Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus
November 4th, 2016
Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-anfälligen Mäusen zu isolieren, um ihre Funktion zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, die sich auf die Eigenschaften einer bestimmten Immunzellpopulation beziehen, wie z. B. die Produktion von PDC durch Interferon alpha im späten Stadium der Lupusentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine bis mehrere Zielpopulationen auf eine höhere Reinheit angereichert werden können als durch magnetische Bead-Sortierung.
Nach der Ernte werden die Knochen der Hintergliedmaßen und vier Milliliter des vollständigen Mediums in einen Mörser gegeben. Fügen Sie sechs Milliliter frisches Vollmedium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu bringen. Und knacken Sie die Knochen vorsichtig mit einem Stößel.
Rühren Sie den Stößel vorsichtig um, um das Knochenmark freizusetzen. Übertragen Sie dann das gesamte Medium durch ein 70-Mikron-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Geben Sie 10 Milliliter frisches Vollmedium in den Mörser.
Und filtrieren Sie den Überstand noch zwei Mal, bis die Knochen weiß erscheinen. Zentrifugieren Sie dann die Knochenmarkzellen und suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem Vollmedium. Als nächstes schichten Sie die Zellen auf fünf Milliliter frisch zubereitetes Dichtegradientenmedium in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, dass die Schichten nicht gestört werden.
Und trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie dann vorsichtig die oberen acht Milliliter der Lösung und sammeln Sie die zwei Milliliter Buffy Coat in der Zwischenphase. Geben Sie 12 Milliliter eiskaltes vollständiges Medium in die isolierten mononukleären Zellen und verschließen Sie das Röhrchen, um es durch Inversion zu mischen.
Dann pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Um die Zellen für FACS zu färben, suspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern CD1632FC blockierenden Antikörpers bei vier Grad Celsius. Nach 10 Minuten waschen Sie die Zellen in vier Millilitern eiskaltem Sortierpuffer und markieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern des entsprechenden Antikörper-Cocktails zur Zelloberflächenfärbung.
15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen in vier Millilitern eiskaltem Sortierpuffer, um ungebundene fluoreszenzkonjugierte Antikörper zu entfernen. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 500 Mikrolitern FACS-Ladelösung und überführen Sie die Probe in ein FACS-Röhrchen auf Eis.
Um die Kompensationskontrollen zu färben, aliquotieren Sie eins mal 10 bis sechs Splenozyten pro Röhrchen. Waschen Sie die Zellen mit vier Millilitern Sortierpuffer und suspendieren Sie die Pellets wieder in 100 Mikrolitern Sortierpuffer. Geben Sie dann den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Antikörper aus dem Antikörpercocktail der Hauptzelloberfläche in jedes entsprechende Kompensationsröhrchen und schütteln Sie die Röhrchen, um sie zu mischen.
Waschen Sie nach 15 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius alle Proben mit Sortierpuffer und suspendieren Sie die Pellets wieder in 500 Mikrolitern eiskaltem Sortierpuffer. Mit Ausnahme der DAPI-Röhre, die in 500 Mikrolitern FACS-Ladelösung resuspendiert wird. Um die Zielzellpopulation durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu reinigen, werden Sammelröhrchen mit 500 Mikrolitern FBS, die mit Antibiotika ergänzt werden, unterhalb der Sortierventile beladen.
Laden Sie als Nächstes die ungefärbte Röhre und sammeln Sie 10.000 Ereignisse, um das negative Gate für jede Fluoreszenzintensität einzustellen. Und 10.000 Ereignisse in den einzelnen Fleckenkompensationsröhren, um das positive Gate für jede Fluoreszenzintensität einzustellen. Sammeln Sie 3.000 Ereignisse aus der experimentellen Stichprobe, um die Gates der sortierten Zellpopulation festzulegen.
Verwendung der Fluoreszenzintensitäten als Parameter des X- und Y-Zugangsgraphen, um die Zielzellpopulation manuell zu gaten. Sortieren Sie dann die Zielzellpopulation in das Sammelröhrchen. Am Ende der Sortierung geben Sie bis zu vier Milliliter ice cole complete medium in die Zellen.
Verschließen Sie dann das Röhrchen und mischen Sie die Zellen durch Inversion. Die gereinigten Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, wobei alle bis auf die letzten 200 Mikroliter des Überstands abgesaugt werden. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in einem Milliliter eiskaltem Vollmedium und überführen Sie die Zellen für eine zweite Zentrifugation in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Zum Schluss aspirieren Sie alle bis auf die letzten 100 Mikroliter des Überstands und lagern die sortierte Zellpopulation bis zur Verwendung auf Eis. Die magnetisch aktivierte Zellsortierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen des Knochenmarks von Lupus-anfälligen Mäusen führt nach der Anreicherung zu einer Reinheit von nur 7,75%. FACS-angereicherte plasmazytoide dendritische Zellen weisen jedoch nach der Sortierung eine Reinheit von bis zu 96,4 % auf.
Um eine hohe Reinheit zu gewährleisten, werden die mononukleären Knochenmarkzellen zunächst durch Vorwärts- und Seitenstreuparameter angesteuert und von den Trümmern getrennt. Unter Verwendung der Vorwärtsstreubreite im Vergleich zur Vorwärtsstreuungshöhe und der Seitenstreubreite im Vergleich zur Seitenstreuungshöhe werden die einzelnen Zellen weiter gesteuert, um die von Aggregaten erzeugten falsch positiven Signale zu vermeiden. Die lebenden einzelnen DAPI-negativen Zellen werden dann durch ihre CD11c-positive, CD11B-negative Zelloberflächenexpression gegated, was ein weiteres Gating der B220-positiven, PDCA-1-positiven Ziel-Knochenmark-Plasmazytoiden dendritischen Zellpopulation ermöglicht.
Die sortierte PDC-Population ist nicht nur von hoher Reinheit, sondern auch funktionell normal und in der Lage, IFNalpha nach CPG-Stimulation in vitro zu produzieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Knochen zu knacken und das freigesetzte Knochenmark vorsichtig zu rühren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie RNA-Sequenzierung oder In-vitro-Kultur und -Stimulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Genexpression oder Funktion angereicherter Zellpopulationen zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für PDC-Forscher, die Rolle dieser leistungsstarken Zelle bei der Entwicklung von Lupus und Lupus-anfälligen Mausmodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine hochreine PDC-Population aus dem Knochenmark von Lupus-anfälligen Mäusen isoliert
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Isolierung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDC) aus dem Knochenmark von Lupus-anfälligen Mäusen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung. Die Methode zielt darauf ab, eine hohe Reinheit für anschließende funktionelle Studien von pDC zu erreichen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Autoimmunität
Hintergrund
- Plasmazytoide dendritische Zellen sind entscheidend für Immunreaktionen.
- Sie produzieren Interferon alpha, insbesondere während der Lupus-Progression.
- Eine hochreine Isolierung ist für eine genaue funktionelle Analyse unerlässlich.
- Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden.
Zweck der Studie
- pDC aus Lupus-anfälligen Mäusen zu isolieren.
- Die funktionellen Eigenschaften von pDC zu untersuchen.
- Das Verständnis des Verhaltens von Immunzellen bei Lupus zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Ernte des Knochenmarks von Lupus-anfälligen Mäusen.
- Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung für die Isolierung.
- Vorbereitung des kompletten Mediums für die Zellverarbeitung.
- Zerbrechen von Knochen zur Freisetzung von Zellen für die Sortierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von pDC mit hoher Reinheit.
- Verbessertes Verständnis der pDC-Funktion bei Lupus.
- Demonstrierte Vorteile der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung.
- Ein zuverlässiges Protokoll für zukünftige Studien bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll isoliert effektiv pDC für funktionelle Studien.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Lupus-Pathologie bei.
- Zukünftige Forschung kann auf dieser Methodik aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
