Name: Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die frühen Phasen der Phagozytose mit konfokaler Mikroskopie visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Pathogen-Interaktionen mit Wirtszellen.

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Wir danken Wendy Lachs und Nicki Watson von der Keck-Anlage am Whitehead Institute des MIT für die Bildgebung.

1. Herstellung von DC2.4 und RAW 264.7-Zelllinien HINWEIS: Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 und die dendritische Zelllinie DC2.4 sind sowohl murinen Ursprungs, und die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um die Zellen zu wachsen. <ol><li> Wachsen RAW 264.7 - Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Eagle-Medium) , ergänzt mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Wachsen DC2.4 Zellen unter ähnlichen Bedingungen mit der RAW 264.7-Zellen, mit der Ausnahme Gebrauch RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium, das mit L-Glutamin anstelle von DMEM. </li></ol> 2. Herstellung von Fluorescent Konjugierte Partikel: C. albicans, Zymosan, IgG-beschichtete Beads <ol><li> Wachsende Candida albicans <ol><li> Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C. HINWEIS: Vermeiden Sie die Candida - Kultur wachsen mehr als einer OD 600 von 12. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der C. albicans und Spin es bei 2.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten. </li><li> Aspirieren den Überstand und resuspendiere das Pellet mit 1 ml PBS. </li><li> Sammle das Pellet durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1.4. </li><li> Berechne die Multiplizität der Infektion (MOI) von C. albicans in Bezug auf die Anzahl von Phagozyten und fahren mit der Phagocytose - Assay , wie in Kapitel 3 beschrieben eine OD 600 von 1 bis 2,5 x 10 7 Candida albicans pro 1 ml entspricht. HINWEIS: Die Erzeugung von Candida-BFP in Bezug 13 beschrieben. </li></ol></li><li> Herstellung von Zymosan und IgG beschichteten Beads HINWEIS: Zymosan ist ein β-Glucan enthaltendePilz-Kohlenhydrat - Partikelpräparat , das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet. Zymosan ist bekannt Entzündungssignale in Makrophagen und dendritischen Zellen hervorzurufen, und es wurde 13 extensiv in Phagozytose Studien verwendet wurden, 14, 15. <ol><li> Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren. HINWEIS: In der Regel verwenden wir im Verhältnis 1:10 (für eine Zelle, mit 10 zymosan Partikel oder IgG-beschichtete Beads). </li><li> 1 ml eiskaltem PBS, und sammelt die Partikel durch bei 10.000 x g für 1 min zentrifugiert. </li><li> Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.3 HINWEIS: Gehen Sie 2.2.5 zu Schritt oder lagern Sie das Röhrchen bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Beschallen die Partikel für 10 Sekunden in Ultraschall-Ultraschallbad (120 V, 50-60 kHz), um eine zu vermeidenny Partikelaggregation. </li></ol></li></ol> 3. Phagozytose HINWEIS: Die Phagozytose ist ein komplexer Prozess, der mit der Bindung der Partikel auf der Zelloberfläche der Phagozyten durch Wechselwirkung von PRRs mit Liganden auf der Oberfläche des Partikels beginnt. Bindung wird durch die Montage von Aktin und seine zugehörigen Proteine ​​an der Stelle des Kontakts und die Bildung eines phagozytischen cup gefolgt. Die anschließende Aktin Demontage erfolgt auf phagosome und führt zur vollständigen engulfment des partikulären. Im Folgenden die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu beschreiben. <ol><li> Bindungsassay HINWEIS: Der Zweck dieses Experiments ist es, die erste Stufe der Phagozytose zu überwachen, die die Wechselwirkung zwischen den Liganden auf den Zielpartikeln und den Rezeptoren auf den Phagozyten beinhaltet. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Legen Sie die Kammer Schieber (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well einer Pipette oder Absauger verwenden. ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt sorgfältig wie jede Vertiefung von einem Kammerschalennautilus Abdeckglas System ist klein; es ist leicht, Zellen mit der Spitze einer Pipette oder einer starken Luftstrom von einem Absauggerät zu stören. </li><li> Mischen Sie die fluoreszenzmarkierte Partikel mit einem Zellkulturmedium (hergestellt wie oben beschrieben). Hinzufügen Candida -BFP (bei einer MOI von 10), fluoreszenz konjugiert-Zymosan oder Latexkügelchen-Kaninchen - IgG-FITC (10 Partikel pro Zelle) auf die Zellen. Verwenden, um ein Endvolumen von 200 &amp; mgr; l Medium für eine Kammer auch alle Zellen, um sicherzustellen, abgedeckt sind. </li><li> Spin down die Kammer Schieber bei 277xg für 3 min bei 10 ° C. Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt hilft, den Kontakt zwischen den Teilchen und den Zellen zu erhöhen, und es synchronisiert den Bindevorgang. </li><li> Sofort übertragen die Kammer Folie zu einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Kammer Schlitten aus dem Inkubator und die Medien ansaugen. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS 3x. HINWEIS: Überprüfen Sie das Vorhandensein von nicht gebundenen Partikel mit einem Lichtmikroskop und mehrmals mit PBS waschen, wenn nötig. Es ist wesentlich, ungebundene Partikel aus dem Bohrloch zu entfernen, Hintergrundrauschen während der Analyse zu minimieren. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS verdünnt, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. VORSICHT: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von 4% PFA, die hoch toxisch, korrosiv ist und potentiell karzinogen. Die richtige Vorsicht ist geboten, wenn diese Flüssigkeit verwendet wird. Außerdem schützen Proben aus Licht. </li><li&gt; Die Zellen waschen von 500 ul PBS in die Kammer das Hinzufügen und die Lösung vorsichtig absaugen. </li><li> Zweimal wiederholen 3.1.9 Schritt. HINWEIS: Bei diesem Schritt füllen jedes Fläschchen unmittelbar nach dem vorherigen PBS zu entfernen. </li><li> Stoppen Sie die Fixierung von 10 min mit 500 &amp; mgr; l von 50 mM NH 4 Cl in PBS inkubiert. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 250 &amp; mgr; l Bindungspuffer (0,1% Saponin, 0,2% BSA in PBS) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Stain F-Aktin durch fluoreszenz konjugiertes Phalloidin Zugabe von (1: 500 verdünnt in Bindungspuffer). Inkubiere Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen dreimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (63X Ziel, und 402 nm und 488 nm Laser) unter Verwendung von und zu analysieren , Bilder mit ImageJ 16. HINWEIS: Eine erfolgreiche Partikelbindung durch das Vorhandensein einer Phagozyten cu gekennzeichnet istp an der Stelle , wo das partikuläre Kontakt die phagozytische Zelle (Abbildung 1). Siehe Schritt 3.2.5. </li></ol></li><li> Phagozytose Uptake Assay Hinweis: Dieses Experiment wurde entwickelt , die vollständige Internalisierung von fluoreszent markierten Partikel durch Phagozyten Mikroskopie mittels konfokaler zu überwachen (Abbildung 2). <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um Endozytose sowie unerwünschte Phagozytose zu blockieren, und anschließend einen synchronisierten Phagozytose haben. </li><li> PerfORM Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Übertragen , um die Kammer auf einen Objektträger 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, und inkubiere für verschiedene Zeitpunkte. Fix-Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Beobachten Sie C. albicans beginnen Hyphen bei 60 min nach der Infektion zu bilden; Phagozyten beginnen nach 90 min 8 Zelltod (pyroptosis) zu zeigen. ANMERKUNG: Dies ist eine Empfehlung und Optimierung ist wesentlich abhängig von dem Zelltyp und dem partikulären verwendet. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.7 bis 3.1.15. Analysieren von Bildern mit ImageJ 16. HINWEIS: eine erfolgreiche Aufnahme durch eine vollständige Internalisierung eines partikulären innerhalb des Zytoplasmas einer Phagozyten (Abbildung 2) gekennzeichnet ist. Die Färbung der Phagozyten mit Zelloberflächenmarker wie phalloidin hilft, die Form von Zellen zu beschreiben. Es ist auch wichtig, z-Stacks, um zu bestimmen, ob die teilchenförmige ist gebunden an der Zelloberfläche oder kompl auszuführenetely verinnerlicht. </li></ol></li><li> Live - Imaging von Phagozytose HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Konfokalmikroskopie die verschiedenen Stadien der Phagozytose mittels fluoreszenz konjugiert Zymosan zu erfassen. Wir verwenden die dendritischen Zelllinie DC2.4 , die stabil exprimiert mCherry-markierten F-Actin - 8, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt. Da Phagozytose ein Aktin-gesteuerter Prozess ist ermöglicht die Live - Bildgebung in dieser Zelle nicht nur uns , die Bewegung und Dynamik von F-Actin - Netzwerk zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse innerhalb der lebenden Zellen (Abbildung 3, Film 1) zu visualisieren. <ol><li> Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. HINWEIS: Die Zellen können mit Hämozytometer oder ein gezählt werdenähnliche Technik. </li><li> Halten Sie die Kammer gleitet auf Eis für 10 min. HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um unerwünschte Aufnahme zu blockieren, und ein synchronisiertes Phagozytose haben. </li><li> Führen Sie die Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5 </li><li> Pre-warm das Mikroskoptisch bis 37 ° C und die Kammer mit 5% CO 2 ins Gleichgewicht. Warten 30-45 min für die Temperatur und das CO 2 zu stabilisieren , bevor die Abbildungs beginnen. Hinweis: Da der CO 2 und Temperaturniveaus für die Phagozytose kritisch sind, ist es wichtig , auf dem Mikroskop Erhitzer dem Experiment vor , um den Umgebungsraum äquilibrieren. </li><li> Legen Sie die Kammer schieben Sie die Zellen im Mikroskop - Inkubator - Gehäuse ins Gleichgewicht gebracht bei 37 ° C und 5% CO 2 enthält. </li><li> Führen Sie die Live - Darstellung 17, 18. HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung (Verstärkung, pinhole, etc.) kann in Abhängigkeit von der Art der th variierene Mikroskop und Fluoreszenzsonde verwendet. Daher empfehlen wir die Beratung in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für eine optimale Voraussetzung für Ihre Live - Bildgebung 17,18. <ol><li> Verwenden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (und die dazugehörige Software) für die Live-Darstellung. Verwenden Sie 63X 1.4NA Öl-Objektiv mit einer Loch von 1-1,1 Airy-Einheiten. </li><li> Um die Bildgebung zu starten, verwendet, um das Hellfeld einen repräsentativen Bereich auf der Kammer Folie zu finden. Als nächstes wählen Sie das Feld, indem Sie auf die Software, um die Option für die Position klicken. Zum Nachweis von GFP in Spur 1 der Filtersatz bei 582 nm für 488-nm-Laser mit einem Strahlteiler verwendet, zu erfassen, Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm. </li><li> In Track 2 wählen einen Filter optimal für mCherry (RFP) einen Strahlteiler bei 578 nm und Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm zu erkennen. Verwenden 488 nm und 578 nm-Laser mit 50% Laserleistung und einem Verstärkungsleistung von 600-700. Erhalten Sie Bilder alle 30 Sekunden für insgesamt 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, verschlingen und zu beseitigen Krankheitserreger daher macht Phagozytose ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems eindringen. Während dieses Prozesses durchlaufen Phagozyten umfangreiche Membran Reorganisation und Zytoskelett Umlagerung an ihrer Zelloberfläche 8, 19, 20. Um diesem dynamischen Prozess zu verstehen, die Visualisierung der verschiedenen Phasen...

Trotz der kontinuierlichen Exposition gegenüber Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze, ist unser Körper gut mit Immun-Mechanismus ausgestattet, der Schutz gegen eine Infektion bieten. Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger und stützt sich hauptsächlich auf Phagozyten, die erkennen und ausländische Ziele verinnerlichen. Phagozytose ist ein evolutionär konserviert zellulären Prozess, der die Phagozytose von unerwünschten Partikeln größer als 0,5 &amp; mgr; m umfasst. Phagozytische Zellen exprimieren eine Vielzahl von Immunrezeptoren auf der Zelloberfläche (auch als pattern recognition receptors, PRR bekannt) , die es ihnen ermöglichen , 3 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , die auf Krankheitserreger vor engulfment zu erkennen. Pathogen-Bindung wird durch Rezeptor clustering an der Zelloberfläche folgt und löst die Bildung einer phagozytischen Tasse. Dies führt zu einer Membran Remodeling Aktin-angetrieben, ragt runddas Ziel ist , umhüllen sie schließlich und Abklemmen eines diskreten phagosomalen Vakuole 2, 5 zu bilden. Die phagosome reift dann und säuert durch anschließende Fusion mit späten Endosomen und Lysosomen , die Phagolysosom 6 bildet. Obwohl die Phagozytose als rezeptorvermittelte und Aktin-driven Ereignis beschrieben wird, stützt sich dieses Verfahren auch auf räumlich-zeitlichen Modifikation von Lipiden, die die Plasmamembran, wie Phosphoinositiden (PIs) und Sphingolipide 7, 8 zusammenzusetzen . Während Aktin - Polymerisation durch eine lokale Ansammlung von Phosphoinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) an der Basis des phagozytischen cup diktiert wird, hängt Aktin Depolymerisation auf der Umwandlung von (PI (4,5) P 2 bis Phosphoinosit-3,4,5-bisphosphat (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Beide Änderungensind wichtig , da Ersteres führt zu einer erfolgreichen Verlängerung der Pseudopodien um das Ziel und die letztere ermöglicht 10 von Teilchen in das Cytosol der Phagozyten sinkt. Die Zellen, die die Fähigkeit zu phagozytieren haben , sind entweder professionelle Phagozyten, wie Makrophagen / Monozyten, Granulozyten / Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) oder nicht - professionellen Phagozyten, wie Fibroblasten und Epithelzellen 11. Die Phagozytose von allen Phagozyten ausgeführt spielt eine zentrale Rolle bei der Gewebe Wartung und Umbau, während der Phagozytose von professionellen Phagozyten durchgeführt, um die Koordination der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Krankheitserreger verantwortlich ist. Professionelle Phagozyten nicht nur überfluten und den Erreger zu töten, sondern auch Antigene zu den lymphatischen Zellen des adaptiven Immunsystems. Dies trägt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und den Eingriff von lymphoiden Zellen, daher führt zudie erfolgreiche Blockade der Infektion 12. Herkömmliche biochemische Techniken haben dazu beigetragen, Wissen zu gewinnen über die molekularen Mechanismen der verschiedenen zellulären Prozessen während der Phagozytose, wie post-translationale Modifikationen und verschiedene hochaffinen Assoziation zwischen Proteinen. mit den üblichen biochemischen Methoden ist es jedoch schwierig, Informationen über die räumlichen und zeitlichen Dynamik der phagozytischen Ereignisse zu erhalten. Live-Cell-Imaging ermöglicht uns nicht nur zelluläre Ereignisse in einer Zeit, sensible Art und Weise zu überwachen, sondern auch ermöglicht es uns, Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die verschiedenen Stadien der Phagozytose zu untersuchen, sowie den gesamten Prozess zu analysieren raumzeitlich konfokalen Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dilactat)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Minimal Eagle" </td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-gekoppelte IgG-beschichtete Latexkügelchen</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydlösung (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264,7 Zellen</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4 % (w/v) in PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0,05 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Waschmittellösung</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Kammered 1.0 Borosilikat-Deckglassystem (8 Kammern)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasschiene 10 mit Gittern</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der frühen phasen der phagozytose

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Der Säugetierkörper ist mit verschiedenen Schichten von Mechanismen ausgestattet, die sich von Erreger Invasionen zu verteidigen helfen. Professionelle Phagozyten des Immunsystems - wie Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen - behalten die angeborene Fähigkeit , solche eindringende Krankheitserreger durch Phagozytose 1 zu erkennen und zu löschen. Phagozytose beinhaltet choreografierter Ereignisse von Membran Reorganisation und Aktin - Umbildung an der Zelloberfläche 2, 3. Phagozyten erfolgreich internalisieren und fremde Moleküle nur auszurotten, wenn alle Stufen der Phagozytose erfüllt sind. Diese Schritte umfassen die Erkennung und Bindung des Erregers durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) an der Zelloberfläche aufhalten, die Bildung von phagozytischen cup durch Actin angereicherte membranöse Vorsprünge (Pseudopodien) das teilchenförmige zu umgeben, und Spaltung der phagosome durch Phagolysosom Reifung dass Ergebnisse in derTöten des Erregers 3, 4. Bildgebung und Quantifizierung der verschiedenen Stadien der Phagozytose ist maßgeblich für die molekularen Mechanismen dieser zellulären Prozess Aufklären. Die vorliegende Manuskript berichtet Methoden, um die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu studieren. Wir beschreiben ein Mikroskop-basierten Ansatz zu visualisieren und die Bindung, phagozytische Tasse Bildung quantifizieren und die Internalisierung von partikulären von Phagozyten. Wie Phagozytose auftritt , wenn angeborenen Rezeptoren auf phagozytischen Zellen Liganden auf einem Zielpartikel auftreten größer als 0,5 um ist , die Assays wir die Verwendung von pathogenen Pilzen Candida albicans und andere Teilchen , wie beispielsweise Zymosan und IgG beschichteten Kügelchen umfassen hier präsentieren.

Mikroskopbasierten Verfahren die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu überwachen dargestellt. Die verschiedenen Veranstaltungen während der Phagozytose von verschiedenen fluoreszierenden Partikeln durch DC2.4 Zellen gezeigt. Unter Verwendung der Techniken, die hier beschrieben ist, untersuchten wir die Rolle von Sphingolipiden in den frühen Stadien der Phagozytose. Hierzu DC2.4 dendritischen Zellen genetisch defizient in Sptlc2, das Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Sphingolipid Bi...

Hier beschreiben wir eine mikroskopbasierte Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der frühen Kaskaden von Ereignissen während der Phagozytose von Krankheitserregern wie den Pilzen Candida albicans und Partikeln, die größer als 0,5 μm sind, einschließlich Zymosan und IgG-beschichteten Kügelchen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die verschiedenen Stadien der Phagozytose mit einem konfokalen Mikroskop zu überwachen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern zu beantworten. Vor allem, um zu verstehen, wie Krankheitserreger bei einer Infektion in die Wirtszellen gelangen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach ist und es uns ermöglicht, Informationen über die Viruszelle unserer Ereignisse, die während der Phagozytose auftreten, auf zeitkritische Weise zu erhalten. Bereiten Sie zunächst das fluoreszierend konjugierte Zymosan vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Am Vortag etwa fünfmal 10 bis zum vierten DC 2,4 Zellen in einen Kammerschieber säen, so dass die Vertiefungen zum Zeitpunkt des Experiments zu 60 bis 70 % konfluent sind.Sobald die Zellen die richtige Dichte erreicht haben, platzieren Sie den Objektträger der Kammer 10 Minuten lang bei 10 Grad Celsius. Die Kühlung der Zellen ist notwendig, um die Endozytose zu blockieren und die Zytose umzuschalten. Und anschließend eine synchronisierte Phagozytose zu haben.Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Medium mit einer Pipette oder einem Aspirator aus jeder Vertiefung. Mischen Sie dann das fluoreszierend konjugierte Zymosan mit Zellkulturmedium bei einer Multiplizität von 10 Infektionen. Geben Sie als Nächstes 500 Mikroliter Medium in jede Vertiefung der Kammer, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle bedeckt ist.Drehen Sie dann den Kammerschieber nach unten, um sowohl die Kontakte zwischen den Partikeln in den Zellen zu vergrößern als auch den Bindungsprozess zu synchronisieren. Nach der Zentrifugation wird der Objektträger in einen 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit 5 Prozent CO2 überführt. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius nehmen Sie den Kammerschieber aus dem Inkubator und saugen das Medium an.Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS. Nach der letzten Wäsche mit einem Lichtmikroskop auf das Vorhandensein von ungebundenen Partikeln prüfen und ggf. weitere Wäschen durchführen. Es ist wichtig, ungebundene Partikel aus den Vertiefungen zu entfernen, um Hintergrundgeräusche während der Analyse zu minimieren.Befestigen Sie als Nächstes die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter vier Prozent Paraformaldehyd in PBS in die Vertiefungen geben und sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie die Zellen fixiert haben, waschen Sie sie, indem Sie 500 Mikroliter PBS in jede Kammer geben und dann die Lösung vorsichtig ansaugen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male.Nach der dritten Waschrunde stoppen Sie die Reaktion, indem Sie den Zellen 500 Mikroliter 50 millimolares Ammoniumchlorid in PBS zusetzen und sie 10 Minuten lang inkubieren. Waschen Sie dann die Zellen in 500 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 500 Mikroliter Bindungspuffer in jede Vertiefung geben und die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.Der nächste Schritt besteht darin, F-Aktin zu färben, indem man den Zellen fluoreszierend konjugiertes Phalloidin zugibt und sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Zellen dann dreimal mit 500 Mikrolitern PBS. Nehmen Sie abschließend Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf und analysieren Sie die Bilder mit ImageJ.Um die Zymosanaufnahme zu messen, bereiten Sie Kammerobjektträger mit Zellen vor, wie im Bindungsassay gezeigt. Nach den Kühl- und Etikettierschritten überführen Sie den Kammerobjektträger in einen 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit fünf Prozent CO2. Und inkubieren Sie die Zellen für verschiedene Zeitpunkte.Fixieren Sie die Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Achten Sie darauf, diese Zeitpunkte basierend auf dem jeweiligen Zelltyp und den verwendeten Fluoreszenzpartikeln zu optimieren. Analysieren Sie dann Bilder mit ImageJ.Eine erfolgreiche Aufnahme ist gekennzeichnet durch eine vollständige Internalisierung eines Partikels im Zytoplasma eines Phagozyten. Bereiten Sie zunächst eine Klimakammer für den Mikroskoptisch vor, indem Sie sie auf 37 Grad Celsius erwärmen und die Kammer mit 5 Prozent CO2 ausgleichen. Warten Sie 30 bis 45 Minuten, bis sich die Temperatur und das CO2 stabilisiert haben, bevor Sie die Bildgebung durchführen.Das Erkennen des CO2- und Temperaturniveaus ist entscheidend für die Phagozytose, ebenso wichtig ist es, die Mikroskopheizung vor dem Experiment einzuschalten, um die Umgebung dieser Kammer auszugleichen. Als nächstes bereiten Sie Kammerobjektträger mit DC 2.4-Zellen vor, die das exprimierende mCherry F-Aktin stabilisieren, wie im Bindungsassay gezeigt. Übertragen Sie nach den Schritten Gurren und Etikettieren den Objektträger direkt aus der Zentrifuge auf einen vorgewärmten Mikroskoptisch.Führen Sie schließlich eine Live-Bildgebung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durch, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, um nicht nur die Bewegung und Dynamik des F-Aktin-Netzwerks zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse in den lebenden Zellen sichtbar zu machen. Bei den hier in grün gezeigten Zellen handelt es sich um eine Wildtyp-Zelle DC 2.4, die mit dem kanadischen BFP infiziert wird, das in Rot dargestellt ist. Die Zeitraffer-Bildgebung dient der Visualisierung der frühen Stadien der Phagozytose und wird hier in 30-Sekunden-Intervallen gezeigt.Die mit dem Sternchen gekennzeichneten Orte sind die Orte, an denen der Aktinumbau stattfindet. Der gesamte Vorgang erfolgt in wenigen Minuten. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingolipiden auf ihre Rolle in den frühen Stadien der Phagozytose untersucht.Mit dieser Technik wurde festgestellt, dass Sphingolipide essentiell für die Bindung von Candida albicans an die Zellen sind und die allgemeine Phagozytose reduzieren. Diese Verringerung der phagozytotischen Bindung wurde auch für die Bindung von DC 2.4-Zellen an Zymosen gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Live-Bildgebung durchführen, um das frühe Stadium der Phagozytose zu untersuchen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren kann die Phagozytose anderer Krankheitserreger, einschließlich Bakterien und Parasiten, durchgeführt werden, um die komplexe Beziehung zwischen den Immunzellen und diesen Erregern zu verstehen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um die rezeptorvermittelte Endozytose einschließlich der Phagozytose und der Makropinozytose in Immunzellen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung unabhängiger Makrophagen-vermittelter Phagozytose-Ereignisse der roten Blutkörperchen (RBC). Immunglobulin G (IgG)-opsonisierte humane Erythrozyten der Maus werden mit Mausmakrophagen inkubiert und unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet. Die Erythrozyten werden von Makrophagen über eine phagozytäre Becherbildung verschlungen und gezielt für den lysosomalen Abbau eingesetzt.

Echtzeit-Bildgebung der Makrophagen-Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Diese Studie klärt die phagozytäre Prozessierung von Godanti Bhasma (GB)-Partikeln in Säugetierzellen auf und charakterisiert deren zelluläre Aufnahme, Vakuolendynamik, Versauerung und Abbau. Diese Erkenntnisse verbessern nicht nur unser Verständnis grundlegender Phagozytose-Mechanismen, sondern etablieren GB auch als vielversprechendes Modellsystem für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien.

Erforschung der sequentiellen zellulären Ereignisse der durch Godanti Bhasma ausgelösten Phagozytose in Säugetierzellen

Erfahren Sie, wie Sie die frühen Phasen der Phagozytose mit konfokaler Mikroskopie visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Pathogen-Interaktionen mit Wirtszellen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

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