Name: Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Lernen Sie Assays zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterieller Adhäsion und Serum-Widerstand. Diese Methoden ermöglichen die Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Anna und Edwin Berger, Lars Hierta, O.E und Edla Johansson Stiftung, dem schwedischen Medical Research Council (gewähren Nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), der Krebs-Stiftung an der Universität Krankenhaus in Malmö, die Physiographische Gesellschaft (Forssman Stiftung) und Skåne County Council Research and Development Foundation.

1. Analyse der Vn als eine bakterielle Oberfläche Protein-Ligand
<ol><li>
Erkennung von Vn-Bindung an der bakteriellen Oberfläche mit Durchflusszytometrie Hinweis: In der Durchflusszytometrie verwendeten wir Side Scatter und forward Scatter um positive Ereignisse Tor. Untersuchen die Wechselwirkungen mit Vn Hif klinische Isolate (n = 10)7 ausgewählt wurden, zusammen mit E. Coli BL21 (DE3) als Negativkontrolle (Abb. 1A).<ol>
<li>Kultur Hif klinische Isolate im Gehirn-Herz Infusion (BHI) Medium mit 10 µg/mL NAD und Hämin bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min ergänzt. Verwenden Sie Luria-Bertani Medium, um E. Coli14Kultur. Hif an Mid Log-Phase zu ernten (OD600 = 0,3)15, und Aufschwemmen der Bakterien in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, mit 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) (Sperrung Puffer; PBS-BSA). Einstellen die Federung, 109 KBE/mL.</li>
		<li>Übertragen Sie der Aliquote mit 5 x 106 KBE bis 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen (12 x 75 mm2) und 1 mL blockierende Puffer. Zentrifugieren Sie die Federung bei 3.500 × g bei Raumtemperatur (RT)16 für 5 min um die Bakterien zu Pellets, dann Aspirieren Sie vorsichtig um den überstand zu entfernen, ohne zu stören das Pellet.</li>
		<li>Aufschwemmen der bakteriellen Pellets mit 50 μL der blockierenden Puffer mit 250 nM VL und inkubieren Sie die Proben für 1 h bei RT ohne schütteln. Nach der Inkubation pellet-die Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 X g für 5 min, dann waschen Sie die Pellets drei Mal mit PBS und ähnliche Zentrifugation Schritte.</li>
		<li>Die bakterielle Pellet fügen Sie 50 μL der primären Schafe Anti-Human Vn polyclonal Antikörper (pAbs hinzu) bei 1: 100 Verdünnung in PBS-BSA. Inkubieren Sie die Aufhängung für 1 h bei RT, dann waschen Sie die Bakterien dreimal mit PBS, ungebundenen Antikörper zu entfernen (siehe Schritt 1.1.3).</li>
		<li>Fügen Sie dann 50 μL der PBS-BSA mit Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert Esel Anti-Schafe pAbs (1: 100 Verdünnung) und 1 h im Dunkeln bei RT inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie ein leeres Steuerelement durch Inkubation Bakterien mit Sperrung nur Puffer und pAbs ohne VL.</li>
		<li>Waschen Bakterien dreimal mit 1 mL Puffer blockiert und die Suspension durch Zentrifugation, pellet, wie im Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Zu guter Letzt Aufschwemmen der bakteriellen Pellets mit 300 µL PBS und Analysieren von Flow Cytometry7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA Analyse der Interaktion zwischen rekombinante PH und VL Hinweis: Steuerelemente müssen aufgenommen werden, um unspezifische Bindung ausschließen. Menschliches Faktor H (FH) oder C4b-Binding Protein (C4BP) bzw. als positive und negative Kontrollen verwendet werden.<ol>
<li>Verdünnen Sie die menschliche Proteine (VL, FH und C4BP) separat auf 50 nM im Tris-HCl, pH 9,0 (Beschichtung Puffer). 100 µL der Proteinlösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Polysorp zu verzichten. Die Platten mit dem Deckel schließen und bei 4 ° C über Nacht (16 h) zur Erleichterung der Immobilisierung des Proteins auf Mikrotiter Platte Brunnen lagern.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Lösung aus der Mikrotiterplatte durch Kippen kopfüber über dem Waschbecken und waschen Sie der Brunnen dreimal mit 300 µL PBS/gut. Die beschichteten Vertiefungen für 1 h bei RT mit PBS mit 2,5 % (w/V) BSA (PBS-BSA) zu blockieren.</li>
		<li>Waschen Sie nach dem Entfernen der blockierenden Lösung, die Brunnen dreimal mit 300 µL PBS mit 0,05 % (V/V) Tween 20 (PBST) pro Bohrloch. Hinzufügen von 100 µL 50 nM rekombinante sein-tagged PH zu jeder Probe gut und 1 h bei RT inkubieren Fügen Sie im Kontroll-Vertiefungen nur 100 µL PBS-BSA. Hinweis: Das Lph gen Kodierung PH von Hif wurde durch PCR verstärkt und in den pET26b Ausdruck Vektor, der einen 6 × His-Tag am C-Terminus des Proteins ausgedrückt fügt geklont. Der rekombinante Vektor verwandelte sich in E. Coli BL21(DE3) für Ausdruck. NI-NTA-Harz wurde verwendet, um das rekombinante Protein15zu reinigen.</li>
		<li>Die Proteinlösung verwerfen und die ungebundenen Proteine durch die Brunnen dreimal mit 300 µL pro Bohrloch PBST Waschen zu entfernen. Hinzufügen von 100 µL PBS-BSA mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Anti-His pAbs (01:10, 000 Verdünnung) und 1 h bei RT inkubieren</li>
		<li>Bereiten Sie 20 mM Lösung A durch Tetramethylbenzidine in einer Lösung von 5 % Aceton und 45 % Methanol auflösen. Zur Vorbereitung der Lösung B lösen Sie 19,2 g Zitronensäure in 1.000 mL H2O, stellen Sie den pH-Wert auf 4,25 durch Zugabe von KOH, dann fügen Sie 230 µL 30 % H2O2. Speichern Sie beide Lösungen im Dunkeln bei RT Kurz vor dem Einsatz mischen Sie 500 µL Lösung B mit 9,5 mL der Lösung A, das ELISA-Erkennung-Reagenz vorzubereiten.</li>
		<li>Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 300 µL PBST pro Bohrloch und erkennen Sie Antigen-Antikörper-komplexe durch Zugabe von 100 µL ELISA Erkennung Reagenz in jede Vertiefung zu.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL 1 M H2SO4/well, die Reaktion zu stoppen. Messung die optische Dichte der Brunnen bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Studie der Interaktion Kinetik der rekombinanten PH und VL mit BLI
	<ol>
<li>Menschlichen Vn auf Amin-reaktive Sensoren verwenden das Amin Kupplung Methode, gemäß des Herstellers Leitlinien11zu immobilisieren.</li>
		<li>Mit PBS, seriell verdünnen Sie den Liganden (rekombinante PH) von 0 bis 4 µM und übertragen Sie die daraus resultierenden Lösungen auf einer 96-Well schwarz, flach-Boden Mikrotiterplatte. Führen Sie das Experiment, bei 30 ° C mit einem BLI Instrument17.</li>
		<li>Laden Sie den Data-Ordner in der BLI-Daten-Analyse-Software. Wählen Sie die Option "Sensorauswahl" . Dann wählen Sie "Referenz gut' (VL-beschichtete Sensor mit PBS-Puffer) für die Subtraktion.</li>
		<li>Wählen Sie "Y-Achse zur Basislinie ausrichten" und "interstep Korrektur und Verband auszurichten". Drücken Sie auf "Prozessdaten", die automatisch die Registerkarte "Analyse öffnet".</li>
		<li>In der Registerkarte "Analyse" die Option "Assoziation und Dissoziation" unter Kurvenanpassung. Wählen Sie das Modell "1:1-Bindung und globale Fitting". Drücken Sie "fit Kurve" und Exportieren Daten17passend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Charakterisierung der Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit
<ol><li>
Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 2 µg/mL Lösung der Vn in PBS und pipettieren 10 µL dieser Lösung auf dem Glas Mikroskop als einen einzigen Tropfen zu schieben. Lassen Sie die Tropfen auf der Folie für 30 min bei RT. Mantel eine Folie mit menschlichen Serum Albumin (HSA) Trocknen als Negativkontrolle.</li>
		<li>Waschen Sie die Protein-beschichtete Glasplatten durch Eintauchen der Folien für zwei Sekunden in einen Becher mit PBS entfernen Sie überschüssiges Protein ungestrichenes dreimal. Fügen Sie 20 mL frische Hif-Kultur (im Schritt 1.1.1 beschrieben) in eine sterile Petrischale aus Kunststoff und Tauchen die Vn- / HSA-beschichtete Glas gleitet in das Kulturmedium. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 1 h unter Schütteln bei 20 u/min. Hinweis: Hif M10 und Hif M10ΔLph wurden in flüssigen BHI-Medium oder auf Schokolade Agarplatten gewachsen. Das Medium für die Lph -Mutante wurde mit 10 µg/mL Kanamycin15ergänzt.</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Inkubation alle ungebundenen Bakterien durch Eintauchen der Folien dreimal in einen Becher gefüllt mit PBS. Visualisieren Sie Bakterien durch gramfärbung, wie beschrieben.<ol>
<li>Entfernen Sie überschüssige PBS aus jeder Folie durch Kippen und berühren den Rand auf Seidenpapier. An der Luft Trocknen der Folien für 3-5 min bei RT und haftende Bakterien zu beheben, indem man jedes Dia dreimal über einer Flamme.</li>
			<li>Halten Sie die Folie an den Rändern mit zwei Fingern auf einem Tablett Färbung und Tropfen Sie 3 – 4 (200 – 300 µL) 2,3 % Kristallviolett-Lösung. Warten Sie 60 s, dann die Folien unter einen sanften Strom von Hahn für 3 – 4 s Wasser zu waschen.</li>
			<li>3 – 4 Tropfen von 0,33 % Jod-Lösung auf den Objektträger. 1 min warten, dann die Folie unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn abspülen. Trocknen Sie sorgfältig die Folien durch Löschpapier.</li>
			<li>3 – 4 Tropfen der Aufhellung Lösung mit 75 % Isopropyl-Alkohol und 25 % Aceton auf der Folie. Abspülen Sie nach 5 – 10 s Objektträger unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn.</li>
			<li>Fügen Sie 3 – 4 Tropfen (200 – 300 µL) grundlegende Carbolfuchsin Lösung. 1 min warten, dann die Folien unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn abspülen. Trocknen Sie die Folien mit Löschpapier.</li>
			<li>Visualisieren Sie die Bakterien unter einem Lichtmikroskop, Auswahl einer Öl-Immersion-Objektivs 100 X Vergrößerung18. Vergleichen Sie die Einhaltung von Hif WT und mutierten Bakterien auf den Vn und HSA-beschichtete Glasoberflächen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Studie des Vn-abhängige Einhaltung von Bakterien Epithelzellen Hinweis: Diese effiziente Einhaltung-Assay wurde in unserem vorherigen Studien4,7eingesetzt.<ol>
<li>Kultur A549 Zellen (Typ II alveolären Epithelzellen) in einem 75-cm2 Gewebekultur Kolben mit F12 Medium mit 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum (FCS) (komplette Medium) und 5 µg/mL Gentamicin ergänzt. 3 Tage bis zu 80 % Zusammenfluss den Kolben in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C inkubieren (Konfluenz abgeschätzt werden durch die Visualisierung Flächendeckung durch die Zellen mit inversen Mikroskop). Die folgenden vier Schritte beschreiben, wie die Epithelzellen der Assay-19,-20vorzubereiten.<ol>
<li>Waschen Sie die Zelle Monolayer in den Kolben zweimal mit 20 mL PBS durch sanftes schütteln. Um die Zellen von der Oberfläche der Küvette abzunehmen, fügen Sie 2 mL Enzymlösung Zelle Ablösung und inkubieren den Kolben für 5 min bei 37 ° c Tippen Sie auf den Kolben mit der Handfläche, alle Zellen aus der Kunststoffoberfläche zu lösen. Pipette nach oben und unten ein paar Mal zu Zelle Klumpen zu zerstreuen.</li>
			<li>Der Kolben 18 mL F12 komplette Medium hinzu und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf eine 50 mL steriles Falcon Röhrchen. Die Zellsuspension für 5 min bei RT 200 X g Zentrifugieren und den überstand verwerfen. Die Zelle Pellet in 10 mL F12 komplette Medium aufzuwirbeln.</li>
			<li>Entfernen Sie 10 µL Zellsuspension und legen Sie sie in ein Eppendorf-Röhrchen, dann 90 µL Trypan blau-Lösung. Laden Sie die Probe in ein Hemocytometer (Tiefe 0,1 mm) nach der Platzierung des Deckglases.</li>
			<li>Zählen alle lebensfähige Zellen in den Bereichen A, B, C und D (jedes Feld besteht aus 16 Quadrate, und jeder Platz hat eine Fläche von 0,0025 mm2), dann berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen ([A + B + C + D] / 4). Berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter unter Verwendung der folgenden Gleichung: Lebensfähige Zellen/mL = durchschnittliche Zelle zählen 10 ×4 × Verdünnung Faktor20. Hinweis: Hier ist der Verdünnungsfaktor 10.</li>
			<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5,0 x 103 Zellen/mL mit komplette mittlere enthält 5 µg/mL Gentamicin. 500 μl Zellsuspension in jede Vertiefung eine Kultur 24 Wohlen Zellplatte zu verzichten. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in 5 % CO2 , bis die Zellen 90 % Zusammenfluss sind.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie vor der bakteriellen Infektion das Medium aus dem Brunnen und fügen Sie F12 Medium (ohne FCS), dann über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie der Zelle Monolage dreimal mit 500 µL PBS an RT. Stelle der Platte auf dem Eis und 100 µL vorgekühlt F12-Medium mit 10 µg/mL VL. Incubate Platte bei 4 ° C für 1 h. Fügen Sie für Kontroll-Vertiefungen nur F12 Medium.</li>
		<li>Nach der Inkubation, verwerfen die Lösung durch pipettieren und Waschen der Zellschicht zweimal mit 1 mL PBS bei RT Aufschwemmen eine Kultur der frisch gewachsenen Hif M10 (Schritt 1.1.1) in F12 Medium (2 × 108 KBE/mL). Jedes gut 100 µL dieser Bakteriensuspension hinzu und inkubieren die Platte für 2 h bei 37 ° c Hinweis: Jede enthält nun ca. 2 x 105 A549 Zellen. Für eine Infektion, 2 x 107 bakterielle KBE wurden hinzugefügt, eine Vielzahl von Infektionen von 100 entspricht.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium durch pipettieren und waschen Sie die Epithelzellen A549 dreimal mit PBS. Fügen Sie 50 µL/Well Zelle Ablösung Lösung und inkubieren die Platte für 5 min bei 37 ° c</li>
		<li>Fügen Sie dann 50 µL F12 komplette Medium pro Bohrloch, die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Epithelzellen (≈100 μL [d.h., das gesamte Volumen]) aus jedem Brunnen, ein 6-mL-Glasrohr mit vier Glasperlen. Lyse der Zellen bei RT durch Vortexen 2 min. lang.</li>
		<li>10 µL der Zelle lysate 100fach verdünnt durch Zugabe von 10 µL lysate, 990 µL F12 Medium. Platte 10 µL der verdünnten Probe auf eine Schokolade nährbodenplatte.</li>
		<li>Über Nacht inkubieren Sie die Schokolade nährbodenplatte bei 37 ° C, dann zählen Sie die Kolonien. Jede Kolonie stellt eine KBE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse der Vn-abhängigen Widerstand gegen die bakterizide Aktivität von Humanserum
<ol><li>Kauf-NHS aus kommerziellen Quellen. VDS als zuvor beschriebenen12vorbereiten. Auffüllen der VDS mit 180 nM Vn, die Vn im NHS entspricht.</li>
	<li>Bereiten Sie Hitze-inaktivierten Serum (KIS) durch Erhitzen von NHS bei 56 ° C für 30 min um Ergänzungs-Proteine inaktivieren. Hinweis: Die optimale Serumkonzentration (5 %) und die Inkubationszeit (15 min) zum Test in Schritten 3.3 – 3.7 beschrieben wurden empirisch ermittelt für Hif15; diese Parameter könnte für andere bakterielle Erreger variieren.</li>
	<li>Kultur von Bakterien (in diesem Fall, Hif M10 und der Mutant Hif M10ΔLph), Mid Log-Phase (OD600 = 0,3). Pellet-Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 X g für 10 Minuten.</li>
	<li>Die bakterielle Pellet mit 1 Volumen von Dextrose Gelatine Veronal Puffer (angehört++; pH 7.3) mit 2,5 % (w/V) Glukose, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2und 0,1 % (wt/Vol) Gelatine aufzuwirbeln.</li>
	<li>Hinzufügen von 1,5 x 103 KBE von Bakterien zu 100 µL angehört++ mit 5 % Serum (NHS, seine, VDS, oder VDS + 180 nM Vn). Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 15 min mit schütteln bei 300 u/min.</li>
	<li>Entfernen Sie eine 10 µL aliquoten aus der Reaktionsmischung bei 0 min (T0 Probe) und 15 min (Tt Probe) und Platte auf Schokolade Agar. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.</li>
	<li>Nach der Inkubation zählen der Kolonien auf der Platte erscheinen. Der Anteil der Bakterien getötet12 unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (KBE bei Tt) / (KBE bei T0) × 100.</li>
</ol>

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<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
<li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li>
<li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins%3A+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiolog%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Bakterielle Krankheitserreger rekrutieren Vn an der Zelloberfläche und Ergänzung der Regler zur Verhinderung der Ablagerung von Komplementfaktoren und Fertigstellung der Membrane Angriff Komplex2zu nutzen. VL fungiert auch als eine Brücke Molekül zwischen bakteriellen Oberflächenproteine und Host-Zell-Oberfläche Rezeptoren, so dass Krankheitserreger an der Oberfläche der Epithelzellen haften und anschließend vermitteln Verinnerlichung. In dieser Studie beschreiben wir Protokolle, die verwendet wer...

Vitronectin (Vn) ist eine wichtige menschliche Glykoprotein Homöostase per Verordnung das fibrinolytische System beteiligt. VL fungiert auch als Regulator Ergänzung durch Hemmung des terminal Ergänzung Weges während der C5b6-7 Komplexbildung und C9 Polymerisation. Verschiedene bakterielle Krankheitserreger haben gezeigt, VL an der Zelloberfläche als Mittel der widerstehenden Ergänzung Ablagerung1,2,3zu rekrutieren. Darüber hinaus fungiert VL wie ein "Sandwich" Molekül zwischen Bakterien und Host epithelialen Zell-Rezeptoren, dadurch Förderung festhalten und Internalisierung von Krankheitserregern2,4,5. Bindung des Vn an der bakteriellen Zellenoberfläche wird durch andere derzeit nicht identifizierte Proteine vermittelt. Voll die funktionale Rolle der Vn-Bindung in Umgehung der Schlauch Immunantwort Aufklärung erfordert daher Identifizierung von Proteinen, VL-recruiting.
Der erste Schritt bei der Ermittlung von Vn-bindende Proteine ist zu prüfen, ob ein Erreger von Interesse gereinigten VL. Durchflusszytometrie binden kann eine bequeme und einfache Methode um festzustellen, ob VL Erreger Zellen gebunden ist. In dieser Studie untersuchten wir die Bindung von Vn an verschiedenen Haemophilus Influenzae Typ f (Hif) klinischen Isolaten6. Die hier beschriebene Methode ist quantitativ und kann verwendet werden, um die Bindungskapazität einer Vielzahl von Bakterienstämmen zu unterscheiden. In einer früheren Studie gekennzeichnet wir Protein H (PH) der Hif als Vn-bindende Protein7. Daher in der vorliegenden Studie das Vn-Bindung-Potenzial der Wildtyp (WT) Hif und Hif M10ΔLph Mutanten wurden verglichen mit den beschriebenen Protokollen.
Sobald festgestellt wird, dass ein Erreger Vn bindet, ist der zweite Schritt, die Oberfläche Proteom zu charakterisieren, um potenzielle Vn-bindende Proteine zu identifizieren. Eine Vielzahl von Ansätzen eignet sich für diesen Zweck8,9, aber diese Methoden sind nicht in diesem Bericht beschrieben. Die Methode am besten geeignet für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist rekombinant express ausgewählte bakterielle Oberflächenproteine in E. Coli und reinigen durch Affinitätschromatographie. Hier verwenden wir PH und seine molekularen Wechselwirkung mit VL um die Methode zu veranschaulichen. Wechselwirkungen zwischen rekombinante PH und VL zeichneten sich mit einem Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)7 und eine neu entwickelte markierungsfreie Technik bekannt als Bio-Schicht Interferometrie (BLI)10,11. Während ELISAs verwendet werden können, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen, bietet BLI detaillierte Daten über die kinetischen Parameter der Interaktionen.
Um die funktionale Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit zu studieren, können zwei verschiedene Tests genutzt werden. Der erste Test hier beschriebenen ist direkte Messung der bakteriellen Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen, während der zweite Test festhalten an der Oberfläche der Epithelzellen untersucht. Für den ersten Test Glas-Objektträger wurden mit VL beschichtet, und die Bindung von WT oder mutierten Hif Stämme wurde durch gramfärbung und Mikroskopie beurteilt. Diese Technik unterscheidet leicht Bakterien basiert auf der Fähigkeit, VL12binden. Bakterielle Adhäsion für Säugerzellen war dann analysiert, durch Zugabe von kultivierten Bakterien auf einem monomolekularen Film der Typ II alveolären Epithelzellen; bakterielle Anlage wurde beurteilt durch zählen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE). Eingehalten und internalisierte Bakterien können in das Vorhandensein oder Fehlen von VL4,13unterschieden werden.
Die Rolle der Vn-Akquisition im bakteriellen Serum Widerstand wurde mit einem Serum Tötung Assay (d.h. Serum bakterizide Aktivität) ausgewertet. Um die Bedeutung der Vn-Akquisition im Serum Widerstand zu beurteilen, wurde die bakterizide Aktivität von Vn-abgereicherte Serum (VDS) mit der normalen menschlichen Serum (NHS) verglichen. Die Methode leicht unterscheidet Vn-Bindung im Vergleich zu nicht-bindenden Bakterien anhand Serum Widerstand. Wir haben diese Methode zur Untersuchung der Rolle der Vn im Serum Widerstand von einigen bakteriellen Krankheitserregern4,12verwendet.
Zahlreiche Methoden wurden für die Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen beschrieben. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die für die Untersuchung von jeder Erreger leicht angepasst werden kann, um die Rolle der Vn in der Pathogenese zu bewerten. Wir testeten diese Protokolle mit verschiedenen Krankheitserregern und Hif wurde gewählt als Beispiel für diesen Bericht.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Thermomixter</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td>Trockenblock-Heiz- und Kühlschüttler</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol-Rohr mit rundem Boden&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 & 75 mm Ausführung</td></tr><tr><td>5% CO2 mitgelieferten Inkubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>6 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &; mal 75 mm Ausführung mit Kappe</td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>Zellkulturqualität</td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxid (H2O2) Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Laboranalytik Qualität</td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>belüftet</td></tr><tr><td>96 Well schwarze Flachbodenplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Gewebekultur behandelt & mikro; Klare schwarze Platten</td></tr><tr><td>A549 Zelllinie human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Zellablösungsenzym (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td></td></tr><tr><td>AR2G-Sensoren</td> für Zellkulturen <td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>Sensor für immobilisiertes Protein durch Aminokupplung</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>97064-786</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumine (BSA)</td> in Analysequalität <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>Geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Bibulöses Papier&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>Bioschicht-Interferometer</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258</td><td>Zweischicht-Interferometrie-Messgerät</td></tr><tr><td>Kristallviolett-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (C4b-Bindungsprotein)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Gekauft als gefrorene flüssige</td></tr><tr><td>Form Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Carbol-Fuchsin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td> American <td>Chemical Society (ACS) Qualität</td></tr><tr><td>Entfärbungslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Wirt (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Proteinexpressionswirt</td></tr><tr><td>F12 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td> Durchflusszytometer <td>in Zellkulturqualität</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>Zellanalysequalität für Forschungsanwendungen&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>Geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Normales humanes Serum (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>Gepooltes Humanserum</td></tr><tr><td>FITC-konjugierte Esel-Anti-Schaf-Antikörper</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td>Polyklonales</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugierte Anti-His-Tag-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td><td>Polyklonaler</td></tr><tr><td>humaner Faktor</td><td>H-Komplement-Technologie, Inc.</td><td>A137</td><td>Gekauft als gefrorene flüssige Form</td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Gefrorene Lösung</td></tr><tr><td>Humanserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>lyophilisiertes Pulver</td></tr><tr><td>Histidin-Affinitätsharzsäule (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Säulen vorgepackt mit Ni-Sepharose</td></tr><tr><td>His-markierter PH</td><td></td><td></td><td>Rekombinant exprimiert und gereinigt in unserem Labor</td></tr><tr><td>Jodlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>Analysequalität</td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Inverses Mikroskop</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>glatt, Größe 25 mm & mal 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mit C-Anschluss 6x His-Tag auf der Wirbelsäule (pET26(b))</td><td>Novagen</td><td>69862-3</td><td>DNA-Vektor</td></tr><tr><td>Polysorb-Mikrotiterplatten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>Für ELISA-Kaliumhydroxid</td></tr><tr><td>(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td><td>American Chemical Society (ACS) Klasse</td></tr><tr><td>Schafe Anti-Human-Vn-Antikörper</td><td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td><td>Polyklonaler</td></tr><tr><td>Schüttler&nbsp;</td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>Plattformschüttler</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr>&<tr><td>nbsp; Thermomischer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>Heiz- und Kühlschüttler für Trockenblöcke</td></tr><tr><td>Tetramethylbenzidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (Vn)</td> in ELISA-Qualität aus humanem Plasma <td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td> in <td>Zellkulturqualität</td></tr></tbody></table>

assays für die untersuchung der rolle von vitronectin in bakterielle adhäsion und serum-widerstand

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bakterien nutzen Ergänzung Regulatoren als Mittel zur Umgehung der Host Immunantwort. Hier beschreiben wir Protokolle für die Bewertung des Rolle Vitronectin Erwerbs bei der bakteriellen Zelle Oberfläche spielt im Widerstand gegen das Immunsystem des Wirts. Flow Cytometry Experimente identifiziert Humanplasma Vitronectin als Liganden für die bakterielle Rezeptor Außenmembran Protein H von Haemophilus Influenzae Typ f. Ein Enzym-linked Immunosorbentprobe-Assay wurde eingesetzt, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen gereinigtes rekombinante Protein H und Vitronectin zu charakterisieren, und verbindliche Affinität wurde anhand Bio-Schicht Interferometrie. Die biologische Bedeutung der Bindung von Vitronectin an Protein H an der bakteriellen Zellenoberfläche in Umgehung der Wirt Immune Antwort bestätigte mit einem Serum-Widerstand-Assay mit normal- und Vitronectin erschöpft Humanserum. Die Bedeutung der Vitronectin in der bakterielle Haftfähigkeit war mit Glas-Objektträger mit und ohne Vitronectin Beschichtung, gefolgt von gramfärbung analysiert. Zu guter Letzt wurde bakterielle Adhäsion zur menschlichen alveoläre Epithelzelle Monolagen untersucht. Die hier beschriebenen Protokolle können die Studie von einer bakteriellen Spezies von Interesse leicht angepasst.

VN-Bindung an der Oberfläche der Bakterien wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Alle klinische Isolaten in dieser Studie getestet Hif rekrutiert Vn an der Zelloberfläche. Keine Interaktion des Vn mit der Zelloberfläche wurde für die E. Coli Negativkontrolle Belastung (Abb. 1A) beobachtet. Wie in Abbildung 1B, ist PH eine große VL-bindendes Protein auf der Oberfläche des Hif Zellen....

Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die Charakterisierung von Interaktionen zwischen bakteriellen äußeren Membranproteine und menschliche Ergänzung Regler Vitronectin. Die Protokolle können verwendet werden, um die Bindung Reaktionen und die biologische Funktion von Vitronectin in alle Bakterienarten zu studieren.

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Wirts-Pathogen-Interaktionsfeld zu beantworten, wie bakterielle Krankheitserreger Beim Menschen Krankheiten verursachen, indem sie menschliche Proteine nutzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist es kann beantworten, wenn jeder Erreger Vitronectin zur Etablierung einer Infektion des Wirts nutzen kann. Wir konzentrieren uns auf Vitronectin, ein Wirtsprotein, das an der extrazellulären Matrix teilnimmt, aber auch als Komplementshemmer im determinanten Weg der Komplementaktivierung fungiert.Diese Fakten sind sehr wichtig und sehr attraktiv für Krankheitserreger, die Krankheiten beim Menschen verursachen. Zur Vorbereitung auf die Durchflusszytometrie setzen Sie die bakteriellen Pellets mit 50 Mikroliter Blockierpuffer n. Chr. mit 250 nanomolar vitronectin auf. Dann inkubieren Sie die Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur ohne zu schütteln.Nach der Inkubation die Bakterien durch Zentrifugieren bei 3, 500 g für fünf Minuten pellet. Dann waschen Sie die Pellets dreimal mit PBS und ähnlichen Zentrifugationsschritten. Nach dem Waschen 50 Mikroliter primärer Schafe antihuman vitronectin polyklonaler Antikörper in das bakterielle Pellet bei ei

assays-for-studying-role-vitronectin-bacterial-adhesion-serum

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

Dieses Video beschreibt eine ELISA-basierte Technik, die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen erkennt, indem die Bindung des zweiten Proteins an das immobilisierte erste Protein gemessen wird. Das gebundene zweite Protein wird mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen, die mit einem Enzym markiert sind, wie z. B. Meerrettichperoxidase.

ELISA-basierte Methode zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Köder- und Beuteproteinen

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, um die Rolle von Vitronektin bei der Adhärenz von Haemophilus influenzae an den Wirtsepithelzellen zu untersuchen.

Ein Assay zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin bei der bakteriellen Adhärenz an Epithelzellen des Wirts

Dieses Video zeigt die Rolle von Vitronectin, einem humanen Serumglykoprotein, bei der bakteriellen Resistenz. Antikörper im Serum interagieren mit bakteriellen Oberflächenproteinen, aktivieren Komplementproteine und bilden den Membranangriffskomplex, der die bakterielle Zelllyse verursacht. Die Bindung von Vitronectin an das bakterielle Membranprotein verhindert die Bildung des Membranangriffskomplexes, was zum Überleben der Bakterien führt.

Bestimmung der Rolle von Vitronectin bei der bakteriellen Resistenz gegen bakterizide Aktivität von Humanserum

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Adhäsion von Krebszellen an neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) nachzuweisen. In den Testvertiefungen gibt es einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl fluoreszenzmarkierter Krebszellen, die an NETs haften, während Wells, die mit DNase behandelt wurden, eine verminderte Adhäsion von Krebszellen an NETs aufweisen.

In-vitro-Adhäsionsassay zum Nachweis der Adhärenz von Krebszellen an extrazellulären Fallen von Neutrophilen

Dieses Video zeigt den Nachweis der Wechselwirkung von Vitronektin mit bakteriellen Oberflächenproteinen. Die durchflusszytometrische Analyse misst das Fluoreszenzsignal von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die an Vitronektin gebunden sind, und bestätigt damit deren Vorhandensein an der Bakterienoberfläche. Diese Technik bietet Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen und potenzielle bakterielle Infektionstherapien.

Nachweis der Bindung von Vitronectin an bakterielle Oberflächen mittels Durchflusszytometrie

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist ein wichtiger Schritt während der Besiedlung und Infektion des Wirts. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von polymergekoppelten rekombinanten Adhäsinen als biomimetische Materialien, die es ermöglichen, den Beitrag einzelner Adhäsine zu diesen Prozessen unabhängig von anderen bakteriellen Faktoren zu analysieren.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Hierin wird ein Verfahren zur Bestimmung der Assoziation und Konkurrenz zwischen den Königreichen (bakteriell und pilzlich) für die Adhärenz an virusinfizierten HeLa-Zell-Monoschichten beschrieben. Dieses Protokoll kann auf mehrere Kombinationen von Prokaryoten, Eukaryoten und Viren ausgeweitet werden.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Abbildung einzelner migrierender Thrombozyten unter Verwendung von RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern mit einstellbarer Dichte bereitgestellt, das zeigt, dass Thrombozyten genügend Kraft erzeugen, um die Avidin-Biotin-Bindung zu brechen.

Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Thrombozytenmigration mit RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern

Lernen Sie Assays zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterieller Adhäsion und Serum-Widerstand. Diese Methoden ermöglichen die Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen.

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

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