Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation
21. Dezember 2016
Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.
Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes durch serielles Plattieren durch Zentrifugation in induzierte pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren. Ursprünglich wurden iPSCs durch Reprogrammierung von Fibroblasten erzeugt. Heute werden verschiedene zur Umprogrammierung eingesetzt.
Aufgrund der Zugänglichkeit von Blut können PBMCs jedoch eine nicht akzeptierte Zellquelle für die weitere Anwendung von iPSCs sein, beim Wirkstoffscreening, bei der Modellierung von Abschlussarbeiten und bei der Entwicklung regenerativer Medizin. Im Rahmen der Studie werden wir ein Protokoll über die Reprogrammierung von iPSCs mit PBMCs durch Hinzufügen von Zentrifugalkraft vorstellen. Dieses Protokoll bietet eine weitere Option bei der Reprogrammierung von Floating-Zellen.
Um das Verfahren zu demonstrieren, werden wir Nam, einen Doktoranden aus meinem Labor, verwenden. Um die monozytären Zellen zu isolieren, gewinnen Sie zunächst mindestens zehn Milliliter frisches Blut aus einer Blutabnahme in einem Zellpräparationsröhrchen. Übertragen Sie anschließend das Blut in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen Sie es mit sterilem PBS im Verhältnis eins zu vier.
Geben Sie anschließend zehn Milliliter Dichtegradientenmedium in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium. Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 750 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Zentrifugationspause. Übertragen Sie die Buffy-Schicht nach 30 Minuten vorsichtig in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Fügen Sie 30 Milliliter PBS hinzu und waschen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 515 mal g. Verwerfen Sie anschließend PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern Blutzellmedien.
Zählen Sie anschließend die Zellen und plättieren Sie sie in eine 24-Well-Platte. Geben Sie PBS in die umliegenden Vertiefungen, um eine Verdunstung zu verhindern. Stabilisieren Sie die Zellen anschließend fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie transduzieren.
Fügen Sie am dritten bis vierten Tag zusätzlich 0,5 Milliliter frisches Blut hinzu, ohne die Zellen zu stören. Bei diesem Verfahren werden die Blutzellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und mit einem Hämazytometer gezählt. Bereiten Sie dann dreimal zehn bis fünfte Zellen für die Transduktion vor und zentrifugieren Sie die Zellen bei 515 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Verwerfen Sie anschließend den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern Blutzellmedien. Übertragen Sie dann die Zellen in eine Vertiefung einer unbeschichteten 24-Well-Platte. Tauen Sie die Sendai-Virusmischung in Eis auf und geben Sie sie zu den suspendierten Zellen.
Verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und zentrifugieren Sie sie bei 1.150 g für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubiert. Um eine 24-Well-Platte mit Vitronektin zu beschichten, verdünnen Sie die Vitronektinlösung am nächsten Tag in PBS, um eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.
Geben Sie anschließend einen Milliliter Vitronektin in eine Vertiefung und inkubieren Sie es mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend die Beschichtungslösung und übertragen Sie alle Medien, die die Zellen und das Virus enthalten, in die beschichtete Vertiefung. Sammeln Sie dann die restlichen Zellen mit weiteren 0,5 Millilitern frischem Blutzellmedium und geben Sie es in die zellhaltige Vertiefung.
Zentrifugieren Sie anschließend die Platte bei 1.150 g für zehn Minuten bei 35 Grad Celsius und halten Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Für den zweiten Zelltransfer beschichten Sie die Vertiefung wie zuvor beschrieben mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Vitronektin. Verwenden Sie für jede Transduktion eine Vertiefung der Platte und übertragen Sie die Zellsuspension von der ersten Platte auf die neu beschichtete Vitronektinplatte.
In der Zwischenzeit geben Sie einen Milliliter iPSC-Medium zu Wartungszwecken in eine Vertiefung der ersten Platte und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium täglich mit frischem iPSC-Medium gewechselt wird. Die Kolonien erscheinen am 14. bis 21. Tag nach der Transduktion. Die neu beschichtete Platte, die die suspendierten Zellen enthält, wird zehn Minuten lang bei 1.150 g bei 35 Grad Celsius zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag den Überstand und ersetzen Sie ihn durch frische induzierte pluripotente Stammzellmedien. Pflegen Sie die angehängten Zellen mit täglichem Medienwechsel, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.
Eine Woche vor der Kolonieentnahme säen Sie eine mal zehn bis vierte Zellen in einer mit vitronectinbeschichteten 100-Millimeter-Schale aus. Bereiten Sie anschließend eine mit Vitronectin beschichtete 60-Millimeter-Schale zu, indem Sie zwei Milliliter Vitronektinlösung hinzufügen und mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Markieren Sie durch die Beobachtung durch ein Mikroskop die Kolonien auf der Unterseite der Platte mit einem Markierungsstift mit klaren Grenzen.
Entfernen Sie die vitronektinische Lösung aus der neuen Platte und fügen Sie sechs Milliliter induzierte pluripotente Stammzellmedien hinzu, ergänzt mit zehn millimolaren RFO-Kinase. Entfernen Sie anschließend das Kulturmedium von den Zellen und waschen Sie sie mit drei Millilitern PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter iPSC-Kolonieablösungslösung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.
Nehmen Sie danach die Lösung von der Platte und inkubieren Sie sie weitere 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Ziehen Sie nach 30 Minuten 200 Mikroliter Medium von der Platte und lösen Sie die Zielkolonien durch Pipettieren. Übertragen Sie dann die verstreuten Kolonien in eine neue 60-Millimeter-Schale.
Inkubieren und halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, bis sie die zehnte Passage erreicht haben. In der frühen Phase der Reprogrammierung wurden iPSCs mit den angehängten, nicht reprogrammierten differenzierten Zellen gemischt. Vor der Expansion waren iPSCs und andere Zellen unterschiedlich zu unterscheiden.
Durch die Aussaat der Zellen in einer geringen Dichte wurden Kolonien erhalten, die groß genug für die Entnahme waren. Nach der Isolierung der Kolonie wurden die Zellklumpen in einzelne Zellen dissoziiert und kultiviert. Danach wurden reine iPS-Kolonien gesehen.
Nachdem sich die reinen induzierten pluripotenten Stammzellen vermehrt hatten, wurde die Qualität der Zellen getestet. Die Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase gefärbt, um den undifferenzierten Zustand der induzierten pluripotenten Stammzellen zu bestätigen. Kolonien, die von den isolierten induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet wurden, zeigten alle eine positive Färbung.
Pluripotente Marker wurden durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Die reprogrammierten Zellen exprimierten hochexprimierte pluripotente Marker wie SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 und vor allem TRA-1-60, die Expression von pluripotenten Markern wurde durch RTPCR bestätigt. Bei der seriellen Beschichtung durch Zentrifugation wird bei der Befestigung des Transits PBMC auf einer metrisch beschichteten Platte verwendet.
Die Befestigungen sind wie ausstehend, und die iPS-Kolonien werden für eine Reinigung wiederholt. Mit diesem Protokoll kann iPSC innerhalb eines Monats aus PBMCs generiert werden. Dieses Protokoll reduziert die Zeit, die für die Anheftung von transduzierten Zellen benötigt wird, und verhindert den Verlust von reprogrammierten Zellen, die nicht in der Lage waren, sich von selbst zu binden.
Die Aufreinigung von vollständig reprogrammierten koloniebildenden iPSCs kann jedoch bei diesem Verfahren entscheidend sein. Zuvor haben wir PBMCs und mononukleäre Zellen mit diesem Protokoll erfolgreich umprogrammiert. Die erzeugten iPCs aus Blutzellen können in verschiedenen Forschungsbereichen breit eingesetzt werden.
Dieses Protokoll kann den Reprogrammierungsprozess anderer Arten von schwimmenden Suspensionszellen für weitere Anwendungen und Studien unterstützen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Reprogrammierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung der Zentrifugation vor. Die Methode verbessert die Verfügbarkeit von PBMCs als geeignete Quelle für iPSCs, die in verschiedenen Anwendungen wie der Wirkstoffscreening und regenerativen Medizin eingesetzt werden können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Zellreprogrammierung
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden ursprünglich aus Fibroblasten erzeugt.
- Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) stellen eine leichter zugängliche Zellquelle dar.
- iPSCs finden Anwendung in der Wirkstoffscreening und Krankheitsmodellierung.
- Aktuelle Methoden zur Reprogrammierung von PBMCs sind begrenzt.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen und effektiven Protokolls zur Reprogrammierung von PBMCs in iPSCs.
- Nutzung der Zentrifugalkraft zur Verbesserung des Reprogrammierungsprozesses.
- Bereitstellung einer alternativen Methode für die Arbeit mit schwebenden Zellen.
Verwendete Methoden
- Umwandlung von PBMCs in iPSCs.
- Ausplattieren transduzierter Blutzellen auf Matrix-beschichteten Platten.
- Anwendung der Zentrifugation zur Förderung der Zelladhärenz.
- Induktion von iPSCs aus schwimmenden Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion von iPSCs aus PBMCs unter Verwendung des vorgeschlagenen Protokolls.
- Nachweis der Wirksamkeit der Zentrifugation im Reprogrammierungsprozess.
- Potenzial für breitere Anwendungen von aus PBMCs gewonnenen iPSCs.
- Bereitstellung einer neuen Option für Forscher in der Stammzellbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen einfachen Ansatz, um PBMCs in iPSCs umzu programmieren.
- Diese Methode könnte die Verwendung von PBMCs in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen verbessern.
- Weitere Studien könnten die Anwendbarkeit dieser Technik in der regenerativen Medizin erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Erzeugung von iPS-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzelles und bietet eine nichtinvasive, skalierbare Quelle für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening. Durch die Nutzung der Zentrifugation zur Verbesserung der Zelladhärenz wird die Umprogrammierungseffizienz erhöht und der Zellverlust in frühen Stadien verringert. Die Methode unterstützt die Zielvalidierung und die Entwicklung präklinischer Modelle unter Verwendung von patientenabgeleiteten Zellen und beschleunigt so die translationale Forschung in der regenerativen Medizin.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen unter Verwendung genetisch identischer humaner iPSCs, die aus leicht zugänglichen Blutquellen gewonnen wurden.
- Operativer Wert: Stellt eine nachwachsende Zellquelle zur Klärung von Signalwegen und funktioneller Zielstrukturvalidierung bereit, ohne dass invasive Biopsien erforderlich sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte iPSC-Populationen für konsistente Wirkstofftests und die Entwicklung phänotypischer Assays.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch serielle Anzucht mittels Zentrifugation und verringert so die Variabilität bei Zelladhäsion und Reprogrammierungseffizienz.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse, indem pluripotente Zellen erzeugt werden, die in Linien differenzieren können, die für die Bewertung der Arzneimitteltoxizität und -wirksamkeit relevant sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die skalierbare Vermehrung und Lagerung von iPSC-Kolonien für langfristige präklinische Studien und die Absicherung von Wirkmechanismen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie eine zuverlässige upstream Quelle für iPSCs für downstream Anwendungen bei der Target-Validierung, Assay-Entwicklung und präklinischen Tests bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch die Erzeugung patientenspezifischer iPSCs, die den genetischen Hintergrund des Spenders für mechanistische Untersuchungen bewahren.
- Screening: Erzeugt adhärente, proliferierende iPSC-Kolonien, die nach Transduktion und Selektion für High-Content-Screenings und Dosis-Wirkungs-Analysen geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Reprogrammierungseffizienz anhand von Koloniebildungsparametern und der Expression von Pluripotenzmarkern (z. B. SSEA4, Oct4, TRA-1-60) für Go/No-Go-Entscheidungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem sie differenzierungsfähige Zellen für gewebespezifische Analysen und Sicherheitspharmakologie bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die iPSC-Erzeugung in mehreren Projekten, verringert die Abhängigkeit von der Reprogrammierung von Fibroblasten und ermöglicht parallele Arbeitsabläufe.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem humanstammige, genetisch stabile iPSCs verwendet werden, die die Variabilität von Patienten widerspiegeln.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit der iPSC-Produktion durch definierte Zentrifugationsschritte und Matrix-beschichtete Platten, wodurch die manuelle Variabilität minimiert wird.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem eine frühzeitige Erkennung zielbezogener Phänotypen in humanen zellulären Kontexten ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem mechanistische Messgrößen aus iPSC-abgeleiteten Modellen bereitgestellt werden, die Entscheidungen über die Weiterentwicklung informieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, viraler Transduktion und zentrifugationsbasierten Zellhandhabungstechniken.
- Setzt Zugang zu gekühlten Zentrifugen, Matrix-Beschichtungen (z. B. Vitronectin) und spezialisierten Medien zur Erhaltung von Blutzellen sowie zur Expansion von iPSCs voraus.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich konstanter G-Kraft, Zeitabläufe und Temperatur während der seriellen Ansäe-Schritte, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen bei der Anwendung auf verschiedene aus Blut stammende Zellquellen (z. B. Nabelschnurblut vs. peripheres Blut) aufgrund der Variabilität von Zellviabilität und Transduktionseffizienz.
- Praktische Einschränkungen umfassen den Bedarf an aseptischer Technik während mehrfacher Zellübertragungen sowie mögliche Variabilität der Reprogrammierungseffizienz, abhängig von der Qualität der Donorzellen und deren Passagierungs-Historie.
