Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-Wechselwirkungen sind im Herzen von einer Funktion der Zelle. Kalorimetrische und spektroskopischen Techniken werden allgemein zu charakterisieren sie verwendet. Hier beschreiben wir Fluoreszenzanisotropie als Werkzeug, um die Wechselwirkung zwischen dem Protein in dem Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS) und dem Elongationsfaktor-like 1 GTPase (EFL1) mutiert zu studieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Interaktion zwischen zwei interessierenden Proteinen mit Hilfe der Fluoreszenzanisotropie zu bewerten und zu quantifizieren. Diese Maßnahmen können helfen, zentrale Fragen zu beantworten. Das Gebiet der Proteinbiochemie und Proteinbiophysik, wie z. B. Proteine, deren Wechselwirkungen für die zelluläre Funktion wichtig sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir quantitative und qualitative Informationen über die Protein-Protein-Interaktion erhalten können. Um gereinigtes SBDS-FlAsH-Protein herzustellen, bereiten Sie zunächst einen Liter LB-Flüssigmedium vor, das mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin ergänzt wird. Und darin wurden Bakterien in Kultur bei 37 Grad Celsius transformiert, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 bis 0,7 erreicht.

Induzieren Sie die SBDS-FlAsH-Proteinexpression, indem Sie 0,5 millimolare IPTG in die Kultur geben und die Inkubation für weitere fünf Stunden fortsetzen. Als nächstes sammeln Sie die Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 3800 mal G für zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie die Zellen in 35 Millilitern SBDS-Lysebutter, die mit einem millimolaren PMSF ergänzt wird. Lysieren Sie durch Beschallung für eine Gesamtzeit von vier Minuten mit Zyklen von zehn Sekunden an und 30 Sekunden aus bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe dann 50 Minuten lang bei 9.000 mal G bei vier Grad Celsius.

Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie die Palette, um Zelltrümmer zu entfernen. Nach dem Äquilibrieren der Nickelaffinitätssäule mit drei Säulenvolumina SBDS-Lysepuffer wird der gesamte geklärte Überstand auf die Säule aufgebracht. Entfernen Sie das ungebundene Protein durch Waschen mit drei Säulenvolumina SBDS-Lysepuffer

Nach der Säulenwäsche eluieren Sie das gebundene Protein mit drei Säulenvolumina SBDS-Elutionspuffer. Um das Protein weiter zu reinigen, äquilibrieren Sie die Sulfopropyl-Kationenaustauscher-Säule mit drei Säulenvolumina salzarmem S-Säulenpuffer. Verdünnen Sie das Protein sechsfach mit 50 millimolaren Phosphatpuffer PH 6,5 und geben Sie es in die Säule.

Waschen Sie das ungebundene Material mit drei Säulenvolumina salzarmem S-Säulenpuffer. Dann eluieren Sie das Protein in einem Schritt, indem Sie 50 millimolare Phosphatpuffer PH 6,5, ein molares Natriumchlorid, auf die Säule geben. Verdünnen Sie das Eluat dreifach mit 50 millimolaren Phosphatpuffer PH 6,5.

Konzentrieren Sie dann das Protein mit Ultrafiltrationsgeräten durch Zentrifugation bei 3800 mal G für fünfzehn Minuten. Die Qualität der Proteine, die in dieser Art von Experimenten verwendet werden, ist sehr stark. Die Interpretation der Daten wird kompliziert, wenn die verwendeten Proteinproben nicht von hoher Reinheit sind.

Überprüfen Sie die Reinheit des SBDS-FlAsH-Proteins durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung. Schockfrosten Sie das Protein in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Zur Herstellung des gereinigten EFL1-Proteins wurde zunächst Hefe bei 30 Grad Celsius in einen Liter synthetisches Drop-out-Medium ohne Uracil umgewandelt, ergänzt mit 0,5 Prozent Glukose, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1,8 erreicht.

Induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie der Kultur 2,8 Prozent Galaktose zusetzen und die Inkubation 18 Stunden lang bei 30 Grad Celsius fortsetzen. Sammeln Sie die Hefesuspension durch Zentrifugieren bei 3800 mal G für zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Millilitern EFL1-Lysepuffer, ergänzt mit einem millimolaren PMSF und einem millimolaren Benzamidin. Brechen Sie die Zellen durch Reibung an einem Rührgerät mit Glasperlen für eine Gesamtzeit von sechs Minuten auf, mit Zyklen von zwei Minuten an und fünfzehn Minuten aus bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe dann 50 Minuten lang bei 9.000 mal G bei vier Grad Celsius.

Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie den Gaumen, um Zelltrümmer zu entfernen. Als nächstes äquilibrieren Sie die Nickel-Affinitätssäule mit drei Säulenvolumina EFL1-Lysepuffer. Der gesamte geklärte Überstand wird auf die äquilibrierte Säule aufgebracht.

Nach dem Entfernen des ungebundenen Proteins durch Waschen der Säule mit drei Säulenvolumina EFL1-Lysepuffer eluiert das gebundene Protein mit drei Säulenvolumina EFL1-Elutionspuffer. Um das EFL1-Protein weiter zu reinigen, äquilibrieren Sie die Größenausschlusssäule mit 1,5 Säulenvolumina Anisotropiepuffer. Das aus der Nickel-Affinitätssäule ausgetretene EFL1-Protein wird mit Ultrafiltrationsgeräten durch Zentrifugation bei 3800-fachem G auf einen Milliliter konzentriert.

Sammeln Sie das entweichte Protein und konzentrieren Sie es durch Ultrafiltration auf eine Endkonzentration von etwa 30 Mikromolaren. Überprüfen Sie die Reinheit des EFL1-Proteins durch SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Färbung. Das Protein in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Mischen Sie drei Nanomol des SBDS-FlAsH-Proteins mit drei Nanomol des lumiogrünen Farbstoffs in einem fünf Mikrometer großen Anisotropiepuffer. Lassen Sie die Reaktion acht Stunden lang bei vier Grad Celsius ablaufen. Nach acht Stunden dialysieren Sie die Probe über Nacht gegen den Anisotropiepuffer, um den freien Farbstoff zu entfernen.

Messen Sie die Absorptionsmittel bei 280 Nanometern und 508 Nanometern in einem Spektralphotometer mit einer Quarzküvette. Verwenden Sie dann das Lambert-Beer-Gesetz, um den Prozentsatz des markierten Proteins zu quantifizieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Vor der Messung des Anisotrophiewertes sollte jeder Filtrationsschritt aus der Proteinlegion sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe in die Lösung abgegeben wird und homogen wird.

In eine Fluoreszenzküvette werden 200 Mikroliter 30 nanomolare SBDS-FlAsH in Anisotrophiepuffer gegeben und zwei Mikroliter 30 mikromolare EFL1 titriert. Mischen Sie gründlich und lassen Sie die Reaktion drei Minuten lang stehen, bevor Sie den Anisotrophie- und Fluoreszenzwert messen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern EFL1 hinzugefügt wurde.

Passen Sie die Daten als letzten Schritt an ein vermutetes Bindungsmodell an, wie im Textprotokoll beschrieben. Um ein Anisotrophie-Experiment durchzuführen, ist es wichtig, große Änderungen der Fluoreszenzintensität auszuschließen. Wie hier gezeigt, ändert sich die Fluoreszenz von SBDS-FlAsH bei der Bindung an EFL1 nicht merklich.

Die Titration von EFL1 in eine Quarzküvette, die SBDS-FlAsH enthält, führt zu einer Erhöhung der anfänglich beobachteten Anisotrophie. Mehrere Ergänzungen von EFL1 beschreiben die entsprechende Bindungskurve, die mit Hilfe der nichtlinearen Regression der kleinsten Quadrate an ein vermutetes Bindungsmodell angepasst werden kann. In diesem Fall beschreibt ein Modell mit einer Bindungsstelle die experimentellen Daten nicht angemessen.

Stattdessen beschreibt ein Modell mit zwei nicht identischen Bindungsstellen die experimentellen Daten angemessen. Sobald es gemeistert ist, kann das Fluoreszenzanisotrophie-Bindungsexperiment in drei Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, gereinigtes Protein in großen Mengen zu haben.

Parallel zu diesem Verfahren können andere Methoden wie diese mit fragmentbasiertem Komplementationsassay oder Fluoreszenzanisotrophie mit verschiedenen Domänen des untersuchten Proteins durchgeführt werden, um das geeignete Bindungsmodell zu unterstützen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bindungsexperiment mit anschließender Fluoreszenzanisotrophie durchführt.