoacylierten Phosphatidylglycerin über die bakterielle Cytoplasmamembran zu translozieren und Xkr8 Familienmitglieder , die vorgeschlagen wurden , PS auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten - bleiben biochemisch getestet werden. Dies unterstreicht die Bedeutung eines robusten Assays zu identifizieren und Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Hier beschreiben wir die Rekonstitution von gereinigten Opsin, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin, in große unilamellare Vesikel (LUVs) und anschließende Analyse der scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo eine fluoreszenzbasierten Assay. Es gibt mehrere gut beschriebenen Protokolle in der Literatur für die heterologe Expression und Reinigung von Opsin, deshalb werden wir nichtbeschreiben sie in diesem Protokoll; wir verwenden , um die in Goren beschriebenen Protokolle et al. 3 , die bei etwa 100 ng / &amp; mgr; l in 0,1% (w / v) Dodecylmaltosid (DDM) FLAG-markiertes, thermo Opsin ergibt. Die Rekonstitution wird durch die Behandlung LUVs mit ausreichend Waschmittel erreicht, so dass sie anschwellen, aber nicht lösen. Unter diesen Bedingungen wird ein Membranprotein - in Form von Protein-Mizellen Detergenz zugeführt - werden in die Liposomen zu integrieren und in die Liposomenmembran nach Entfernung des Detergens rekonstituiert geworden in Proteo führt. Zu rekonstituieren Opsin (als gereinigtes Protein erhalten in 0,1% (w / v) DDM) sind LUVs aus einem Gemisch aus POPC hergestellt (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn - glycero-3-phosphocholin) und POPG (1- Palmitoyl-2-Oleoyl - sn - glycero-3- [phospho-rac- (1-Glycerin)]) und mit DDM gesättigt vor dem Hinzufügen von Opsin und NBD-PC. Das Detergens wird dann durch Behandlung der Probe mit Polystyrolkügelchen entfernt. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Das Prinzip der Fluoreszenz basierenden Assay zugrundeliegende Aufgabe wird in 1B gezeigt. LUVs sind symmetrisch mit einer Spurenmenge von NBD-PC oder andere NBD-markierte fluoreszierende Phospholipid reporter (1A) rekonstituiert. Bei Zugabe von Dithionit, eine Membran-impermeablen Dianion, NBD-PC-Moleküle in dem äußeren Blatt der LUVs gerendert nichtfluoreszierenden als nitro-Gruppe von NBD ist mit einem nicht-fluoreszierenden Amino-Gruppe reduziert. Da weder NBD-PC-Moleküle noch Dithionit Lage sind, die Membran auf der Zeitskala des Versuchs (&lt;10 min) zu durchlaufen, ergibt dies 50% ige Reduktion des Fluoreszenzsignals. schnell nach außen kann jedoch, wenn die Liposomen mit einem scramblase, NBD-PC-Moleküle in der inneren Faltblatt rekonstituiert werden verwürfeln, wo sie reduziert sind. Daraus ergibt sich der Gesamtverlust der Fluoreszenz im idealen Fall (Abbildung 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scramblase Aktivitätstest Der Test verwendet eine fluoreszierende NBD-markierten Reporter Lipid; NBD-PC angezeigt wird (A). Große unilamellare Vesikel sind mit einer Spurenmenge von NBD-PC rekonstituiert. Rekonstitution erzeugt symmetrischen Vesikeln mit NBD-PC gleichmäßig verteilt in den äußeren und inneren Blättchen. Dithionit (S 2 O 4 2-) reduziert chemisch die Nitrogruppe von NBD zu einem nicht-fluoreszierenden amino-Gruppe. Die Behandlung von proteinfreien Liposomen mit Dithionit (B, oben) bewirkt eine 50% ige Reduktion der Fluoreszenz , da nur die NBD-PC - Moleküle in der äußeren Leaflet reduziert: Dithionit negativ geladen ist und die Membran nicht überqueren können mit NBD-PC - Moleküle reagieren im inneren Blatt. Dithionit Behandlung von Opsin haltigen Proteo (B, unten), dh scramblase aktive Proteo, Ergebnisse in 100% Verlust der fluorescence als Opsin erleichtert die Bewegung von NBD-PC zwischen dem inneren und dem äußeren Faltblatt. (C) zeigt idealisierte Fluoreszenzspuren erhalten bei der Behandlung von proteinfreien Liposomen und Opsin haltigen Proteo mit Dithionit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzverlust ist die gleiche in beiden Fällen das anzeigt, dass die chemische Reduktion von NBD von Dithionit ist geschwindigkeitsbestimmend, und das Verwürfeln bei einer Geschwindigkeit gleich oder größer ist als die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion auftritt. Spuren von einem tatsächlichen Experiment sind in Abbildung 3 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Methoden , die wir beschreiben , können verwendet werden , um andere gereinigten Proteine ​​zu rekonstituieren und Assay sowie Mischungen von Membranproteinen erhalten werden , beispielsweise durch Mikrosomen mit Waschmittel 22 zu extrahieren.

<table><tbody><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (Natriumsalz)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-Maltosid</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Fluorimeter Küvetten</td><td>Sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>Küvetten</td></tr><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>Fluorimeter</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrosulfit technische Qualität, 85%</td><td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>Dithionit</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 Software</td><td></td><td></td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml Extruder&nbsp;</td><td>Nördliche Lipide, Inc.</td><td></td><td>Extruder</td></tr><tr><td>Whatman, Ablaufscheibe, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Scheibenhalterung</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranen, 0,4 &; Mikro; m, 25 mm</td><td>Durchmesser Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm Membran</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 &micro; m, 25 mm Durchmesser</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm Membran</td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Kulturröhrchen, Einweg, Borosilikatglas, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>Glasröhrchen</td></tr><tr><td>Perchlorsäure</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniummolybdat Tetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>Ammoniummolybdat</td></tr><tr><td>(+)-Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>Natriumascorbat</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 Adsorptionsmittel</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>Polystyrolkügelchen</td></tr><tr><td>&nbsp; 2,0 ml Mikroröhrchen klar</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Rekonstitutionsröhrchen</td></tr><tr><td>Rekonstitutionsglasröhrchen</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Rekonstitutionsglasröhrchen</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

ein fluoreszenz-basierte assay von phospholipid scramblase activity

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases transloziert Phospholipiden durch die Membran-Doppelschicht in zwei Richtungen in einer ATP-unabhängige Art und Weise. Die erste scramblase werden identifiziert und biochemisch wurde Opsin prüft, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin. Rhodopsin ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor in Stabphotorezeptor Scheibenmembranen der Retina lokalisiert, wo es für die Wahrnehmung von Licht verantwortlich ist. Rhodopsin der Scramblase Aktivität nicht auf seinem Liganden abhängt 11- cis - Retinal, das heißt, das Apoprotein Opsin ist auch aktiv als Scramblase. Obwohl die konstitutive und reguliert Scrambling Phospholipid eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie zu spielen, nur wenige Phospholipid scramblases wurden bisher neben Opsin identifiziert. Hier beschreiben wir ein Fluoreszenz-basierten Assay von Scramblase Aktivität des Opsin. Opsin rekonstituiert in große unilamellare Liposomen aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin und eine Spurenmenge an fluoreszierenden NBD-markierten PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycero-3-phosphocholin). Scramblase Aktivität wird durch Messen der Größe der auf dem NBD-PC-Moleküle in dem inneren Blatt des Vesikels befindet sind in der Lage die äußere Faltblatt zuzugreifen, wo ihre Fluoreszenz chemisch durch ein Reduktionsmittel eliminiert wird, die die Membran nicht passieren kann. Die Methoden, die wir haben eine allgemeine Anwendbarkeit beschreiben und kann verwendet werden, Scramblase Aktivitäten anderer Membranproteine ​​zu identifizieren und zu charakterisieren.

Wir beschreiben die Rekonstitution von Opsin in LUVs unter Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays seiner Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Wir analysieren die Ergebnisse eine untere Grenze auf die Geschwindigkeit des Opsin-vermittelten Phospholipid zu platzieren Scrambling und die oligomere Zustand zu bestimmen, in dem Opsin funktionell in den Vesikeln rekonstituiert. Um eine optimale Rekonstituierung Bedingungen...

Wir beschreiben einen fluoreszenzbasierten Assay zur Messung von Phospholipid-Scrambling in großen unilamellären Liposomen, die mit Opsin rekonstituiert wurden.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen typischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor in große unilamellare Vesikel einzubauen und seine Fähigkeit zur 80p-unabhängigen Translokation von Phospholipiden über eine Lipiddoppelschicht mithilfe eines fluoreszenzbasierten Assays zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des interzellulären Lipidtransports zu beantworten, beispielsweise welche molekulare Identität Proteine besitzen, die Lipide umschleudern können, und welcher Mechanismus dahintersteht. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie sehr zuverlässig und robust ist.Wenn Sie einmal den Rekonstitutionsprozess für eine bestimmte Lipidzusammensetzung und ein bevorzugtes Detergens etabliert haben. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einer Glasspritze 1435 Mikroliter einer 25 Milligramm pro Milliliter Lösung von POPC und Chloroform in einen Rundkolben geben. Geben Sie 160 Mikroliter einer 25 Milligramm pro Milliliter Lösung von POPG und Chloroform hinzu, um 52,5 Mikromol Lipide im molaren Verhältnis von neun zu eins von POPC zu POPG zu erhalten.Anschließend trocknen Sie die Lipide 30 Minuten lang unter Verwendung eines Rotationsverdampfers, der auf 145 U/min eingestellt ist. Sobald das Trocknen abgeschlossen ist, überführen Sie das Gefäß drei Stunden lang bei Raumtemperatur in einen Vakuumexsikkator. Danach geben Sie 10 Milliliter Puffer A hinzu, um den getrockneten Lipidfilm zu hydratisieren.Vorsichtig das Kolben schwenken, bis sich eine homogene, trübe Suspension bildet. Die Suspension 10 Minuten lang bei einer Frequenz von 40 Kilohertz in einem Wasserbad bei Raumtemperatur beschallen. Anschließend die Probe mithilfe eines Extruders 10-mal durch eine Membran mit einer Porengröße von 400 Nanometern leiten.Führen Sie danach einen zweiten Extrusionszyklus durch, bei dem die Probe viermal durch eine Membran mit einer Porengröße von 200 Nanometern geleitet wird. Stellen Sie die resultierende optisch klarere Suspension beiseite, die große unilamellare Vesikel aus Phospholipiden mit einem Durchmesser von etwa 175 Nanometern enthält. Bereiten Sie nach Abschluss der Extrusion Standardlösungen in Glasröhrchen mit den Maßen 13 mal 100 Millimeter gemäß der schriftlichen Anleitung vor.Gegeben Sie anschließend 10 Mikroliter jeder LUV- und Proteoliposomenprobe in ein separates Glasröhrchen und verdünnen Sie mit 40 Mikrolitern deionisiertem destilliertem Wasser. Geben Sie 300 Mikroliter Perchlorsäure zu jedem Röhrchen hinzu und erhitzen Sie eine Stunde lang bei 145 Grad Celsius in einem Heizblock. Legen Sie einen Glasstopfen auf jedes Röhrchen, um Verdunstung zu verhindern.Dann lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie je ein Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser hinzu. Geben Sie je 400 Mikroliter einer frisch zubereiteten Lösung mit 12 Gramm pro Liter Ammoniummolybdat und 50 Gramm pro Liter Natriumascorbat hinzu und wirbeln Sie kräftig, um zu mischen. Erhitzen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius unter Verwendung von Glaskugeln, um Verdunstung zu verhindern.Entfernen Sie anschließend die Röhrchen vom Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Erstellen Sie mithilfe eines Spektrometers, das auf 797 Nanometer eingestellt ist, eine Kalibrierungskurve unter Verwendung der Standards. Messen Sie dann die Extinktion der Proben gegen die Blindprobe und bestimmen Sie den Phosphatgehalt.Beginnen Sie damit, 800 Mikroliter jeder extrudierten LUV-Suspension in eine separate 2-Milliliter-Mikrofusenprobe zu pipettieren. Geben Sie 5,3 Mikroliter Puffer A und 34,7 Mikroliter 10 %iger (Massen/Volumen) DDM-Lösung, gelöst in Puffer A, zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie anschließend die Proben drei Stunden bei Raumtemperatur unter End-over-End-Mischung.Während die Proben inkubieren, 400 Milligramm pro Probe an Kügelchen in einem Glasbecher abwiegen. Die Kügelchen mit je fünf Milliliter pro Probe Methanol waschen, dabei langsam 10 Minuten lang umrühren. Diese Waschung einmal für Methanol, dreimal mit Wasser und einmal mit Puffer A wiederholen. Während der letzten 30 Minuten der Probeneinwirkung, 9,5 Mikroliter pro Probe NBD-markiertes Phospholipid in einem Schraubverschluss-Glasröhrchen unter einem Strom von Stickstoff trocknen.Als Nächstes 45 µL pro Probe einer 0,1 % (Masse/Volumen) DDM-Lösung in Puffer A hinzufügen, um das getrocknete Phospholipid aufzulösen. Nach Abschluss der Inkubation die gelöste, mit MBD markierte Phospholipidlösung zu jeder Probe hinzufügen. Danach in der angegebenen Reihenfolge 0,1 % DDM, Puffer A und das DDM-solubilisierte Opsin in der gewünschten Menge hinzufügen, um ein Endvolumen von einem Milliliter mit einer Konzentration von sieben Millimolar DDM zu erhalten.Die Rekonstitution eines Membranproteins erfolgt durch Behandlung von Vesikeln mit ausreichend Detergens, sodass die Schwellung nicht aufgelöst wird. Unter diesen Bedingungen, die für jede Lipidzusammensetzung und jedes Detergens empirisch ermittelt werden müssen, integriert das Protein in die Liposomen. Vermischen Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Fügen Sie dann 80 Milligramm der hergestellten Polystyrolkügelchen zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie erneut eine Stunde bei Raumtemperatur mit End-over-End-Mischen. Geben Sie zusätzlich 160 Milligramm Polystyrolkügelchen zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit End-over-End-Mischen. Nach Beendigung der Inkubation überführen Sie die Proben unter Zurücklassen der Kügelchen in saubere Glasröhren, die jeweils 160 Milligramm frische Kügelchen enthalten.Mischen Sie über Kopf über Nacht bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt. Überführen Sie anschließend die Proben ohne die Kügelchen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie die Röhrchen zur Vorbereitung auf den Scramblasen-Aktivitätsassay auf Eis.Beginnen Sie damit, 1950 Mikroliter Puffer A in ein Kunststoffküvettengefäß mit einem magnetischen Rührstab zu geben. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter der hergestellten Proteoliposomenprobe hinzu. Lassen Sie die Probe unter ständigem Rühren fünf Sekunden lang im Fluoreszenzspektrometer äquilibrieren.Während die Probe im Gleichgewicht ist, bereiten Sie eine Lösung von einem Mol Dithionit in 0,5 Mol ungebufferter Tris vor. Beginnen Sie die Fluoreszenzüberwachung mit einer Anregung von 470 Nanometern, einer Emission von 530 Nanometern und einer Spaltbreite von 0,5 Nanometern. Nehmen Sie 50 Sekunden lang auf, um ein stabiles Signal zu erhalten.Fügen Sie anschließend 40 µL einer einmolarigen Dithionit-Lösung in die Küvette hinzu. Nehmen Sie die Fluoreszenz über mindestens 500 Sekunden auf. Analysieren Sie abschließend die Daten gemäß der schriftlichen Anleitung.Für eine vollständige Analyse der Fluoreszenzdaten, wenn der Anteil der Vesikel bestimmt werden soll, die nicht rekonstituiert werden können. Die Rückgewinnung von Proteinen und Lipiden in den rekonstituierten Vesikeln sowie die Größenverteilung der Vesikel. In dieser Studie wird Opsin in große unilamellare Vesikel rekonstituiert, um seine Scramblase-Aktivität mittels eines fluoreszenzbasierten Assays zu charakterisieren.Die Vesikel werden mit NBD-PC rekonstituiert, das sich gleichmäßig auf die äußere und innere Lipid-Doppelschicht verteilt. Dithionit reduziert die Nitrogruppe von NBD auf der Außenseite des Vesikels zu einer nicht-fluoreszierenden Aminogruppe, was bei proteinfreien Liposomen zu einer 50 %igen Abnahme der Fluoreszenz führt. Wenn jedoch Opsin die Bewegung von NBD zwischen der inneren und äußeren Lipid-Doppelschicht erleichtert, kommt es zum vollständigen Verlust der Fluoreszenz.Die repräsentativen Ergebnisse dieses Ansatzes bei verschiedenen Protein-zu-Phospholipid-Verhältnissen sind hier dargestellt. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität nimmt mit der Menge an in Vesikel rekonstituiertem Opsin zu, die zwischen null und 4,95 Mikrogramm variiert. Dithionit wurde zum angegebenen Zeitpunkt hinzugefügt, und die NBD-Fluoreszenz wurde über 400 Sekunden verfolgt.Die Fluoreszenzreduktion ist bei höheren Protein-zu-Phospholipid-Verhältnissen stärker ausgeprägt, wobei die größte Reduktion 85 % beträgt. Die Fluoreszenzreduktion am Endpunkt wird anschließend verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Scramblase-Aktivität zu bestimmen, also die Wahrscheinlichkeit, dass Vesikel mindestens eine Scramblase enthalten, basierend auf der Polson-Statistik. Die rote Kurve stellt eine monoexponentielle Anpassung für Opsin dar. Die gestrichelten grauen Linien repräsentieren hingegen monoexponentielle Anpassungen für die Rekonstitution von Opsin in Vesikel als Monomere, vorformierte Dimere oder vorformierte Tetramere.Die von uns beschriebene Methode lässt sich leicht an unterschiedliche Anforderungen anpassen. Die Verfahren sind vielseitig einsetzbar und können zukünftig zur Identifizierung und Charakterisierung der Phospholipid-Scramblase-Aktivität anderer Membranproteine verwendet werden. Das Rekonstitutionsverfahren kann auf jedes Membranprotein angewendet werden.Mithilfe dieser Technik konnten wir Opsin als die erste biochemisch verifizierte Phospholipid-Scramblase identifizieren und anschließend die Aktivität unterschiedlicher Konformationszustände des Proteins sowie dessen Fähigkeit zur Transportierung verschiedener Lipide charakterisieren.

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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Ein Liposomenmembran-Permeabilitätsassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Phosphatidylinositolphosphatgruppen auf die membranotrope Wirkung des Giftes PLA2

Erfahren Sie einen Fluoreszenz-basierten Assay zur Messung der Phospholipid-Scramblase-Aktivität in Liposomen mit rekonstituiertem Opsin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen des interzellulären Lipidtransports.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

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