Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes besteht darin, die Leberkolonisation durch metastatische Tumorklone, die von kolorektalen Karzinomen ausgehen, zu modellieren und dieses Modell zur Verbesserung der Diagnostik und Therapie von Lebermetastasen zu nutzen. Klinische Beobachtungen deuten auf die Heterogenität der metastatischen Erkrankung hin. Unser Modell ermöglicht es, diese Heterogenität abzubilden, um Gene zu identifizieren, die mit oligometastatischen und polymetastatischen Verläufen assoziiert sind.

Und dieses Wissen zur Verbesserung der Früherkennung und Behandlung von Metastasen einzusetzen. Der Hauptvorteil unserer Technik liegt darin, dass wir doppelt markierte monoklonale Zelllinien verwenden, die von Patienten mit kolorektalem Karzinom stammen, und so die Entwicklung von Lebermetastasen sowohl in vivo als auch ex vivo beobachten können. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie metastasierender Erkrankungen.

Es ermöglicht uns, jeden potenziellen Wirkstoff mit einer quantitativen Abschätzung der Anzahl metastatischer Läsionen und des Wachstumskinetik jeder einzelnen Läsion zu testen. Nachdem luciferase-tdTomato-markierte HCT116-Zellen erzeugt sowie Medien, Reagenzien und Geräte gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, die transfizierten Zellen in 96-Well-Platten in Dreifachbestimmung mit den folgenden Dichten pro Well ansäen. Nach einer fünf Stunden dauernden Inkubation der Zellen quantifizieren Sie die fluoreszierenden Intensitäten von tdTomato mithilfe eines IVIS-Systems, indem Sie die Bildsoftware auf dem Desktop starten.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, um die Bildaufnahmezeit, die mittlere Binning-Stufe, zwei für die Blende, 535 für den Anregungsfilter und 580 für den Emissionsfilter zu initialisieren. Platzieren Sie die 96-Loch-Platte auf der Bildgebungseinheit, und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildaufnahme zu starten. Nachdem das Bild erfasst wurde, klicken Sie in der Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge und wählen Sie 12x8 über das Schlitzsymbol aus.

Erstellen Sie 12×8 Schlitze, um den Bereich des Signals auf dem Bild der 96-Loch-Platte abzudecken, und klicken Sie auf den Reiter „Measurements“. Beobachten Sie ein Fenster mit der Tabelle der ROI-Messungen mit den Einheiten Photonen pro Sekunde, pro Steradiant, pro Quadratzentimeter. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 Prozent erreicht haben, etwa eine Stunde vor der Injektion in die Milz, geben Sie 0,05 Prozent Trypsin und 0,53 Millimolar EDTA zu den Zellen, um sie zu lösen.

Nach einer Inkubation der Zellen für drei bis fünf Minuten verwenden Sie ein gleiches Volumen an C-DMEM, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie die Kulturen gründlich, um Klumpenbildung zu vermeiden, und zählen Sie die Zellen anschließend mit einem automatischen Zellzähler. Gefrieren Sie die suspendierten Zellen in 1x DBPS bei einer Konzentration von 1,2 bis 2 × 10⁶ Zellen pro 100 µL, wobei gründlich pipettiert wird, um Klumpenbildung zu verhindern.

Anschließend die Zellen auf Eis lagern und gelegentlich durch Schwenken im Reagenzglas erneut suspendieren. Nach Verabreichung von Analgetika und Anästhesie einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen athymischen Nacktmaus gemäß dem beschriebenen Protokoll die Milz als eine violette, äußerlich durch die Haut sichtbare Region an der linken Flanke identifizieren und einen acht Millimeter langen Schnitt in die Haut an der linken Flanke direkt oberhalb des Organs setzen. Danach die Bauchdecke anheben und einen kleinen Einschnitt machen.

Lassen Sie Luft in die Bauchhöhle ein, damit sich die inneren Organe von der Schnittstelle zurückziehen. Vergrößern Sie dann den Schnitt in der Bauchwand auf etwa fünf Millimeter. Die für die Injektion gezeigten Schritte sind entscheidend für das Verfahren.

Ein Austreten von Tumorzellen während der Injektion kann zu extrahepatischen Metastasen führen. Die Injektion sollte langsam über 30 bis 60 Sekunden durchgeführt werden, mit nicht mehr als 1,5 Millionen Zellen, um eine thrombotische Verlegung der Pfortader zu verhindern. Legen Sie die Milz frei, indem Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig Druck um den Schnitt herum ausüben.

Falls erforderlich, kann das Pankreasfett vorsichtig manipuliert werden, um die Exposition zu erleichtern, ohne die Milz zu verletzen. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 27-Gauge-Nadel injizieren Sie über einen Zeitraum von 30 bis 60 Sekunden 100 Mikroliter Zellen in die Spitze der exponierten Milz. Am Ende der Injektion setzen Sie vor dem Entfernen der Nadel einen Mikro-Clip an die Milz, um ein Austreten der injizierten Zellsuspension zu verhindern, und belassen ihn fünf Minuten lang an Ort und Stelle.

Fünf Minuten nach der Injektion verwenden Sie ein handgehaltenes Koagulationsgerät, um eine Splenektomie zur Blutstillung durchzuführen. Beginnen Sie am splenalen Hilus auf der Vorderseite, indem Sie die proximale Seite der Gefäße zusammen mit dem angrenzenden Fettgewebe vorkoagulieren. Eine Blutung der Milz kann an der Injektionsstelle auftreten.

Der Mikro-Clip wird an der Milz angebracht, um ein Austreten von Tumorzellen zu verhindern und eine milzbedingte Blutung zu kontrollieren. Methoden der Blutstillung können das Kauterisieren, das Ausüben von Druck für drei bis fünf Minuten sowie gegebenenfalls eine Nahtligatur umfassen. Schließen Sie die Bauchwand mit einer resorbierbaren, geflochtenen 5.0-Naht und einem einzelnen horizontalen Stich.

Verwenden Sie anschließend eine nicht resorbierbare Monofilet-Naht (4,0), um die Haut ebenfalls mit einem einzelnen horizontalen Stich zu verschließen. Überwachen Sie das Tier postoperativ gemäß dem schriftlichen Protokoll. Zur Durchführung der Biolumineszenzbildgebung injizieren Sie den nach dem schriftlichen Protokoll anästhesierten Mäusen 150 Mikroliter zuvor vorbereitetes Firefly-Luciferin intraperitoneal.

Platzieren Sie die Mäuse in Rückenlage im IVIS, wobei Abstandshalter zwischen den Tieren angebracht werden, um die Signalübertragung auf benachbarte Mäuse zu minimieren. Drei Minuten nach der Luciferin-Injektion, nachdem der IVIS initialisiert wurde, wählen Sie Lumineszenz, eine Belichtungszeit von einer Sekunde und mittlere Binning-Stufe. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Acquire“, um die Bildaufnahme zu starten, und stellen Sie sicher, dass die Bildaufnahme stets drei Minuten nach der Luciferin-Injektion erfolgt.

Nachdem das Bild aufgenommen wurde und ein Bildfenster sowie eine Werkzeugpalette erscheinen, klicken Sie auf ROI-Werkzeuge und wählen Sie eine Zahl von eins bis fünf über das Kreissymbol aus, die der Anzahl der abgebildeten Mäuse entspricht. Um ROIs zu definieren, umkreisen Sie den Signalbereich des lumineszenten Signals in der Bauchhöhle der Maus und klicken Sie anschließend auf Messungen des ROI als willkürliche Einheit der Strahlungsstärke. Fügen Sie einen zusätzlichen ROI-Kreis für den Hintergrund hinzu.

Vier Wochen nach der Injektion, um eine diffuse lumineszente Bildgebungstomographie (DLIT) durchzuführen, nachdem das IVIS initialisiert wurde, wählen Sie den Bildassistenten, Biolumineszenz, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie DLIT aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Firefly-Sonden aus und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie Maus als Bildsubjekt, Automatisch für die Belichtungsparameter, 13 Zentimeter für das Sichtfeld und 0,5 Zentimeter als Subjekttyp aus und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen, um die Bildaufnahme zu starten. Nachdem ein Bild aufgenommen wurde, wählen Sie im Reiter Analysieren die Registerkarte DLIT-3D-Rekonstruktion aus und klicken Sie auf Rekonstruieren, um das 3D-Rekonstruktionsbild zu erzeugen.

Klicken Sie auf Werkzeuge und 3D-Animation. Wählen Sie dann im Fenster 3D-Animation Drehung gegen den Uhrzeigersinn um die Y-Achse aus. Klicken Sie auf Aufnehmen und Speichern, um die Datei im mov-Format zu speichern.

Um die ex vivo-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen, messen Sie nach der Entnahme und Dissektion der Lebern von Mäusen gemäß dem Textprotokoll die Fluoreszenzintensitäten jeder Tumorkolonie mit dem IVIS. Wählen Sie dazu Fluoreszenz, eine Belichtungszeit von vier Sekunden, mittlere Binning-Stufe, 2 für Blende, 535 für den Anregungsfilter und 580 für den Emissionsfilter. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Acquire“, um die Bildaufnahme zu starten.

Nachdem Sie das Bild erfasst haben, suchen Sie das Bildfenster in der Werkzeugpalette. Klicken Sie auf ROI-Werkzeuge und wählen Sie 1 im Kreissymbol aus. Um ROIs zu definieren, umkreisen Sie den Signalbereich einzelner Tumorkolonien auf dem Bild.

Wählen Sie einen zusätzlichen ROI-Kreis des Hintergrunds aus und klicken Sie dann auf „Measurements of the ROI“ als willkürliche Einheit der Strahlungsstärke. Wählen Sie einen weiteren ROI-Kreis des Hintergrunds aus. Führen Sie abschließend die Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch.

Wie hier durch Biolumineszenz gezeigt, wiesen die HCT116 L2T-Klone P1 und P2 drei Wochen nach der Milzinjektion eine stärkere Tumorbürde auf im Vergleich zu den Klonen O1 und O2. Diese Daten zeigten, dass die Klone O1 und O2 eine oligometastatische Erkrankung nachahmen können, während P1 und P2 eine aggressive, weitverbreitete Metastasierung in der Leber darstellen. Die Quantifizierung der ex vivo-Fluoreszenz der Leber vier Wochen nach der Milzinjektion bestätigte, dass P1 und P2 höhere Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zu den Lebern von O1 und O2 aufwiesen. Die fluoreszenzmarkierte Färbung der Tumorklone ermöglichte die Identifizierung der Anzahl und Größe einzelner metastatischer Kolonien in der Leber.

Insgesamt stimmten die ex vivo-fluoreszenten Bilder mit den makroskopischen Befunden überein, jedoch wurden kleine Kolonien, die unter der Oberfläche verborgen lagen, mittels Fluoreszenzbildgebung besser erfasst. Wie hier dargestellt, wurden die Anzahl und Größe metastatischer Kolonien in jeder Leber gezählt und gemessen, und die ex vivo-Fluoreszenzbildgebung wurde für jede metastatische Kolonie jedes Monoklons durchgeführt. Wie in diesen Grafiken gezeigt, war die Gesamtanzahl der Metastasen in P1 im Vergleich zu P2, O1 und O2 höher, während die durchschnittliche Größe einzelner Kolonien in P2 größer war als in P1, O1 und O2. Unser Modell bietet einen Ansatz zur Identifizierung neuer PERSUASION-Gene, die mit der molekularen Heterogenität der Metastasierung assoziiert sind.

Diese Gene können als Zielstrukturen für neue Ansätze zur Behandlung von Metastasen verwendet werden. Unser Modell kann ebenfalls zur Validierung verschiedener protein- und nicht-proteincodierender Gene eingesetzt werden, die aus aktuellen großen klinischen Datenbanken hervorgehen, aber im Kontext metastasierender Erkrankungen noch nicht funktionell definiert sind. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Delikatesse des Tierexperiments Schwierigkeiten haben.

Jedoch sind mit etwas Übung innerhalb kurzer Zeit gute Ergebnisse erzielbar. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Richtlinien für Tierversuche einzuhalten, die Blutung sorgfältig zu kontrollieren und ein Austreten der Tumorzellsuspension zu verhindern.