Name: Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark lupus-anfälliger Mäuse. Diese Methode ermöglicht hochreine Isolation für funktionelle Immunzellstudien.

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Wir danken dem Durchflusszytometrie-Labor am Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine für die Nutzung der Durchflusszytometrie-Kerneinrichtung. Diese Arbeit wurde durch die Startkapital von XML unterstützt. XL ist Stamps Fellow im Graduiertenprogramm Biomedical and Veterinary Sciences.

HINWEIS: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) Lupus anfällige Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen freien Anlage entsprechend den Anforderungen des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech (Animal Welfare Assurance Anzahl gezüchtet und gepflegt: A3208-01). Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierversuche wurden unter IACUC Protokoll # 12-062 durchgeführt. 1. Zellkulturmedium und Sortierpuffer <ol><li> Bereiten komplette Zellkulturmedium (C10) unter Verwendung von RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100 MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Bereiten Sortierpuffer (HBSS-full) unter Verwendung von 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin,0,05 mM MgCl 2 und 0,2 U / ml DNase I. </li></ol> 2. Maus Dissection <ol><li> Bereiten Sie zwei 6-cm Durchmesser Schalen mit 4 ml C10. Die Schalen werden auf Eis. </li><li> Euthanize die Maus durch CO 2 Inhalation. </li><li> Ernten Sie die Milz und halten Sie sie in eine Schüssel mit C10 auf dem Eis. <ol><li> Pin der Maus mit dem Bauch nach unten nach oben auf der Dissektion Platte. Sterilisieren Sie den Körper 70% Ethanol durch Sprühen. </li><li> Schneiden Sie die Haut und trennen Sie die Haut von der Muskelwand unterhalb entlang der ventralen Mittellinie von der Symphyse bis zum Hals. </li><li> Schneiden Sie die Haut an der hinteren Gliedmaßen vom ersten Schnitt bis zum Knöchel. </li><li> Pin der Haut zurück an den Seiten und schneiden Sie die Muskelwand entlang der Seiten von der ersten Einschnitt statt abblendet. </li><li> Pin der Muskelwand auf der rechten Seite des Kopfes zurück. </li><li> Lokalisieren der Milz auf der rechten Seite der Maus unter dem Dünndarm und neben dem Magen. Pick-up ein Ende the Milz und es aus dem Magen zu trennen. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die beiden hinteren Extremitäten, einschließlich Femur und Tibia, und entfernen Sie alle Muskeln so viel wie möglich. <ol><li> Schneiden Sie die Muskeln entlang der hinteren Gliedmaßen aus dem Becken / Hüftgelenk bis zum Knöchel mit einer scharfen Schere, versuchen, die Blutgefäße zu vermeiden. </li><li> Trennen Sie die hinteren Gliedmaßen, indem du den Becken / Hüftgelenk Schneiden und Knöchel / Fußgelenk ohne die Exposition von Knochenmark Inhalte. </li><li> Saubere verbleibenden Muskeln an den Knochen durch wiederholt mit einer Rasierklinge Kratzen und die Muskeln an den Verbindungspunkten schneiden. </li></ol></li><li> Halten Sie die Knochen in einer 6 cm Schale mit 4 ml C10 auf dem Eis. Fahren Sie die nächste Maus zu sezieren. </li></ol> 3. Splenozyten- Isolation <ol><li> Homogenisieren der Milz vorsichtig mit einem Spritzenkolben gegen eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb auf der Oberseite der Schale mit 4 ml C10 bis keine roten Stück sichtbar sind. </li><li> Fügen Sie weitere 6 ml C10 in die Schale durch das Sieb einnd dann übertragen die insgesamt 10 ml Zellsuspension auf eine 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und Zellpellet in 2 ml 1 x roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. 5 min bei RT inkubiert. </li><li> zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 800 xg Nach der Inkubation für 5 min, 4 ° C. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 1 ml C10 resuspendieren. Entsorgen Sie alle großen Klumpen (tote Zellen) und halten Sie die Röhrchen auf Eis für später. HINWEIS: Wenn es viele kleine Klumpen sind, verwenden Sie eine 70-um-Zelle Sieb einmal die Zellsuspension zu filtern. </li><li> Zählen Sie die Zellzahl mit Trypanblau unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler. </li></ol> 4. Knochenmarkzellisolierung <ol><li> Übertragen Sie die Knochen mit 4 ml C10 in einen Mörser und 6 ml C10 auf ein Volumen von 10 ml C10 insgesamt machen. </li><li> Knacken Sie die Knochen sanft in den Mörtel von ap mitestle. </li><li> Rühren Sie vorsichtig mit dem Stößel des Knochenmarks in C10 zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die 10 ml C10 enthält Knochenmark in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis durch einen 70-um-Zelle Sieb. 10 ml frisch C10 in den Mörtel noch die Knochen enthält. HINWEIS: Pipettieren Sie die Lösung, die auf Knochenmark und nach unten mehrmals, bevor sie durch das Sieb vorbei, wenn roten Klumpen sichtbar sind. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 zweimal. Nach der letzten Waschung sollten die Knochen weiß erscheinen. </li><li> Zentrifugation der 50 ml konischen Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. Inzwischen bereiten 5 ml ready-to-use-Dichtegradienten-Medium in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen bei RT. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 10 ml C10 resuspendieren. </li><li> die 10 ml Zellsuspension auf dem 5 ml Dichtegradientenmedium, die Aufrechterhaltung klare Schnittstelle zwischen den beiden Phasen langsam die Schicht. zentrifugieren dann den 15 ml konischen Röhrchen bei 1.363 g für 30 min beiRT (20 ° C) mit einer Beschleunigung Satz als 9 und Verzögerung eingestellt als 0 (oder Bremse AUS). </li><li> die Top 8 ml Lösung sorgfältig und sammeln Sie die 2 ml Leukozytenmanschette an der Schnittstelle (eine Schicht aus einkernigen Zellen) in eine neue 15 ml konischen Röhrchen Nach der Zentrifugation zu entfernen. </li><li> In 12 ml eiskaltem C10 zu den 15 ml konischen Röhrchen mit einkernigen Zellen des Knochenmarks, Kappe und mehrmals umdrehen gut zu mischen, dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 800 g für 10 min, 4 ° C. </li></ol> 5. Zeiloberflächenfärbung für FACS <ol><li> Probenfärbung <ol><li> Bereiten anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung (1 bis 100 Verdünnung in HBSS-voll, 5 ug / ml Endkonzentration). </li><li> Nach der Zentrifugation in Schritt 4.10, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 100 ul anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung resuspendieren Fc-Rezeptor auf den mononukleären Zellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Bereiten Fluoreszenz-konjugiertes Antikörpermischung (anti-Maus CD11c-PE Verdünnung von 1:40, Anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 und anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40 in HBSS- voll, wie bei 100 &amp; mgr; l Endvolumen pro Probe vom Hersteller empfohlen). HINWEIS: Es ist wichtig, Antikörper vor dem Gebrauch zu titrieren. </li><li> Nach 10 min Inkubation in Schritt 5.1.2, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundenen Anti-Maus-CD16 / 32 zu entfernen. </li><li> Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 100 ul fluoreszenz konjugierten Antikörpermischung. Inkubieren auf Eis für 15 min im Dunkeln. </li><li> Nach 15 min Inkubation, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundene Fluoreszenz-konjugierte Antikörper zu entfernen. </li><li> Bereiten Sie FACS Ladelösung (500 ng / ml DAPI in HBSS-voll). </li><li> Nach der Zentrifugation in Schritt 5.1.6, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μ resuspendieren; L FACS Beladungslösung. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 12 x 75 mm Rundbodenrohr (FACS-Röhrchen) und halten Sie das Rohr auf Eis im Dunkeln innerhalb von 1 Stunde bis zu sortieren. </li></ol></li><li> Das Anfärben zur Kompensation <ol><li> Label-6 FACS-Röhrchen wie PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI oder ungefärbt. Aliquotieren Splenozyten bei 1 x 10 6 Zellen / Röhrchen in die FACS - Röhrchen und waschen mit 4 ml HBSS-Voll bei 800 g für 5 min, 4 ° C. HINWEIS: Die Verwendung DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, DAPI, lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. DAPI kann die Plasmamembran von toten Zellen durchlaufen (aber nicht von lebenden Zellen) und binden Chromosom DNA. </li><li> Den Überstand aspirieren und Zellpellet in 100 ul HBSS-voll. </li><li> In jedes Röhrchen FACS entspricht, fügen Sie eine der folgenden Antikörper: anti-Maus-CD19-PE Verdünnung von 1:40, anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus-PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 oder Anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40, wie durch die manufa empfohlencturer. Lassen Sie das 5. (DAPI) und 6. (ungefärbten) FACS - Röhrchen , wie sie sind. Gut mischen durch Schütteln und Inkubation alle FACS-Röhrchen auf Eis im Dunkeln für 15 min. </li><li> Nach der Inkubation 4 ml eiskaltem HBSS voll in jedes Rohr und Zentrifuge die FACS-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. </li><li> Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 500 ul eiskaltem HBSS-full Ausnahme des Pellets in dem Rohr DAPI markiert, die in 500 &amp; mgr; l FACS Beladungslösung resuspendiert. Halten Sie alle 6 Röhrchen auf Eis im Dunkeln bis zu sortieren. </li></ol></li></ol> 6. Sortierung auf dem Cell Sorter HINWEIS: Der Betrieb auf dem Zytometer Verfahren Sortieren und Software wird mit einer ausführlichen Belehrung durch die Firma standardisiert. Kurz gesagt, verwenden wir bei 20 psi 100 Mikron Düse, Konzentration eingestellt Zielzelle zwischen 5-10000000 pro ml, und die Effizienz auf 70% einstellen oder höher (dh gehalten Konflikte unter 30%). <ol><li> Bereiten Sammlung FACS-Röhrchen mit 500 &amp; mgr; l FBS / Röhrchen, die 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Stellen Sie Kompensationsparameter des Zellsortierer Einzelfleckenkompensations Rohre aus Schritt 5.2 verwendet wird. <ol><li> Nehmen 10.000 Zellen in ungefärbten Röhre für jede Fluoreszenzintensität negative Gate einzustellen. </li><li> Nehmen 10.000 Zellen in anderen Single-Fleckenkompensations Röhrchen für jede Fluoreszenzintensität positive Gate einzustellen. HINWEIS: Die Software berechnet automatisch die Kompensationsparameter. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Probe aus Schritt 5.1 die Tore der sortierten Zellpopulationen zu setzen, indem 3.000 Zellen aufnehmen. Verwendung von Fluoreszenzintensität als Parameter X und Y-Achsen-Diagramm, Gate- Zielzellpopulation manuell als Gruppe von Punkten offenbar von anderen Punkten getrennt werden. HINWEIS: Diese Gating-Set ist flexibel und willkürlich basierend auf den Anforderungen der Forscher. Wenn Forscher eine höhere Reinheit erwarten basierend auf einem oder mehreren Markern, bewegen Sie das Torbasierend höher auf der entsprechenden Fluoreszenzintensität. </li><li> Laden Sie ein Sammelrohr und starten Sie die Zielzellpopulation zu sortieren. </li><li> Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis nach dem Sortieren, bis alle Probenröhrchen fertig sind. </li><li> In eiskalter C10 zum Sammelrohr bis zu 4 ml, Kappe und umkehren zu mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C, und dann den Überstand aspirieren, so dass etwa 200 &amp; mgr; l mit Zellpellet unberührt. </li><li> 1 ml eiskaltem C10, um das Zellpellet zu resuspendieren und übertragen alle Zellsuspension in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C und den Überstand aspirieren, so dass 100 &amp; mgr; l mit dem Zellpellet unberührt. </li><li> Speichern Sie die sortierten Zellpopulationen auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieser Arbeit besteht.

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll dient der hochreinen Anreicherung von lebendem pDC, das die Fähigkeit zur Herstellung von IFNα beibehält. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Reinigung von pDC und/oder anderen mononukleären Zellen aus dem Knochenmark von MRL/lpr und anderen Mausstämmen zur Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen. Mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll bestehen darin, eine hohe Lebensfähigkeit und Reinheit des sortierten pDC sich...

Die effiziente Trennung einer Zellpopulation der Wahl von anderen Zellen ermöglicht Studien der Population, die sonst möglicherweise nicht möglich wären. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine Methode, um eine interessante Zellpopulation mit hoher Reinheit anzureichern. 1,2 Verschiedene Zelltypen exprimieren in der Regel einzigartige Moleküle oder eine einzigartige Kombination mehrerer Moleküle auf der Plasmamembran, die eine Zellpopulation von einer anderen unterscheiden können. Nach der Bindung dieser Zelloberflächenmoleküle durch spezifische fluoreszenzkonjugierte Antikörper ist eine Detektionsmaschine namens Durchflusszytometer/-sorter in der Lage, die Lichtsignale verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, die unterschiedliche Molekülmarker auf den Zellen auf Einzelzellebene darstellen, anzuregen und zu detektieren. Die kombinierte Information, die entweder aus dem Vorhandensein eines Lichtsignals (für die positive Expression des entsprechenden Oberflächenmoleküls) oder der Abwesenheit eines Lichtsignals (für die negative Expression eines Moleküls) besteht, definiert den Phänotyp der Zelle. Nach dem Passieren des Detektors werden Zellen mit dem gleichen Phänotyp aufgrund der elektrischen Ladung zu einem bestimmten Sammelrohr umgeleitet.
FACS wird in verschiedenen Studien breit angewendet, solange die zu bereichernde Population mit Fluoreszenz markiert wird. 3-7 Es wurde verwendet, um Immunglobulin (Ig)A-beschichtete Bakterien von nicht-IgA-beschichteten Bakterien in der Darmmikrobiota zu trennen 8 und gentechnisch veränderte Zellpopulationen zu sortieren, die fluoreszierende Proteine exprimieren. 9 Wichtig ist, dass es in der Lage ist, mehr als eine Population gleichzeitig zu trennen, was nicht nur Zeit und Reagenzien spart, sondern auch anspruchsvollere Studiendesigns ermöglicht. 10 FACS hat jedoch auch seine Grenzen. Wenn eine Population von Interesse sehr selten ist (weniger als 1 %), kann die Sortiereffizienz verringert werden, was zu einem erheblichen Zellverlust führt. Darüber hinaus kann eine gewisse Antikörperbindung die intrazelluläre Signaltransduktion aktivieren, die funktionelle Veränderungen der sortierten Zellpopulation induziert. 11 Daher sollte der Phänotyp, der für die Sortierung verwendet wird, sorgfältig ausgewählt werden. 
Neben FACS existieren noch andere Methoden, die ebenfalls auf Zelloberflächenmarkern für die Anreicherung spezifischer Zellpopulationen basieren, wie z.B. magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MCS). 12 Ähnlich wie FACS können magnetische Beads-konjugierte Antikörper auf spezifische Zelloberflächenmoleküle abzielen. Bei der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung können mit magnetischen Kügelchen beschichtete Zellen nach dem Passieren eines Magnetfeldes von unbeschichteten Zellen getrennt werden. Allerdings kann bei MCS nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen anvisiert werden, da magnetische Kügelchen im Gegensatz zu verschiedenen fluoreszierenden Farben in FACS nicht unterscheidbar sind. Für MCS ist es daher schwierig, einen Zellphänotyp mit einer komplizierten Kombination von Oberflächenmarkern zu definieren. 13,14 Darüber hinaus ist MCS auch in der Lage, eine unbeabsichtigte Aktivierung von Zielzellen zu verursachen.
In unseren Studien an einem Mausmodell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) 15 beabsichtigten wir, plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) zu reinigen, um ihre funktionellen Veränderungen mit fortschreitender Krankheit zu untersuchen. Wir verwendeten MCS zunächst, um pDC aus dem Knochenmark anzureichern, indem wir auf PDCA-1 abzielten, ein Molekül, das auf murinem pDC im Steady State stark und einzigartig exprimiert wird. 16 Die Zellreinheit war jedoch unerwartet niedrig, was wahrscheinlich auf die Hochregulierung von PDCA-1 auf anderen Zellpopulationen in einem entzündlichen Milieu wie SLE zurückzuführen ist. 16 Letztendlich haben wir FACS mit einer Kombination aus vier Oberflächenmarkern (CD11c, CD11b, B220 und PDCA-1) verwendet, um hochreine pDC als CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+-Population zu trennen. Murine pDC hat einen weiteren spezifischen Oberflächenmarker, Siglec-H. Wir haben uns entschieden, Siglec-H nicht zu verwenden, da die Antikörperbindung dieses Moleküls die Funktion von pDC zur Produktion von IFNα unterdrückt. 11

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco von life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>gibco von life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>gibco von life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco von life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>gibco von life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>gibco von life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank' s Ausgewogene Salzlösung&nbsp;</td><td>gibco by life technologies</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stammlösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC)</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradient mittel</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD19-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b-APC-CY7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus PDCA-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-3172-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus B220-V500&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Plasmazytoid Dendritische Zellen Isolation Kit II, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria I Durchflusszytometer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>643178</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva Version 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-aktivierte zellsortierung zur reinigung von plasmazytoide dendritischer zellen aus dem knochenmark der maus

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine Technik zur Aufreinigung spezifischer Zellpopulationen basierend auf Phänotypen, die durch Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die Eigenschaften einer einzelnen Zellpopulation ohne den Einfluss anderer Zellen besser zu verstehen. Im Vergleich zu anderen Methoden der Zellanreicherung, wie z. B. der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MCS), ist FACS aufgrund der Fähigkeit der Phänotyperkennung durch Durchflusszytometrie flexibler und genauer für die Zelltrennung. Darüber hinaus ist FACS in der Regel in der Lage, mehrere Zellpopulationen gleichzeitig zu trennen, was die Effizienz und Vielfalt der Experimente verbessert. Obwohl FACS einige Einschränkungen aufweist, wird es in großem Umfang zur Reinigung von Zellen für funktionelle Studien sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt. Hier berichten wir über ein Protokoll, das fluoreszenzaktivierte Zellsortierung verwendet, um eine sehr seltene Population von Immunzellen, plasmazytoide dendritische Zellen (pDC), mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-anfälligen Mäusen für in vitro funktionelle Studien von pDC zu isolieren.

Wir wollten Knochenmark pDC- mit hoher Reinheit und ohne den Einfluss von anderen Zelltypen, von MRL / lpr Lupus anfällige Mäuse von jung und alt Alter zu bereichern die funktionelle Veränderungen der pDC- in Bezug auf ihre Fähigkeit zu untersuchen IFN alpha zu produzieren. Die erste Reinigungsstrategie verwendete MCS, die, wie Figur 1 zeigt, um nach der Anreicherung nur 7,75% Reinheit führte. Im Vergleich zu MCS, angereichert FACS pDC- mit Reinheit so hoch wie 96,4%. Um...

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, plasmazytoide dendritische Zellen, oder PDC, mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von lupus-anfälligen Mäusen zu isolieren, um ihre Funktion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Eigenschaften einer bestimmten Immunzellpopulation zu beantworten, beispielsweise der interferon-alpha-produzierenden PDC im fortgeschrittenen Stadium der Lupusentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine bis mehrere Zielpopulationen in höherer Reinheit angereichert werden können, als dies mittels magnetischer Säulensortierung möglich ist.Nach der Entnahme überführen Sie die Knochen der Hintergliedmaßen und vier Milliliter komplettes Medium in ein Mörsergefäß. Geben Sie sechs Milliliter frisches komplettes Medium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter aufzufüllen, und zerkleinern Sie die Knochen vorsichtig mit einem Pistill.Bewegen Sie den Pistill vorsichtig, um das Knochenmark freizusetzen. Anschließend geben Sie das gesamte Medium durch ein 70-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Konischglas auf Eis. Fügen Sie 10 Milliliter frisches komplettes Medium zum Mörser hinzu.Und filtrieren Sie

fluorescence-activated-cell-sorting-for-purification-plasmacytoid

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde...

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) aus gängigen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs). Bei der Co-Kultivierung von gereinigten CLPs mit γ-bestrahlten Feeder-Zellen in Gegenwart von Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (FL) differenzieren sich die CLPs in nicht-adhärente pDCs, deren Vorhandensein mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

In dieser Studie stellen wir ein in vitro Kultursystem vor, das effizient pDCs erzeugen kann, indem gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit AC-6-Feederzellen in Gegenwart von Flt3-Liganden co-kultiviert werden.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.

Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays

Erfahren Sie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark lupus-anfälliger Mäuse. Diese Methode ermöglicht hochreine Isolation für funktionelle Immunzellstudien.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

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