Name: Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Fluoreszenzanisotropie zur quantitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen zwischen SBDS und EFL1 eingesetzt wird. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die zelluläre Funktion und die Biochemie.

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Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die CONACyT-Projektnummern 167359 und 177138 und durch die DGAPA-UNAM-Projektnummer IN201615.

1. SBDS-Flash Tag Proteinexpression und -reinigung HINWEIS: Für die Anisotropie Experimenten wurde eine FlAsH-tag entsprechend der Sequenz Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys an den C-Terminus des humanen SBDS hinzugefügt wurde durch PCR-codierende Sequenz. Dieses Konstrukt wurde der Expressionsvektor pRSET-A subkloniert und in Escherichia coli C41 - Zellen transformiert , um ein Protein exprimieren Codieren eines N-terminalen Hexahistidin - Tag (His-Tag), die menschlichen SBDS kodierenden Sequenz und einen C-Terminus Flash Tag 10. <ol><li> SBDS-FlAsH Proteinexpression <ol><li> Transformation von kompetenten E. coli C41 - Zellen mit dem Plasmid pRSET-HisSBDS-Blitz , ein Standard Hitzeschock - Protokoll 19. Platte, die die Zellen in fester Luria-Bertani (LB) Medium mit 100 ug / ml Ampicillin ergänzt. LB feste Medien Zusammensetzung besteht aus 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 20 g Agar für 1 l Volumen. </li><li> Kultur transformierten Bakterien bei 37 ° C, bisExtinktion bei 600 nm (A 600) erreicht 0,5-0,7 in 1 l LB - Flüssigmedium mit 100 ug / ml Ampicillin ergänzt. </li><li> Induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid zur Kultur und weiterhin die Inkubation für weitere 5 Std. </li><li> Sammeln Sie die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Zu diesem Zeitpunkt entweder speichern Sie die Zellpellet bei -20 ° C oder verwenden Sie sofort zur Proteinreinigung. </li></ol></li><li> SBDS-FlAsH Proteinreinigung HINWEIS: Alle chromatographischen Schritte werden eine schnelle Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) -Systems oder eine peristaltische Pumpe. Ni 2+ -Affinitätschromatographie verwendet eine 5 ml Fast Flow - Säule. Anionenaustauschchromatographie verwendet ein 5 ml stark sulfopropyl Kationenaustauschersäule. Eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min wurde für alle chromatographischen Schritten verwendet. <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 35 ml Lysis b SBDSUffer (50 mM Phosphatpuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol), ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Lyse durch Beschallung für eine Gesamtzeit von 4 min Zyklen von 10 sec zum Verwenden und 30 sec OFF, bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 9000 × g für 50 min bei 4 ° C. </li><li> Halten Sie den Überstand und verwerfen das Pellet Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Äquilibrieren der Ni 2+ Affinitätssäule mit 3 Säulenvolumina (CV) von SBDS Lysis - Puffer und führen die gesamte Überstand auf die Säule geklärt. </li><li> Entfernen ungebundenen Proteins durch Waschen mit 3 CV des SBDS Lysis-Puffer und Eluieren mit 3 CV des SBDS Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol). </li><li> Verdünne das eluierte Protein 6-fach mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5 und Entfernen möglich Aggregate durch Filtration durch einen 0,22 &amp; mgr; m Cellulosemembran. </li><li> Äquilibrieren der sulfopropyl Kationenaustauschersäule mit 3 CV von Low-Salz-S-SäulePuffer (50 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 50 mM NaCl) und die Proteinprobe aus dem vorherigen Schritt einzuführen. </li><li> Wasch ungebundenes Material mit 3 CV des Low Spaltenpuffersalz S und das Protein in einem Schritt mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 1 M NaCl eluieren. </li><li> Verdünne das eluierte Protein 3,3-fach mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,5. Konzentriere das Protein mit Ultrafiltrationseinheiten durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 15 min. Blitzeis, das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Überprüfen , um die Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE - Analyse und Coomassie - Färbung 20. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expression and Purification HINWEIS: EFL1 wurde unter der Regulation des divergenten Promotors 21 1/10 Gal exprimiert und das Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR in dem Vektor pRS426. Das rekombinante Protein codiert, das menschliche EFL1 Isoform 1 auf einen Etch Virus Protease Tabak fusioniert (TEV) Erkennungsstelle und ein Hexahistidin-Tag am C-Terminus. <ol><li> EFL1 Proteinexpression <ol><li> Verwandeln S. cerevisiae BCY123 Zellen mit dem Plasmid pRS426-EFL1TevHis ein Standard - Lithium - Acetat - Protokoll 22. Platte alle transformierten Zellen in synthetischen Dropout Medien ohne Uracil (SD-Ura), ergänzt mit 2% (w / v) Glukose. Zusammensetzung der SD-URA Medien besteht aus 8 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 11 g Casaminosäuren, 55 mg Adenin Sulfat, 55 mg Tyrosin, 60 mg Leucin und 60 mg Tryptophan für 1 L Volumen. </li><li> Kultur transformierter Hefe bei 30 ° C bis 600 A 1.8 in 1 l SD-URA - Medien mit 0,5% (w / v) Glucose ergänzt erreicht. </li><li> Induzieren Proteinexpression durch Zugabe von 2,8% (w / v) Galactose zu der Kultur und weiterhin die Inkubation für weitere 18 Stunden bei 30 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Hefesuspension durch Zentrifugation bei 3.800 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.Zu diesem Zeitpunkt entweder speichern Sie die Zellpellet bei -20 ° C oder verwenden Sie sofort zur Proteinreinigung. </li></ol></li><li> EFL1 Proteinreinigung HINWEIS: Alle chromatographischen Schritte werden ein FPLC-System oder eine peristaltische Pumpe. Ni 2+ -Affinitätschromatographie verwendet eine 5 ml Fast - Flow - Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min. Grßenausschlußchromatographie verwendet eine 125 ml-Säule vorverpackt mit Superdex 200-Harz mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 50 ml EFL1 Lysis - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin) , ergänzt mit 1 mM PMSF und 1 mM Benzamidin und stören die Zellen durch Reibung auf einer Perlmühle beater mit Glasperlen (Ø = 0,5 mm) für eine Gesamtzeit von 6 min mit Zyklen von 2 min und 15 min oN OFF, bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 9000 × g für 50 min bei 4 ° C. </li><li> Halten Sie den Überstand und verwerfen das Pellet Zelltrümmer zu entfernen. </li&gt; <li> Äquilibrieren Sie die Ni 2+ Affinitätssäule mit 3 CV von EFL1 Lysepuffer und einzuführen alle geklärte Überstand auf die Säule. </li><li> Entfernen ungebundenen Proteins durch Waschen mit 3 CV des EFL1 Lysis - Puffer und Eluieren mit 3 CV des EFL1 Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerol). </li><li> Äquilibrieren der Grßenausschluß - Säule mit 1,5 CV von Anisotropy - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol). </li><li> Konzentrat zu 1 ml der EFL1 Protein aus der Säule 2+ Affinitäts Ni eluiert mit Ultrafiltrationseinheiten durch Zentrifugation bei 3.800 xg auf das gewünschte Volumen. Einzuführen, um die Probe auf der Grßenausschlußsäule. </li><li> Sammeln der eluierten Protein und konzentriert durch Ultrafiltration bis zu einer Endkonzentration von etwa 30 uM. Blitzeis, das Protein in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Stellen Sie sicher, the Reinheit des Proteins durch SDS-PAGE - Analyse und Coomassie - Färbung 20. </li></ol></li></ol> 3. Kennzeichnung von SBDS-FlAsH mit dem Flash-Fluoreszenzfarbstoff 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein <ol><li> Mix 3 nmol des SBDS-FlAsH Protein mit 3 nmol des 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein Farbstoff in 5 &amp; mgr; l Volumen von Anisotropy Puffer. </li><li> Ließ die Reaktion für 8 h bei 4 ° C stattfindet. Dialysiere die Probe gegen Anisotropy Puffer über Nacht, um den freien Farbstoff zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie das Lambert-Beer-Gesetz die% des markierten Proteins zu quantifizieren. Messen der Extinktion bei 280 nm und 508 nm in einem Spektrophotometer eine Quarzküvette geeigneter Lautstärke. HINWEIS: Beachten Sie die folgenden molaren Absorptionskoeffizienten (M -1 cm -1): <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Berechnen Sie die Konzentration des markierten SBDS-FlAsH Protein unter Verwendung von Gleichung 2. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Berechnen Sie die Konzentration des gesamten SBDS Protein unter Verwendung von Gleichung 3 durch den berechneten C SBDS-FlAsH aus dem vorherigen Schritt zu ersetzen. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Der prozentuale Anteil von markiertem Protein unter Verwendung von Gleichung 4. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Fluoreszenzanisotropiemessungen Experimente HINWEIS: Anisotropy Experimente wurden in einem Spectrofluorometer getan, ausgestattet mit einem Polarisations Toolbox und die Datenerhebung wurde in der Software des Geräts bereitgestellt, um die Anisotropie-Programm durchgeführt werden. Die Anregungswellenlänge wurde bei 494 nm mit einer spektralen Bandbreite von 8 nm eingestellt und die Emission wurde mit einem Bandpassfilter von 530 ± 25 nm aufgezeichnet. Die Messungen wurden bei 25 ° C in einem 200 &amp; mgr; l Küvette mit einem 5 mm Weglänge 10 durchgeführt. <ol><li><html> In einer Fluoreszenzküvette legen 200 ul 30 nM SBDS-FlAsH Anisotropie Puffer und titrieren 2 ul 30 uM EFL1. Gut mischen und lassen Sie die Reaktion für 3 Minuten stehen, bevor die Anisotropie Wert zu messen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.1 bis ein Gesamtvolumen von 40 ul EFL1 wurde hinzugefügt. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Montieren Sie die Daten an die entsprechende Bindungsmodell eine nicht-lineare Regression der kleinsten Quadrate-Algorithmus. Die Gleichungen für die gängigsten Bindungsmodelle sind in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Bewerten Sie das beste Modell, das die Wechselwirkung zwischen den Proteinen beschreibt , indem sie die Reste des Sitzes 23 Inspektion. Unterstützen Sie das gewählte Modell mit weiteren Experimenten. </li></ol> Tabelle 1. Gemeinsame Protein-Protein - Wechselwirkung Bindungsmodelle und die mathematischen Gleichungen , die sie beschreiben.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

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Die Autoren haben nichts offenzulegen und sie haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die meisten biochemischen Experimenten mit Proteinen erfordern nicht nur reines Protein, sondern auch große Mengen von ihnen unabhängig von der verwendeten Technik. Aus diesem Grund werden die Proteine ​​für diese Art von Versuchen verwendet werden, durch die heterologe Expression erhalten wird, wie es der Fall vorgestellt hier war. Florescence Spektroskopie erfordert die Anwesenheit eines Fluorophors in der untersuchten Moleküls. Aromatische Reste darstellen, die intrinsischen Fluorophoren eines Proteins jedoch ihr Sig...

Zellen enthalten eine Vielzahl von Biomakromolekülen, die ständig miteinander in Wechselwirkung treten. Diese Vereinigung führt zu Komplexen, die in den zellulären Wege, die für ihre Funktion in der Signaltransduktion, die Regulation der Genexpression und der Zellmigration unter anderem teilnehmen. Alle Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in einer Zelle auftreten, umfassen ein Netzwerk wie das Interaktom bekannt. In Saccharomyces cerevisiae mehr als 70% ihrer Proteine wurden Interaktionspartner 1 gezeigt zu haben. Das Verständnis der Interaktom einer Zelle und deren Funktionen liefern relevante Informationen über die Komplexität und Vielfalt der Lebewesen. Verschiedene Methoden wurden Protein-Protein-Interaktionen beschrieben zu identifizieren und zu charakterisieren. Verschiedene Hochdurchsatzverfahren, wie Hefe - Zwei-Hybrid - 2 - Protein-Fragment Komplementierung Assays 3, Affinitätsreinigung 4 gekoppelt mit der Massenspektrometrie und Protein microarrays verwendet 5,6 eine Interaktion zu identifizieren. Einmal identifiziert, ist es notwendig, sie zu überprüfen und diese auf einer Fall-zu-Fall-Basis variieren. Typischerweise umfassen diese Versuche die Wechselwirkung selbst auf der Ebene der einzelnen Mitglieder des Wechselwirkungspaares zu stören, beispielsweise durch Gendeletion oder Überexpression eines der Proteine, und dann auf Änderungen in den Eigenschaften oder der Funktion des anderen Elements bei der Suche zellulärer Ebene. Anschließend werden biophysikalische Techniken 7 verwendet , um die Protein-Protein - Wechselwirkung auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck sind die Struktur von Protein-Komplexe, die durch Röntgenkristallographie bestimmt, kernmagnetische Resonanz und Kryo-Elektronenmikroskopie während Kalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, um quantitativ und sie mechanistisch beschreiben. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzanisotropie als eine Technik verwendet, um die Wechselwirkung zwischen dem GTPase EFL1 und der SBD zu charakterisierenS-Protein. Diese Proteine beteiligen sich an der Synthese von Ribosomen durch die Freisetzung von eukaryotischen Initiationsfaktor Förderung 6 von der Oberfläche der 60S ribosomalen Untereinheit 8. Das SBDS Protein wird in einer Krankheit als Shwachman-Diamond - Syndrom 9 und wirkt als ein Guaninnukleotid - Austauschfaktor für EFL1 abnehm seine Affinität für Guanosindiphosphat 10,11 bekannt mutiert. Krankheit Mutationen in SBDS die Interaktion mit EFL1 abzuschaffen und somit ihre Aktivierung verhindern. Fluoreszenzanisotropie wird in biologischen Anwendungen zu untersuchen Protein-Peptid- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen verwendet. Sie basiert auf dem Prinzip, dass ein Fluorophor mit polarisiertem Licht führt zu einer teilweise polarisierte Emission angeregt. Fluoreszenzanisotropie wird durch Gleichung 1 definiert: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> wo ich VV und ich VH sind dieFluoreszenzintensitäten des vertikal (VV) und horizontal (VH) polarisierte Emission , wenn die Probe angeregt wird , mit vertikal polarisiertem Licht 12. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber Faktoren, die die Geschwindigkeit der Rotationsdiffusion des Fluorophors beeinflussen und somit abhängig von der Temperatur, der Viskosität der Lösung und die scheinbare Molekülgröße des Fluorophors. Die scheinbare Grße eines Proteins ein Fluorophor enthält, erhöht, wenn es mit einem anderen Protein und eine solche Änderung in Wechselwirkung kann dann als eine Änderung der Anisotropie ausgewertet werden. Genauer gesagt, der Wert und kleiner I VH Wert mit einem großen I VV und daher eine relativ große Anisotropie wird zeigen müssen ein Fluorophor, die sich langsam in Lösung relativ zu seiner Fluoreszenzlebensdauer dreht. Für Fluorophore, die sich schnell in Bezug auf ihre Fluoreszenzlebensdauer im Trockner, ich VV und ich VH wird wird ähnlich und ihre Anisotropie sein klein sein 12 </sup&gt; (Abbildung 1). Darüber hinaus ist für eine gute Anisotropie Signal-Rausch-Messung ist es notwendig, ein Fluorophor mit einer Fluoreszenzlebensdauer ähnlich der Rotationskorrelationszeit des Moleküls von Interesse zu haben. Andernfalls ist es nicht möglich, genau den Unterschied in der Anisotropie zwischen dem freien Protein aufnehmen, und dass in der Anlage. Zum Beispiel kann die Anisotropie einer fluoreszierenden Sonde mit einer Lebensdauer der Nähe von 4 nsec, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamin zu einer niedermolekularen Verbindung gebunden von 100 Da beträgt 0,05. Die Bindung an ein Molekül von 160 kDa seine Anisotropiewertes auf 0,29 zu erhöhen; ein Unterschied, der genau gemessen werden kann. Im Gegensatz dazu ging es um die gleiche Fluoreszenzsonde in einer Bindungsreaktion, deren Anstieg in Molekülgröße variiert von 65 bis 1.000 kDa führt nur in einer Anisotropie Änderung von 0,28 bis 0,3 ist, die zu klein ist, genau gemessen werden. In diesem Szenario wäre eine Sonde mit einer Lebensdauer von 400 ns mehr geeignet 12. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz - Anisotropie und die Prozedur. Schematische Darstellung der verwendeten Ausrüstung verwendet , um eine Protein-Protein - Wechselwirkung Experiment die Messung der Fluoreszenz - Anisotropie auszuführen. Fluorophore , die schnelle Anzeige geringe Anisotropie im Trockner , die bei der Bindung an einen Wechselwirkungspartner erhöht. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Fluoreszenzanwendungen erfordern das Vorhandensein eines Fluorophors in einem der untersuchten Moleküle. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt es drei Arten von Fluorophore: 1) die Tryptophan-Reste in den Proteinen, 2) chemisch gebunden Fluorophore und 3) fluoreszierende Fusionspartner wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) und dessen derivativen. Die meisten Proteine ​​haben Tryptophanreste auf seine Struktur und damit die einfachste Weg, um eine Interaktion zu messen, ist durch die Änderungen in dem entsprechenden Fluoreszenzspektren Überwachung oder durch Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der Tryptophanreste zu überwachen. Jedoch können Tryptophanreste in beiden Proteinen vorhanden sein, die Analyse erschwert wird. Auf der anderen Seite, für ein Fluorophor aufgrund einer Wechselwirkung muss seine fluoreszierenden Eigenschaften ändern sie auf oder in der Nähe der Bindungsstelle lokalisiert werden und es könnte mit der Interaktion selbst stören. Dies erfordert besondere Aufmerksamkeit, wenn sperrige Fluorophore wie GFP verwenden. Wenn keine dieser Fluorophore können für Bindungsstudien verwendet werden, ist es notwendig, dann, um extrinsische Fluorophore an die eine der beteiligten Proteine ​​einzuführen. Viele chemisch synthetisierte Fluorophore existieren und können kovalent an Proteine ​​über ihre reaktiven Gruppen, wie den Amingruppen (Seitenkette von Lysinen oder N-Terminus) und die Thiolgruppen in Cystein gebunden sein. Fluorophore Derivate mit Isothiocyanat und Succinimidylester reagieren mit Amidgruppen während iodoacetamide und Maleimid sind thiolreaktives Gruppen 13. Die am häufigsten verwendeten Farbstoffe in Fluoreszenzanwendungen verwendet werden, sind Derivate des Fluorescein und Rhodamin grüne Farbstoffe, Cumarine, BODIPY Fluorophore und Alexa Fluor Farbstoffe. Eine detaillierte Liste der im Handel erhältlichen Fluorophore und ihre Verwendung finden Sie in Referenzen 14,15 gefunden werden. Für eine erfolgreiche Markierung muss die reaktive Gruppe auf der Oberfläche des Proteins exponiert werden, aber aufgrund der großen Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen typischerweise in Polypeptiden ist es sehr schwer ortsspezifische Modifikation zu erhalten. Das Protein von Interesse in dieser Studie SBDS, enthält 5 freie Cysteine ​​und 33 Lysine, die in mehreren Standorten Kennzeichnung führen kann. Uneinheitliche Kennzeichnung kann die Bindung beeinflussen und Datenanalyse komplizieren als unterschiedliche Fluorophormoleküle unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätssignale bei der Bindung auslösen kann. ÖVErcome dieses Problem haben wir den FlAsH Fluorophore, 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein orts direkt das SBDS Protein-Label. Dies ist ein arsenoxide Farbstoff mit einer hohen Affinität für vier beabstandete Cysteine in einem Motiv kennen als Flash-tag der Sequenz CCXXCC aus wobei X für jede Aminosäure außer Cystein ist 16,17. Dieses Motiv wird Tetracysteinmotiv gentechnologisch zusammen mit einem geeigneten Linker an den N- oder C-Terminus des Proteins hinzugefügt, um die Störung des Gesamtfaltung des Proteins zu verhindern. Das Paar , das aus FlAsH Farbstoff und FlAsH-Tag wurde ursprünglich auf ortsspezifische Label Proteine entwickelt in lebenden Zellen 17 , sondern es kann auch gereinigte Proteine verwendet werden , in vitro zu beschriften , wie sie hier veranschaulicht wird. Zusätzlich haben enzymatische Strategien auch 18 ortsspezifische Funktionalisierung von Proteinen zu ermöglichen , entwickelt worden. In diesem Manuskript beschreiben wir die Nützlichkeit von Fluoreszenzanisotropiemessungen einsa Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bindung kann durch einfache Inspektion der Bindungskurvenform bewertet werden, während quantitative Informationen können aus der Anpassung der experimentellen Daten erhalten werden.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Glasperlen</td><td>Biospec Produkte</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Ultrareines</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Farbstoff 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Dieses Kit enthält den Farbstoff zur Markierung eines FlAsH-Tags</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose wasserfrei</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galactose</td><td>Formedium</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Formedium</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Bezamidinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Phenylmethylsulfonylfluorid</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Natriumchlorid&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Kaliumphosphat zweibasisches</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Natriumphosphat monobasische</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäuren</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Mikrogranulat</td></tr><tr><td>L-Tyroisn</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casaminosäuren</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Filtrationseinheiten</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, Membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Membranfilter</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Membranfilter, gemischte Celluloseester, hydrophil, 0,22&nbsp; &Mikro; m, 47&nbsp; mm, weiß, blank</td></tr><tr><td>Ni2+ Affinitätssäule</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Kartusche vorgefüllt mit 5&nbsp; ml Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Starke Sulfopropyl-Kationenaustauscher-Säule</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Größenausschlusssäule</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Fluoreszenzzelle</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Tisch-Temperaturbereich Umgebungstemperatur-15° bis 60° C</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Abgekündigtes</td><td>FPLC-System Leitfähigkeit UV-MM II Monitor P500 Pumpenfraktion</td></tr><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>Olis</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Olis DM 45 mit Polarisation Toolbox</td></tr></tbody></table>

fluoreszenzanisotropiemessungen als werkzeug protein-protein-interaktionen zu untersuchen

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-Protein-Interaktionen spielen eine wesentliche Rolle in der Funktion eines lebenden Organismus. Sobald eine Interaktion identifiziert und validiert ist es notwendig, sie auf die strukturelle und mechanistische Ebene zu charakterisieren. Mehrere biochemische und biophysikalische Methoden existieren für solche Zwecke. Unter ihnen ist Fluoreszenzanisotropie eine leistungsfähige Technik insbesondere verwendet, wenn die Fluoreszenzintensität eines Fluorophor-markierten Proteins konstant bleibt auf Protein-Protein-Interaktion. In dieser Technik wird ein Fluorophor markiertes Protein ist mit vertikal polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt, die selektiv eine Untergruppe der Fluorophore entsprechend ihrer relativen Orientierung mit dem ankommenden Strahl erregt. Die resultierende Emission hat auch eine Direktionalität , deren Beziehung in der vertikalen und horizontalen Ebenen definiert Anisotropie (r) wie folgt: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), wobei I VV und I <sub&gt; VH sind die Fluoreszenzintensitäten der vertikalen und horizontalen Komponenten, respectively. Fluoreszenzanisotropie ist empfindlich gegenüber der Rotationsdiffusion eines Fluorophors, nämlich die scheinbare Molekülgröße eines Fluorophors an ein Protein gebunden, die auf Protein-Protein-Wechselwirkung verändert wird. In dem vorliegenden Text ist die Verwendung von Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu studieren, wurde beispielhaft die Bindung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und den Elongationsfaktor like-1-GTPase (EFL1) mutiert zu adressieren. Herkömmlicherweise Markierung eines Proteins mit einem Fluorophor ist auf der Thiol-Gruppen (Cystein) oder in den Aminogruppen (die N-terminale Amin oder Lysin) ausgeführt des Proteins. Allerdings besitzt SBDS mehrere Cysteine ​​und Lysine, die nicht ortsgerichtete Kennzeichnung es erlauben. Als alternative Technik, dem Farbstoff 4 &#39;, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein wurde verwendet, spezifisch ein Motiv Tetracysteinmotiv zu etikettieren, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetisch in dem C-Terminus des rekombinanten Proteins SBDS konstruiert. Fitting der experimentellen Daten bereitgestellt quantitative und mechanistische Information über den Bindungsmodus zwischen diesen Proteinen.

Auszuführen Experiment jede Anisotropie ist es wichtig, große Änderungen in der Fluoreszenzintensität des Fluorophors, um auszuschließen, da die beobachtete Anisotropie eines Gemisches von Spezies, die durch die Gleichung 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> wobei F i die fraktionierte Fluoreszenz jeder Komponente u...

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse mithilfe der Fluoreszenzanisotropie zu bewerten und zu quantifizieren. Solche Messungen können helfen, zentrale Fragen in der Proteinbiochemie und Proteinbiophysik zu beantworten, beispielsweise solche, bei denen Proteinwechselwirkungen für die zelluläre Funktion von Bedeutung sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir quantitative und qualitative Informationen über die Protein-Protein-Interaktion erhalten können. Um gereinigtes SBDS-FlAsH-Protein herzustellen, bereiten Sie zunächst einen Liter flüssiges LB-Medium, ergänzt mit 100&nbsp;Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, vor. Kultivieren Sie darin transformierte Bakterien bei 37&nbsp;Grad Celsius, bis die optische Dichte bei 600&nbsp;Nanometern Werte zwischen 0,5 und 0,7 erreicht.Induzieren Sie die Expression des SBDS-FlAsH-Proteins durch Zugabe von 0,5 Millimolar IPTG zur Kultur und setzen Sie die Inkubation fünf weitere Stunden fort. Sammeln Sie anschließend die bakterielle Suspension durch Zentrifugation bei 3800 ×g zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand.Suspendieren Sie die Zellen erneu

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

Dieses Video demonstriert die Technik der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Homo-Oligomerisierung von Proteinen. Fluoreszenzmarkierte Proteine in einer Probe werden bei der Untersuchung der Proteinoligomerisierung mit FFS mit einem Wirkstoff dimerisiert. Während sich die Proteine in das kleine Beobachtungsvolumen hinein- und herausbewegen, wird mit einem konfokalen Mikroskop die Analyse der Helligkeitsschwankungen der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt, um den...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Anisotropie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor-markierten Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS)-Protein und der Elongationsfaktor-ähnlichen 1 GTPase (EFL1) zu untersuchen. Bei der Inkubation von SBDS-Proteinen mit allmählich steigenden Konzentrationen von EFL1 wird ein stetiger Anstieg der Anisotropie beobachtet, was auf eine erfolgreiche Interaktion zwischen den beiden Proteinen hinweist.

Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Dieses Video beschreibt eine Hochleistungs-Fluoreszenzanisotropie, die hilft, die Interaktion zwischen Transkriptionsfaktoren und DNA zu überwachen. Der Assay überwacht die Wechselwirkungen eines Fluorophor-markierten DNA-Moleküls mit seinem spezifischen Transkriptionsfaktor, indem er den Polarisationsgrad aufgrund der molekularen Rotation oder Anisotropie der Fluorophor-markierten DNA misst.

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dreifarbigen SmFRET Daten und deren Auswertung mit einem 3D-Ensemble Hidden-Markov-Modell zu erhalten. Mit diesem Ansatz können Wissenschaftler kinetische Informationen aus komplexen Protein Systeme, einschließlich der Kooperativität oder korrelierte Interaktionen extrahieren.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Hier stellen wir das Protokoll vor, um die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie auf Einzelmolekülebene im konfokalen Mikroskopiemodus zu untersuchen.

Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

Erfahren Sie, wie Fluoreszenzanisotropie zur quantitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen zwischen SBDS und EFL1 eingesetzt wird. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die zelluläre Funktion und die Biochemie.

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

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