Name: Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie die Reprogrammierung von peripheren Blutmononukleären Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht effiziente iPSC-Generierung für regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (2013R1A1A1076125).

Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde. 1. Isolierung von monozytären Zellen aus Blut <ol><li> Isolierung von Monozyten (Tag -5) <ol><li> Erhalten Sie mindestens 10 ml frisches Blut aus einer Blutabnahme in einer Zellpräparation Röhre (CPT). </li><li> Übertragen, um das Blut zu einem neuen 50-ml konischen Röhrchen und verdünnte es mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einem 1: 4-Verhältnis. HINWEIS: Ein höheres Verhältnis von Verdünnungs für höhere Reinheit verwendet werden. </li><li> 10 ml Dichtegradientenmedien auf eine neue 50-ml konischen Röhrchen und sorgfältig das verdünnte Blut auf der Oberseite der Dichtegradient Medienschicht. Zentrifuge bei 750 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Zentrifugieren Bremse. </li><li> übertragen Sie vorsichtig die buffy Schicht auf ein neues 50-ml konischen Röhrchen, 30 ml PBS in das Röhrchen, und die Zellen zu waschen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 515 xg für 5 min bei RT. &lt;/ Li&gt; <li> Entsorgen Sie die PBS und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien. </li><li> Zählen Sie die Zellen und die Platte 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well - Platte. Hinzufügen PBS zu den umgebenden Vertiefungen Verdampfung zu verhindern. </li><li> Stabilisierung der Zellen für 5 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 vor der Transduktion. Fügen Sie weitere 0,5 ml frisches Blut Zellmedien an den Tagen 3-4, ohne die Zellen zu stören. </li></ol></li></ol> 2. Transduction von Sendai-Virus <ol><li> Transduction (Tag 0) <ol><li> Sammeln Sie und übertragen Sie die Blutzellen zu einer 15-ml konischen Röhrchen und zähle sie eine Zählkammer. </li><li> Bereiten Sie 3 x 10 5 Zellen pro Übertragung und Zentrifugieren der Zellen bei 515 g für 5 min bei RT. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand durch Absaugen und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien. </li><li> Übertragen, um die Zellen in eine Vertiefung einer nicht-beschichteten 24-Well-Platte. </li><li> Auftauen Mischung Sendai-Virus in Eis und fügen Sie es dem suspended Zellen. In Sendai-Virus in den Zellen basiert auf den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und Zentrifuge bei 1150 × g für 30 min bei 30 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C 2 über Nacht in 5% CO (O / N). </li></ol></li><li> Zellübertragung auf Feeder-Matrix (Tag 1) <ol><li> Am nächsten Tag Mantel eine 24-Well-Platte mit Vitronectin. Verdünne die Vitronectin-Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation es bei RT für mindestens 1 Stunde. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor dem Gebrauch. Beschichteten Platten können für 3 Tage RT gelagert werden. </li><li> Übertragen alle Medien die Zellen und das Virus in die gut beschichtet enthält. </li><li> Sammeln Sie die restlichen Zellen mit zusätzlichen 0,5 ml frisches Blut Zellmedien und fügen Sie ihn in die Zellen enthaltende gut. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 × g für 10 min bei 35 ° C. </li><li> Nach Centrifugation, entfernen Sie den Überstand, 1 ml iPSC Medien und erhalten die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li></ol></li><li> Zweite Zelltransfer (Tag 2) <ol><li> Bestreichen Sie die Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte mit 5 ug / ml Vitronectin, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Verwenden Sie eine Vertiefung der Platte für jede Übertragung. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension aus der ersten Platte in die neu beschichteten Vitronectin Platte. HINWEIS: Wenn nicht benötigt, Suspensionszellen verworfen werden können. Das Verfahren in Schritt 2.3 erwähnt kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, ernten die Zellen. </li><li> Inzwischen 1 ml iPSC Medien zum Brunnen der ersten Platte, für die Wartung, und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> Pflegen Sie die anhaftenden Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 und führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen iPSC Medien. Die Kolonien werden 14-21 nach Transduktion an den Tagen erscheinen. </li><li> Centrifuge die neu beschichteten Platte, die Suspensionszellen bei 1.150 xg und 35 ° C für 10 min enthält. </li><li> Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie es mit frischen iPSC Medien. HINWEIS: Das Verfahren erwähnt in Schritt 2.3 kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, Ernte der Zellen im Überstand und wiederholen Schritt 2.3. </li><li> Pflegen Sie die anhaftenden Zellen mit täglichen Medien Änderungen bis 80% Konfluenz erreicht ist. </li></ol></li></ol> 3. Reprogrammierte Zelle Wartung <ol><li> Frühe Wartung nach der 24-Well-Platte Kultur <ol><li> 7-10 Tage nach Transduktion, sobald die Zellen konfluent sind, bereiten Sie einen Vitronectin-beschichtet, 60-mm-Schale. Verdünnte Vitronectin Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an der Schale und inkubieren es bei RT für mindestens 1 Std. </li><li> Wasch denZellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA hinzu, die Zellen zu lösen. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min. </li><li> Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 3 ml frischem iPSC Medien. </li><li> Platte alle resuspendierten Zellen auf dem neu beschichteten 60-mm-Schale. </li><li> Zugabe von 10 mM RHO - Kinase - Inhibitor zu den Zellen und halten sie bei 37 ° C in 5% CO 2 , bis die Zellen 80% konfluent sind. </li></ol></li><li> Split für Kolonie Aussehen (Subklonierung Vorbereitung) <ol><li> Bereiten Sie eine Vitronectin beschichtet, 100-mm-Schale, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA die Zellen zu lösen. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min. </li><li> Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten 1 x 10 4 Zellen pro Schale.</li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 xg und RT für 2 min. </li><li> Resuspendieren 1 x 10 4 Zellen in 6 ml iPSC Medien, plattieren sie auf die beschichtete 100-mm - Schale, und 10 mM RHO - Kinase in den Medien Inhibitor hinzuzufügen. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 für eine Woche bis zu großen Kolonien erscheinen. HINWEIS: Pflegen und die Kolonien für die Subklonierung erweitern. Subklonierung wird in der Regel in weniger als 5 Passagen durchgeführt. </li></ol></li><li> Colony Kommissionierung iPSC Kolonie unter Verwendung von Löse Lösung <ol><li> Eine Woche vor Kolonie Kommissionierung, Samen 1 x 10 4 Zellen in einer Vitronectin beschichtet, 100-mm - Schale, wie in Schritt 3.2.7 erwähnt. </li><li> Vorbereiten eines Vitronektin beschichtet, 60-mm-Schale in 2 ml von Vitronectin Lösung zugegeben und bei RT Inkubation für mindestens 1 Std. </li><li> Durch die Beobachtung durch ein Mikroskop (40-fache oder 100-facher Vergrößerung), markieren Kolonien mit klaren Grenzen einen Markierungsstift. Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der neuen Platte gemacht in Schritt 3.3.2 und 6 mlMedien mit 10 mM RHO-Kinase ergänzt von iPS. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen und waschen Sie sie mit 3 ml PBS. </li><li> 1 ml der iPSC Kolonie Ablösen Lösung und inkubieren für 30 s bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Lösung von der Platte und Inkubation es bei RT für weitere 30 sec. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette P200, ziehen 200 ul Medium von der Platte und lösen die gezielte Kolonien durch Pipettieren. Übertragen Sie die verstreuten Kolonien auf den neuen 100-mm-Schale. </li><li> Inkubieren und die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 erhalten. Hinweis: Nach einem reinen iPSC Kolonie zu erhalten, wurden die Zellen gehalten, bis sie Passage 10. Charakterisierung erreicht wurde nach mindestens 10 Passagen getan. Antikörperverdünnungen und Primer Informationen sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Da embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mehrere Mängel zeigte, wurde die Notwendigkeit eines alternativen Werkzeug erforderlich. Daher kam die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka im Rahmen des internationalen Rampenlicht. Es ist schon seit fast einem Jahrzehnt Yamanaka entdeckt, dass Pluripotenz, indem nur vier Gene in adulten somatischen Zellen induziert werden kann. Da iPSCs &quot;induziert&quot; von reifen somatischen Zellen sind, können sie ethische Fragen ausweichen, die ei...

Stammzellen haben in den letzten Jahrzehnten ein in der klinischen Therapie einer der attraktivsten Materialien gewesen. Die attraktiven Eigenschaften von Stammzellen sind pluripotent und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. 1981 wurden die ersten embryonalen Stammzellen ( ES- Zellen) von der Maus - Embryo isoliert 2. Wenn jedoch die Technik, um menschliche Embryonen angewendet wurde, stand es mehreren ethische Fragen. Im Jahr 2006, als Dr. Yamanaka und sein Team die erste pluripotenten Zelle aus der Maus somatischen Zellen umprogrammiert, wieder die Stammzellfeld seine Möglichkeit und Interesse wurde 3 neu entfacht. Durch die Bereitstellung von mehreren definierten Faktoren waren pluripotente Stammzellen erfolgreich &quot;induziert&quot; aus adulten somatischen Zellen und wurden so genannt &quot;induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen).&quot; Im Jahr 2007 wurde diese Technik auf menschliche Zellen angewendet 4 - Zellen mit den genauen Eigenschaften der WSR aber keiner der ethischen Diskussion ergibt. Theoretisch iPSCs kann aus jedem Individuum oder Patienten erhalten von jedem Zelltyp erzeugt werden. Patientenspezifische iPSCs als potentielles Werkzeug steigen, dass die Krankheit Phänotypen und epigenetische Bedingungen jedes einzelnen Patienten zu simulieren. Mit Gen - Bearbeitung oder andere Methoden , die können umkehren können die pathogenen Zustand, patientenspezifischen iPS auch 5 in der personalisierten Medizin verwendet werden. Außerdem sind iPSCs weniger mit Immunabstoßung verbunden , weil sie dieselbe Immunidentität als Donor haben, so dass die automatische Transplantation führbarer 6. Deshalb haben iPSCs die vielversprechendste Plattform in Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening werden und regenerative Therapien. In Anbetracht dieser Vorteile, verbesserte Protokolle, die reinere und höhere Erträge in der geringsten Menge an Zeit, von der kleinsten Zellquelle geben kann ständig in der Entwicklung. Ein wichtiger Aspekt der effizientesten Protokoll für die künftige Anwendung finden, ist die primäre Zelltyp. Die meisten der frühen iPSC Generation protocols für anhaftenden Zellen optimiert , da die ursprünglichen iPSC Linien von Fibroblasten der Haut 4 induziert wurden. Jedoch sind die Isolierung und Herstellung dieser Zellen arbeitsintensiv. Auch schließt die Isolierung von Haut-Fibroblasten-invasive chirurgische Verfahren, die ein großes Manko für eine breitere Anwendung werden kann. Daher wird für die weitere Verwendung von iPS-Zellen wird eine Zellquelle mit bequemen Erwerb erforderlich. Blut wird als ideale Zellquelle angesehen , da es durch eine eher minimal - invasive Verfahren 7-9 erhalten wird. In dieser Studie haben wir eine einfache Modifikation des Protokolls hiPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Ohne die schwierige Expansionsprozesses eines bestimmten Zelltyp, wie beispielsweise CD34 + Zellen wurden Vollblutzellen oder PBMCs seriell überzogen auf einer Matrix beschichteten Platten durch Zentrifugation nach der Transduktion mit Sendai-Virus enthält, Yamanaka Faktoren. Dieses Verfahren reduziert die Zeit für die erforderlicheBefestigung von transduzierten schwebenden Zellen und verringert den Verlust von umprogrammiert Zellen, die auf ihren eigenen nicht in der Lage zu befestigen waren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</strong</td></tr><tr><td>>100 mm Schüssel</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92024<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">PBMC Isolation Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Blutzellmedien</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Blut Zellmedienergänzung (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Generations- und Kulturmaterialien</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogrammierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Medien</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC Medien</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Lösung</td></tr><tr> zum Ablösen von Kolonien<td colspan="4">Quality Control Materials</td></tr><tr><td>18 mm Deckglas</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Kaninchen Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molekulare Sonde</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas, beschichtet&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalkohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA-Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Puffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>Ladestern</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) DNA-Leitermarker</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Spülpuffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Spülpuffer</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Spülpuffer</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Spülpuffer</td></tr></tbody></table>

induzierte pluripotente stammzellen erzeugung von blutzellen mit sendai-virus und zentrifugation

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Die jüngste Entwicklung der menschlichen induzierten erwies sich pluripotente Stammzellen (hiPSCs), dass reife somatische Zellen zu einem undifferenzierten, pluripotenten Zustand zurückkehren kann. Nun Umprogrammierung ist mit verschiedenen Arten von adulten somatischen Zellen durchgeführt: Keratinozyten, Urin - Zellen, Fibroblasten usw. Frühe Experimente wurden in der Regel mit dermalen Fibroblasten durchgeführt. Jedoch benötigt dies eine invasive chirurgische Verfahren Fibroblasten von Patienten zu erhalten. Daher Suspensionszellen, wie Blut und Urin-Zellen wurden für eine Neuprogrammierung ideal angesehen wegen der Bequemlichkeit die primären Zellen zu erhalten. Hier berichten wir ein effizientes Protokoll zur iPSC Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Durch Plattieren der transduzierten PBMCs seriell zu einer neuen, matrix-beschichtete Platte unter Verwendung von Zentrifugation kann dieses Protokoll leicht iPSC Kolonien bereitzustellen. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC). Diese Studie stellt eine einfache und effiziente ProtOcol für die Reprogrammierung von PBMCs und CBMC.

Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode PBMCs aus dem Blut isoliert neu zu programmieren. Mit der Kombination von seriellen Plattierung und Zentrifugation wurden iPSCs erfolgreich generiert. Mit dieser Methode konnte iPSCs mit einer geringen Menge an Vollblutzellen erzeugt werden ohne Isolierung oder einen bestimmten Zelltyp zu erweitern. Wir erzielten erfolgreich iPSCs von nur 1x10 4 Zellen in einer kleinen Zellkulturplatte. <p class="jove_content" fo:keep-together....

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie besteht darin, periphere mononukleäre Blutzellen mithilfe serieller Platten nach Zentrifugation in induzierte pluripotente Stammzellen umzuwandeln. Ursprünglich wurden iPSCs durch die Reprogrammierung von Fibroblasten erzeugt. Heute werden verschiedene Zelltypen zur Reprogrammierung verwendet.Jedoch aufgrund der Zugänglichkeit von Blut können PBMCs eine nicht akzeptierte Zellquelle für die weitere Anwendung von iPSCs in der Arzneimittelscreening, der Krankheitsmodellierung und der Entwicklung der regenerativen Medizin sein. In der Studie werden wir ein Protokoll zur Reprogrammierung von iPSCs unter Verwendung von PBMCs durch Hinzufügen von Zentrifugalkraft vorstellen. Dieses Protokoll bietet eine weitere Option bei der Reprogrammierung von schwebenden Zellen.Als Veranschaulichung des Verfahrens verwenden wir Nam, eine Doktorandin aus meinem Labor. Um die monozytären Zellen zu isolieren, gewinnen Sie zunächst mindestens zehn Milliliter frisches Blut aus einer Blutentnahme in einem Zellpräparationsröhrchen. Überführen Sie anschließend das Blut in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen es im Verhältnis 1:4 mit steriler PBS.Anschließend zehn Milliliter Dichtegradientenmedium in ein neues 50-Milliliter-Konischgefäß geben und die verdünnte Blutprobe vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium aufschichten. Danach die Probe 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 750 × g zentrifugieren, ohne Bremsung. Nach 30 Minuten die Buffy-Schicht vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Konischgefäß überführen.Geben Sie 30 Milliliter PBS hinzu und waschen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 515 × g. Danach entsorgen Sie das PBS und resuspendieren die Zellen in 0,5 Millilitern Blutzellmedium.Danach die Zellen zählen und in eine 24-Loch-Platte aussäen. PBS in die umgebenden Vertiefungen geben, um Verdunstung zu verhindern. Anschließend die Zellen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius vor der Transduktion stabilisieren.Fügen Sie am dritten bis vierten Tag zusätzlich 0,5 Milliliter frisches Blutzellmedium hinzu, ohne die Zellen zu stören. Überführen Sie in diesem Verfahren die Blutzellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zählen Sie sie mithilfe eines Hämozytometers. Bereiten Sie anschließend drei mal zehn hoch fünf Zellen für die Transduktion vor und zentrifugieren Sie die Zellen bei 515 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Anschließend den Überstand durch Absaugen verwerfen und die Zellen in 0,5 Milliliter Blutzellmedium resuspendieren. Danach die Zellen in eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Loch-Platte überführen. Die Sendai-Virus-Mischung auf Eis auftauen und zu den suspendierten Zellen hinzufügen.Versiegeln Sie die Platte mit einer Versiegelungsfolie und zentrifugieren Sie sie bei 1.150 × g für 30 Minuten bei 30 °C. Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid. Um eine 24-Loch-Platte am nächsten Tag mit Vitronectin zu beschichten, verdünnen Sie die Vitronectin-Lösung in PBS, um eine Endkonzentration von 5 µg/mL zu erhalten.Fügen Sie anschließend ein Milliliter Vitronectin in eine Vertiefung hinzu und inkubieren Sie es mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Danach entfernen Sie die Beschichtungslösung und überführen das gesamte Medium mit den Zellen und dem Virus in die beschichtete Vertiefung. Sammeln Sie dann die verbleibenden Zellen mit zusätzlichen 0,5 Millilitern frischem Blutzellmedium ein und geben Sie es zu der zellhaltigen Vertiefung hinzu.Anschließend die Platte bei 1.150 × g für zehn Minuten bei 35 °C zentrifugieren und die Zellen anschließend über Nacht bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Für die zweite Zellübertragung die Vertiefung mit fünf µg/mL Vitronectin wie zuvor beschrieben beschichten. Verwenden Sie je eine Vertiefung der Platte für jede Transduktion und übertragen Sie die Zellsuspension von der ersten Platte auf die neu beschichtete Vitronectin-Platte.Unterdessen ein Milliliter iPSC-Medium in eine Vertiefung der ersten Platte zur Erhaltung geben und bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren, wobei täglich frisches iPSC-Medium zugegeben wird. Kolonien erscheinen zwischen Tag 14 und 21 nach der Transduktion. Die neu beschichtete Platte, die die suspendierten Zellen enthält, bei 1.150 × g bei 35 Grad Celsius zehn Minuten lang zentrifugieren.Nach der Zentrifugation die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag das Überstand entfernen und durch frisches Medium für induzierte pluripotente Stammzellen ersetzen. Die angehefteten Zellen durch täglichen Mediumwechsel pflegen, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.Eine Woche vor dem Kolonieausstrich säen Sie zehn hoch vier Zellen in eine mit Vitronectin beschichtete 100-Millimeter-Schale. Bereiten Sie anschließend eine mit Vitronectin beschichtete 60-Millimeter-Schale vor, indem Sie zwei Milliliter Vitronectin-Lösung hinzufügen und mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Markieren Sie mithilfe eines Mikroskops die Kolonien auf der Unterseite der Schale mit klaren Begrenzungen, indem Sie einen Markierstift verwenden.Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung von der neuen Platte und geben Sie sechs Milliliter induziertes pluripotentes Stammzellmedium hinzu, ergänzt mit zehn Millimolar RHO-Kinase. Anschließend entfernen Sie das Kulturmedium von den Zellen und waschen sie mit drei Milliliter PBS. Danach geben Sie ein Milliliter iPSC-Kolonie-ablösender Lösung hinzu und inkubieren sie 30 Sekunden bei Raumtemperatur.Danach die Lösung von der Platte entfernen und die Platte weitere 30 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 30 Minuten 200 Mikroliter Medium von der Platte abziehen und die gezielten Kolonien durch Pipettieren lösen. Anschließend die verstreuten Kolonien in eine neue 60-Millimeter-Schale überführen.Inkubieren und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, bis sie die Passage zehn erreicht haben. In einem frühen Stadium der Reprogrammierung waren iPSCs mit den anhaftenden, nicht reprogrammierten, differenzierten Zellen vermischt. Vor der Ausweitung waren iPSCs und andere Zellen schwer voneinander zu unterscheiden.Indem die Zellen in geringer Dichte ausgesät wurden, erhielt man Kolonien, die groß genug zum Auswählen waren. Nach der Isolierung der Kolonie wurden die Zellklumpen in Einzelzellen dissoziiert und kultiviert. Anschließend waren reine iPSC-Kolonien zu sehen.Nachdem sich die reinen induzierten pluripotenten Stammzellen vermehrt hatten, wurde die Zellqualität überprüft. Die Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase gefärbt, um den undifferenzierten Zustand der induzierten pluripotenten Stammzellen zu bestätigen. Kolonien, die von den isolierten induzierten pluripotenten Stammzellen abstammten, zeigten alle eine positive Färbung.Pluripotente Marker wurden mittels immunfluoreszenzbasierter Färbung bestätigt. Die umprogrammierten Zellen exprimierten pluripotente Marker wie SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 und, am wichtigsten, TRA-1-60 stark; die Expression pluripotenter Marker wurde durch RTPCR bestätigt. Durch serielle Platten nach Zentrifugation wurde die Anheftung von vorübergehend verwendeten PBMCs auf eine mit Matrix beschichtete Platte erreicht.Die Anheftung erfolgt wie vorgesehen, und die iPSC-Kolonien werden zur Reinigung weitergegeben. Mit diesem Protokoll können iPSCs innerhalb eines Monats aus PBMCs erzeugt werden. Dieses Protokoll verkürzt die für die Anheftung transduzierter Zellen benötigte Zeit und verhindert den Verlust reprogrammierter Zellen, die nicht in der Lage waren, sich eigenständig anzuhängen.Jedoch kann die Reinigung vollständig reprogrammierter, koloniebildender iPSCs kritisch sein, wenn dieser Vorgang durchgeführt wird. Zuvor haben wir PBMCs und mononukleäre Zellen erfolgreich mit diesem Protokoll reprogrammiert. Die erzeugten, aus Blutzellen stammenden iPSCs können in verschiedenen Forschungsbereichen breit eingesetzt werden.Dieses Protokoll kann den Reprogrammierungsprozess anderer Arten von schwimmenden Suspensionzellen unterstützen, um weitere Anwendungen und Studien zu ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Dieses Video zeigt die Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) in induzierte neurale Stammzellen (iNSCs) unter Verwendung des Sendai-Virus. Das Sendai-Virus ist ein nicht-integrierendes Virus, das ein effizientes und sicheres Vehikel für die Reprogrammierung von Zellen bietet.

Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Lernen Sie die Reprogrammierung von peripheren Blutmononukleären Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht effiziente iPSC-Generierung für regenerative Medizin.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

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