Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen von Interesse mithilfe der Fluoreszenzanisotropie zu bewerten und zu quantifizieren. Solche Messungen können helfen, zentrale Fragen in der Proteinbiochemie und Proteinbiophysik zu beantworten, beispielsweise solche, bei denen Proteinwechselwirkungen für die zelluläre Funktion von Bedeutung sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir quantitative und qualitative Informationen über die Protein-Protein-Interaktion erhalten können. Um gereinigtes SBDS-FlAsH-Protein herzustellen, bereiten Sie zunächst einen Liter flüssiges LB-Medium, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, vor. Kultivieren Sie darin transformierte Bakterien bei 37 Grad Celsius, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern Werte zwischen 0,5 und 0,7 erreicht.

Induzieren Sie die Expression des SBDS-FlAsH-Proteins durch Zugabe von 0,5 Millimolar IPTG zur Kultur und setzen Sie die Inkubation fünf weitere Stunden fort. Sammeln Sie anschließend die bakterielle Suspension durch Zentrifugation bei 3800 ×g zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie die Zellen erneut in 35 Milliliter SBDS-Lysepuffer, der mit einem Millimolar PMSF ergänzt wurde. Lyse durch Beschallung für eine Gesamtdauer von vier Minuten unter Verwendung von Zyklen mit zehn Sekunden Einschaltzeit und 30 Sekunden Ausschaltzeit bei vier Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 9.000 × g für 50 Minuten bei vier Grad Celsius.

Behalten Sie das Überstand und verwerfen Sie das Pellet, um zelluläre Trümmer zu entfernen. Nachdem die Nickelaffinitäts-Säule mit drei Säulenvolumina SBDS-Lysepuffer ausgewaschen wurde, geben Sie den gesamten geklärten Überstand auf die Säule. Entfernen Sie das nicht gebundene Protein durch Waschen mit drei Säulenvolumina SBDS-Lysepuffer.

Nach der Säulenspülung eluieren Sie das gebundene Protein mit drei Säulenvolumina SBDS-Elutionspuffer. Um das Protein weiter zu reinigen, equilibrieren Sie die Sulfopropyl-Kationenaustauschersäule mit drei Säulenvolumina Low-Salt-S-Säulenpuffer. Verdünnen Sie das Protein sechsfach mit 50 Millimolar Phosphatpuffer pH 6,5 und geben Sie es auf die Säule.

Waschen Sie das nicht gebundene Material mit drei Säulenvolumina Low Salt S-Säulenpuffer. Anschließend eluieren Sie das Protein in einem Schritt, indem Sie 50 Millimolar Phosphatpuffer pH 6,5, 1 Molar Natriumchlorid auf die Säule geben. Verdünnen Sie das Eluat dreifach mit 50 Millimolar Phosphatpuffer pH 6,5.

Anschließend konzentrieren Sie das Protein mithilfe von Ultrafiltrationsgeräten durch Zentrifugation bei 3800 × g für 15 Minuten. Die Qualität der Proteine, die in dieser Art von Experiment verwendet werden, ist sehr entscheidend. Die Interpretation der Daten wird kompliziert, wenn die verwendeten Proteinproben nicht hoher Reinheit aufweisen.

Überprüfen Sie die Reinheit des SBDS-FlAsH-Proteins durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung. Schockgefrieren Sie das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis es weiterverwendet wird. Um das gereinigte EFL1-Protein herzustellen, kultivieren Sie zunächst transformierte Hefe bei 30 Grad Celsius in einem Liter synthetischem Drop-out-Medium ohne Uracil, ergänzt mit 0,5 Prozent Glukose, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1,8 erreicht.

Induzieren Sie die Proteinsynthese, indem Sie 2,8 Prozent Galaktose zur Kultur hinzufügen, und setzen Sie die Inkubation 18 Stunden bei 30 Grad Celsius fort. Sammeln Sie die Hefesuspension durch Zentrifugation bei 3800 × g für zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überstand nach der Zentrifugation.

Suspendieren Sie die Zellen in 50 Milliliter EFL1-Lysepuffer, der mit einem Millimolar PMSF und einem Millimolar Benzamidin ergänzt wurde. Lyse die Zellen durch Reibung in einem Kügelchenzerstörer unter Verwendung von Glasperlen für eine Gesamtdauer von sechs Minuten mit Zyklen von zwei Minuten aktiv und fünfzehn Minuten Pause bei vier Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 9.000 × g für 50 Minuten bei vier Grad Celsius.

Behalten Sie das Überstand und verwerfen Sie den Pellet, um zellulären Trümmer zu entfernen. Danach puffergleichgewichten Sie die Nickelaffinitäts-Säule mit drei Säulenvolumina EFL1-Lysepuffer. Geben Sie den gesamten geklärten Überstand auf die gleichgewichtete Säule.

Nachdem ungebundenes Protein durch Waschen der Säule mit drei Säulenvolumina EFL1-Lysepuffer entfernt wurde, wird das gebundene Protein mit drei Säulenvolumina EFL1-Elutionspuffer eluiert. Um das EFL1-Protein weiter zu reinigen, wird die Größenauschluss-Säule mit 1,5 Säulenvolumina Anisotropiepuffer equilibriert. Das aus der Nickelaffinitäts-Säule eluierte EFL1-Protein wird mit Ultrafiltrationsgeräten durch Zentrifugation bei 3800 × g auf ein Milliliter konzentriert. Anschließend wird die konzentrierte Probe auf die Größenauschluss-Säule aufgegeben.

Sammlen Sie das eluierte Protein und konzentrieren Sie es durch Ultrafiltration auf eine Endkonzentration von etwa 30 µM. Überprüfen Sie die Reinheit des EFL1-Proteins durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung. Schockgefrieren Sie das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.

Mischen Sie drei Nanomol des SBDS-FlAsH-Proteins mit drei Nanomol des Lumio-Green-Farbstoffs in einem Volumen von fünf Mikrometer Anisotropiepuffer. Lassen Sie die Reaktion acht Stunden bei vier Grad Celsius ablaufen. Dialysieren Sie die Probe danach über Nacht gegen den Anisotropiepuffer, um den freien Farbstoff zu entfernen.

Messen Sie die Absorption bei 280 Nanometern und 508 Nanometern in einem Spektrophotometer unter Verwendung einer Quarzküvette. Anschließend verwenden Sie das Lambert-Beersche Gesetz, um den Prozentsatz des markierten Proteins wie im Textprotokoll beschrieben zu quantifizieren. Vor der Messung des Anisotropiewerts sollte jeder Filtrationsschritt aus der Proteinfraktion sorgfältig durchgeführt werden, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Probe in die Lösung überführt und homogen verteilt wird.

In einer Fluoreszenzkuvette 200 Mikroliter 30 Nanomolar SBDS-FlAsH in Anisotropiepuffer geben und 2 Mikroliter 30 Mikromolar EFL1 portionweise hinzufügen. Gründlich mischen und die Reaktion vor der Messung von Anisotropie und Fluoreszenzwert drei Minuten lang stehen lassen. Diesen Vorgang wiederholen, bis insgesamt 40 Mikroliter EFL1 zugegeben wurden.

Als letzten Schritt sollten die Daten an ein vorausgesetztes Bindungsmodell angepasst werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Um ein Anisotropie-Experiment durchführen zu können, ist es wichtig, große Änderungen der Fluoreszenzintensität auszuschließen. Wie hier gezeigt, ändert sich die Fluoreszenz von SBDS-FlAsH nach Bindung an EFL1 nicht merklich.

Die Titration von EFL1 in eine Quarzküvette, die SBDS-FlAsH enthält, führt zu einer Zunahme der anfänglich beobachteten Anisotropie. Mehrere Zugaben von EFL1 ergeben die entsprechende Bindungskurve, die mithilfe einer nichtlinearen Kleinste-Quadrate-Regression an ein vermutetes Bindungsmodell angepasst werden kann. In diesem Fall beschreibt ein Modell mit einer Bindungsstelle die experimentellen Daten nicht angemessen.

Stattdessen beschreibt ein Modell mit zwei nicht-identischen Bindungsstellen die experimentellen Daten angemessen. Wenn man den Fluoreszenzanisotropie-Bindungsversuch einmal beherrscht, kann er bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die gereinigte Proteine in großen Mengen zur Verfügung zu haben.

Neben diesem Verfahren können andere Methoden wie ein Fragment-basiertes Komplementationsassay oder die Fluoreszenzanisotropie mit verschiedenen Domänen des untersuchten Proteins durchgeführt werden, um das geeignete Bindungsmodell zu unterstützen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bindungsexperiment durchführt, dem eine Fluoreszenzanisotropie folgt.