Name: Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Nutzung von Mikroglia als Biosensor zur Erfassung von Nanopartikel-Neurotoxizität in vitro. Diese Methode ermöglicht die Bewertung neurotoxischer Faktoren ohne langwierige Tierstudien.

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Diese Arbeit wurde vom US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (an TAB) und Zuschüssen von der University of Minnesota Healthy Foods, dem Healthy Lives Institute (an CMD, JPN und TAB) und der Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (an TAB) finanziert. Wir danken Dr. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) und Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) für die Bereitstellung der BV2-Zelllinie.

1. Mikroglia Zellkultur Wartung <ol><li> Warm Zellkulturmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin (PSN) bis 37 ° C. </li><li> Erhalten Sie gefrorene Lager von BV2 Mikroglia-Zellen bei Passage 18 - 25 von Lagerung bei -80 ° C. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C warmen Wasserbad. </li><li> Sanft Zellen auf eine 75 cm 2 innen belüfteten Kolben übertragen Kulturmedien , die 10 ml - Zelle. </li><li> Inkubieren Kolben in 5% CO 2 bei 37 ° C. Absaugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen Sie sie durch frische Medien. Wachsen Zellen bis etwa 70 bis 80% Konfluenz. </li></ol> 2. Zählen und Plating Cells <ol><li> In einem 37 ° C Wasserbad, warm DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung. </li><li> Absaugen Medien von Zellen und 500 ul Trypsin hinzuzufügen. 5 min - für 2 bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Verwendung eines Schabers, entfernen Zellen aus dem Kolben und suspendieren in 5 mlDMEM. Passieren Zellen durch ein 70 um-Sieb in ein 50 ml-Röhrchen dreimal. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 8000 Zellen / Vertiefung in einem schwarzen walled klare Bodenplatte in einem Gesamtvolumen von 200 &amp; mgr; l DMEM, das mit 10% FBS und 1% PSN. Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Std. </li><li> Entfernen Sie alte DMEM und ersetzen mit 200 ul erwärmt DMEM mit 1% PSN ergänzt Serum Mikroglia verhungern. Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Std. </li></ol> 3. Aktivieren Mikroglia <ol><li> In getrennten Röhrchen, verdünnter AGNPS (0,01, 0,05 oder 0,1 &amp; mgr; g / ml) und Fahrzeug / Neutralsteuerung (Natriumcitrat, 0,04 mM) in serumfreien DMEM, ergänzt mit 1% PSN der endgültigen Arbeitskonzentrationen. </li><li> Entfernen 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen mit 100 ul geeigneten Behandlungsverbindung. </li><li> Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Std. </li></ol> 4. Filter Anlage Medien <ol><li> Sammle 200 ul Medien Überstand aus jeder Vertiefung und Überführung in einen Filter (Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa) mit Sammelröhrchen (1,5 bis 2 ml Kapazität). </li><li> Zentrifuge bei 14.000 xg bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Verwerfen Sie den Durchfluss durch (Überstand mit Partikeln) und legen Sie den Filter Kopf nach unten in eine neue Sammelröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 1000 xg bei Raumtemperatur für 2 min. HINWEIS: Die sich ergebende gefilterte Medium (enthaltend sekretierten Zytokine) durch sechsfach konzentriert. </li><li> Bringen Sie das Volumen des Konzentrats zu 400 &amp; mgr; l mit frischem DMEM, das mit 10% FBS und 1% PSN und auf Eis lagern. ANMERKUNG: Um sicherzustellen Rest AGNPS aus gefilterten Medien entfernt werden, erzeugen eine AgNP Konzentration basierend auf der charakteristischen Peak bei etwa 390 bis 420 nm 10. Kurz gesagt, bereiten Aliquots von ungefilterten AGNPS und filtriert (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 &amp; mgr; g / ml in Schritt 3.1 beschrieben)Fahrzeugsteuerung (Natriumcitrat, 0,04 mM) in serumfreiem DMEM. Aliquot 50 ul gefilterten Proben und Standards in einem schwarzen walled klare Bodenplatte. Mit einem Spektralphotometer messen Absorption bei 390-410 nm und vergleichen Messwerte zum AgNP Konzentrationskurve. Wenn gefilterten Abtastproben den gleichen Absorptionswert als Fahrzeugkontrollprobe haben, kann es Rest AGNPS entfernt angenommen werden. </li><li> Verwenden Hälfte der gefilterten Medien TNF-α Sekretion folgenden Anweisungen von einem im Handel erhältlichen Kits zu bestimmen. </li></ol> 5. Hypothalamus Cell Culture Wartung <ol><li> Warmen DMEM Zellkulturmedium mit 10% FBS und 1% PSN auf 37 ° C ergänzt. </li><li> Erhalten Sie gefrorene Lager von Hypothalamus (mHypo-A1 / 2) Zellen bei Passage 18 - 25 bei 80 ° C gelagert. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C warmen Wasserbad. </li><li> Sanft Zellen auf eine 75 cm 2 innen belüfteten Kolben übertragen Kulturmedien , die 10 ml - Zelle. </li><li> Inkubieren Kolben in 5% CO 2 </sub&gt; bei 37 ° C. Absaugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen Sie sie durch frische Medien. Wachsen Zellen bis etwa bei 70-80% Konfluenz. </li></ol> 6. Bestimmung des Hypothalamus Zelltoxizität <ol><li> Warm DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Absaugen Medien von Hypothalamus-Zellen und 500 ul Trypsin hinzuzufügen. 5 min - für 2 bei 37 ° C inkubieren. Entfernen Zellen aus Kolben mit einem Schaber, wie oben in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Zählen von Zellen eine Zählkammer und Hypothalamus Zellen bei 5.000 Zellen / Well in einem schwarzen walled klare Bodenplatte in einem Gesamtvolumen von 200 &amp; mgr; l DMEM , das mit 10% FBS und 1% PSN und Inkubation über Nacht in 5% CO 2 bei 37 ° C - Platte . </li><li> Entfernen 100 ul alten Medien einen mehrkanaligen Pipettierer mit und fügen 100 ul gefiltert konzentriert konditionierten Medien, bis zu einer endgültigen Konzentration von 1x. </li><li> Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Std. </li><li> In 221; l Resazurin Reagenz und Platte für 20 min in 5% CO 2 bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Mit Hilfe eines Multimode-Spektrophotometer, Rekord-Fluoreszenz (560 nm EX / 590 nm EM) die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Bericht Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Neuere Studien belegen, dass Umwelteinflüsse zu Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen beitragen 11,12. Die in früheren Studien verwendeten Techniken sind jedoch zeitaufwändig und teuer. Wirtschaftliche Überlegungen, physiologisch relevante Verabreichungssysteme, ethische Fragen bei der extensiven Verwendung von In-vivo-Tiermodellen und Schwierigkeiten bei der Umsetzung der Ergebnisse in aussagekräftige Gesundheitsempfehlungen sind einige der größten Herausforderungen, die Fortschr...

Umweltbelastungen, insbesondere diejenigen der Nanopartikel (NP) Bereich (1 - 20 nm Durchmesser), haben aufgrund der Fähigkeit zur Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden 1-3 die Blut - Hirn - Schranke zu überwinden. Erhöhte Exposition gegenüber Verschmutzung kann eine Entzündung im zentralen Nervensystem, den Hypothalamus 1 induzieren. Ein potentieller Mechanismus , bei dem dies geschieht , durch Nanopartikel induzierte Aktivierung von Mikroglia (brain Immunzellen) 4 sein könnte. Frühere Studien haben in - vivo - Modellen verwendet , um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf die Gesundheit des Gehirns zu untersuchen , die zeitaufwendig, teuer, und antworten Sie nicht direkt auf die Frage, wie NPs Mikroglia beeinflussen. Mikroglia spielen eine facettenreiche Rolle im zentralen Nervensystem, einschließlich der Wartung des Gehirns Mikroumgebung und die Kommunikation mit Neuronen über die Freisetzung von sekretierten Faktoren und Zytokine umgibt. In Abhängigkeit von den Stimuli können Mikroglia zu einem M1 pr aktivierbaro-entzündliche oder M2 anti-inflammatorische Zustand. Beispielsweise Aktiv M1 lösen Mikroglia proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), während M2 Mikroglia Freisetzung anti-inflammatorische Zytokine einschließlich Interleukin-4 (IL-4) aktiviert. Um unsere Leihmutter in - vitro - Biosensor zur Bestimmung von Neurotoxizität von Luftschadstoffen zu validieren, wir gemessen Mikroglia Reaktion auf 20 nm Silber - Nanopartikel (AGNPS). Das Ziel dieses Artikels ist es zu beschreiben , wie ein in - vitro - Mikroglia - Zelllinie kann zum Testen murine Mikroglia Reaktion auf NPs und wie Mikrogliaaktivierung wirkt Hypothalamus Zellen als Ersatz Biosensor Marker verwendet werden. Die langfristige beabsichtigte Anwendung dieser validierten Modelleffekte aus der realen Welt Schadstoffen auf die Gesundheit des Gehirns und neurodegenerative Krankheit zu prüfen ist. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-Well - Format - Assay für die im Anschluss an die Belichtung von mic Mikroglia - Aktivierung und hypothalamischen Zellüberlebensmess<html> roglial konditionierten Medien. Mikrogliaaktivierung wurde nach AgNP Exposition bestimmt einen TNF-α Enzym Linked Immuno Assay (ELISA). Um die Wirkung von aktivierter Mikroglia auf Hypothalamus-Zellen zu bestimmen, wurden die AGNPS von Mikroglia-Überstand (konditioniertes Medium) unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung entfernt. Die Filtervorrichtung behält während Zytokine die AGNPS ohne basierend auf Größe. Kurz gesagt, Überstand aus mit oder ohne AGNPS behandelt Mikroglia wurde zu den Filtern gesammelt, zugegeben und bei 14000 × g für 15 min zentrifugiert. Wir waren dann in der Lage, den Einfluss von Mikroglia-Zytokine auf Hypothalamus die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Zelltoxizität zu konditionierten Medien (enthaltend Zytokine) nach der Belichtung wurde mittels eines Resazurin-basierten Assay bestimmt , wie zuvor beschrieben , 5,6. Metabolisch aktive Zellen reduzieren Resazurin und ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen 7 herzustellen. nt &quot;&gt; Es gibt mehrere Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen (zB Co-Kultur, trans-well - Setups oder in vivo - Experimente). Unser Modell die Fähigkeit Mikroglia direkt aktivieren liefert und festzustellen , ob sekretierten Faktoren Neuronen 8 toxisch sind . der aktuelle Protokoll verwendet immortalisierten BV2 Mikroglia mit 20 nm Durchmesser Nanopartikel stimuliert und immortalisierten murinen Hypothalamuszellen (mHypo-A1 / 2 bezeichnet) 9 zur Bestimmung der anschließenden Reaktion. Während dieses Protokoll für diese besonderen Bedingungen optimiert worden ist, können die Verfahren sein , verändert in anderen Modellen der Mikroglia-induzierten Zelltod verwendet werden, oder mit anderen Zelltypen, einschließlich primärer Mikroglia und Neuronen.

<table><tbody><tr><td>Zellen/Reagenzien</td>Maus-Mikroglia-Zelllinie <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(BV2)</td><td>Interlab Zelllinien-Kollektion (Genua, Italien)</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Adulte Maus-Hypothalamus-Zelllinie mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Neomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Silber-Nanopartikel (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Reagenz für die Zellviabilität</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Maus TNF- &alpha; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W optische Bodenplatte, schwarzes Polystyrol, mit Zellkultur behandelt, mit Deckel, steril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10 Membran</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml konische Zentrifuge Schläuche</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Siebe 70 &mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroglia als surrogate biosensor nanoparticle neurotoxicity zu ermitteln

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanopartikel, die in Luftschadstoffen gefunden werden, können Neurotransmitterprofile verändern, Neuroinflammation verstärken und die Gehirnfunktion verändern. Daher wird der hier beschriebene Assay dazu beitragen, die Rolle von Mikroglia bei Neuroinflammation und neurodegenerativen Erkrankungen aufzuklären. Die Verwendung von Mikroglia, residenten Immunzellen des Gehirns, als Ersatz-Biosensor bietet neue Einblicke in die Art und Weise, wie Entzündungsreaktionen neuronale Beleidigungen vermitteln. Hier verwenden wir eine immortalisierte murine Mikrogliazelllinie, die als BV2 bezeichnet wird, und beschreiben eine Methode zur Nanopartikel-Exposition, bei der Silbernanopartikel (AgNPs) als Standard verwendet werden. Wir beschreiben, wie Mikroglia Nanopartikeln ausgesetzt werden, wie Nanopartikel aus dem Überstand entfernt werden und wie man Überstände aus aktivierten Mikroglia verwendet, um die Toxizität zu bestimmen, wobei das Überleben der Hypothalamuszellen als Maß verwendet wird. Nach AgNP-Exposition wurde die BV2-Mikrogliaaktivierung mit einem Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Enzymimmunosorbent-Assay (ELISA) validiert. Der Überstand wurde filtriert, um das AgNP zu entfernen und Zytokine und andere sezernierte Faktoren in den konditionierten Medien verbleiben zu lassen. Die Hypothalamuszellen wurden dann einem Überstand von AgNP-aktivierten Mikroglia ausgesetzt und das Überleben der Neuronen wurde mit einem Resazurin-basierten Fluoreszenzassay bestimmt. Diese Technik ist nützlich, um Mikroglia als Surrogat-Biomarker für Neuroinflammation zu verwenden und die Wirkung von Neuroinflammation auf andere Zelltypen zu bestimmen.

Wir zeigen, dass Mikroglia Funktion als Surrogat Biosensor für Gehirn Reaktion auf Nanopartikel das Protokoll oben. Die Ergebnisse umfassen die Messung der toxischen Wirkungen von Mikroglia - Aktivierung auf nachgeschaltete neuronalem Zelltod. 1 ein Arbeitsablauf des Protokolls Mikroglia zu aktivieren und zu bestimmen , ob sekretierten Zytokine reduzieren Lebensfähigkeit von hypothalamischen Neuronen demonstriert. TNF-α - Sekretion wurde nach AgNP Exposition (Abb...

Mikroglia (Immunzellen des Gehirns), werden als Ersatz-Biosensor verwendet, um zu bestimmen, wie Nanopartikel die Neurotoxizität beeinflussen. Wir beschreiben eine Reihe von Experimenten, die darauf ausgelegt sind, die Reaktion von Mikroglia auf Nanopartikel und die Exposition von hypothalamischen Neuronen gegenüber Überständen aus aktivierten Mikroglia zu testen, um die Neurotoxizität zu bestimmen.

Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen in-vitro-Ersatzbiosensor zur Untersuchung der Reaktion von Mikroglia auf Nanopartikel zu beschreiben. Anschließend werden wir die Neurotoxizität nach Exposition gegenüber konditioniertem Medium von mit Nanopartikeln stimulierten Mikroglia bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise wie Nanopartikel systematisch auf Neurotoxizität geprüft werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass unser Modell die Möglichkeit bietet, Mikroglia direkt zu aktivieren und zu bestimmen, ob sekretorische Faktoren neurotoxisch wirken, ohne aufwändige Langzeitstudien an Nagetieren durchführen zu müssen. Obwohl diese Methode Einblicke in die mikroglia-vermittelte Zellsterblichkeit nach Exposition gegenüber Mikropartikeln ermöglicht, kann sie auch auf andere Modelle neurodegenerativer Erkrankungen im Zusammenhang mit der Prüfung potenziell neurotoxischer Umweltschadstoffe angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit dem Schritt der Filtration des konditionierten Mediums. Da sich die Filtrationsleistung je nach Größe, Form und Konzentration der Nanopartikel unterscheiden kann. Zum Vorbereiten das DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% PSN, auf 37 Grad Celsius erwärmen.Dann gefrorene BV2-Mikrogliazellen, die aus den Passagen 18–25 stammen, entnehmen und sie rasch bei 37 Grad Celsius auftauen. Anschließend die aufgetauten Zellen vorsichtig in einen belüfteten 75 cm²-Flasche mit 10 Milliliter Medium überführen und die Flasche inkubieren. Nach 24 Stunden das Medium erneuern und die Zellen weiterkultivieren, bis sie eine Konfluenz von 70–80 % erreichen. Zu diesem Zeitpunkt das Medium abpipettieren und 500 Mikroliter warme 1×-Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen.Nachdem der Kolben noch einige Minuten inkubiert wurde, sammeln Sie die Zellen mit einem Abstreifer in 5 Milliliter warmes DMEM. Anschließend filtrieren Sie die Zellen aus dem Kolben durch einen 70-Mikron-Filter. Wiederholen Sie diese Filtration dreimal mit demselben Filter und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Nach der Filtration die Zellen zählen und dann eine Platte mit schwarzen Wänden und klarem Boden mit 8000 Zellen pro Vertiefung in 200 Mikrolitern ergänztem DMEM besiedeln. Nach 24-stündiger Inkubation das Medium in den Vertiefungen durch serumfreies DMEM ersetzen, um die Mikroglia zu entziehen. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation fortfahren, um die Mikroglia zu aktivieren.Verdünnen Sie dazu zunächst Silbernanopartikel in DMEM ohne Serum auf die gewünschte Arbeitskonzentration. Ersetzen Sie dann 100 Mikroliter Medium durch die Behandlungslösung. Stellen Sie sicher, dass eine negative Kontrolle mit der verdünnten Fahrzeuglösung ohne Nanopartikel eingeschlossen wird.Führen Sie nun die Inkubation 24 Stunden lang weiter durch und fahren Sie mit der Analyse fort. Sammeln Sie zunächst 200 Mikroliter Überstandmedium aus jedem Plattenwell und geben Sie es auf einen Filter, der die Nanopartikel entfernt, und platzieren Sie diesen über ein Mikrozentrifugenröhrchen. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Filtration der Nanopartikel deren Größe, Form und Konzentration einen Einfluss auf die Fusionswirksamkeit haben.Daher empfiehlt es sich, die Filtration vorab zu testen. Zentrifugieren Sie nun die Röhrchen 15 Minuten bei 14000g und Raumtemperatur. Entsorgen Sie anschließend den Durchlauf, der die Nanopartikel enthält, und setzen Sie die Filter umgedreht in neue Sammelröhrchen.Zentrifugieren Sie die Filter umgedreht bei 1000&nbsp;g für zwei Minuten, um das konzentrierte konditionierte Medium mit Zytokinen zu sammeln. Anschließend erhöhen Sie das Sammelvolumen mit frisch hergestelltem supplementiertem DMEM auf 400&nbsp;Mikroliter und lagern die Röhrchen auf Eis. Um sicherzustellen, dass restliche Schwefelnanopartikel aus dem filtrierten Medium entfernt wurden, bereiten Sie unfiltrierte Nanopartikelstandards in einem Konzentrationsbereich von einer Leerprobe bis 0,2&nbsp;Mikrogramm pro Milliliter in serumfreiem DMEM vor.Anschließend Portionen von je 50 Milliliter der filtrierten Proben und jedes Standards in eine schwarz-wandige Platte mit klarem Boden abfüllen und die Absorption im Bereich von 390 bis 410 Nanometern messen. Um die Konzentration von TNF-alpha in den Proben zu bestimmen, verwenden Sie die Hälfte des verbleibenden Probenvolumens in einem im Handel erhältlichen Kit. Für diesen Assay Hypothalamuszellen aus gefrorenen Beständen heranziehen.Unter Verwendung der gleichen Methoden, die für die Einrichtung von Mikrogliazellkulturen beschrieben wurden. Verwenden Sie diese letztendlich, um schwarze Platten mit klarem Boden mit 5000 Zellen pro Vertiefung in 200 µL supplementiertem DMEM zu besiedeln. Nach 24-stündiger Kultivierung entfernen Sie 100 µL Medium und ersetzen es durch 100 µL gefiltertes und konzentriertes Medium, das aus den aktivierten Mikrogliazellkulturen gewonnen wurde, und inkubieren die Platte anschließend 24 Stunden unter Standardbedingungen.Am nächsten Tag 22 Mikroliter Resazurin-Reagenz zu jedem Well hinzufügen und die Inkubation 20 Minuten lang fortsetzen. Anschließend mit einem Multimode-Spektrophotometer eine Fluoreszenzmessung durchführen, um die Zellviabilität in relativen Fluoreszenzeinheiten zu bestimmen. Mit dem beschriebenen Protokoll kann die Mikroglia-Funktion als Ersatz-Biosensor für die Reaktion des Gehirns auf Nanopartikel verwendet werden.Die Sekretion von TNF-alfa durch Mikroglia war nach Exposition gegenüber Silber-Nanopartikeln signifikant erhöht. Bei Exposition hypothalamischer Neuronen gegenüber konditioniertem Medium von durch Silber-Nanopartikel aktivierte Mikroglia war die Vitalität der Neuronen signifikant verringert. Im Prinzip aktivierten die Silber-Nanopartikel die Mikroglia in einen M1-proinflammatorischen Zustand.Dann tragen die freigesetzten proinflammatorischen Zytokine zum Zelltod der umliegenden Zellen bei. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Mikroglia als Ersatz-Biosensor zur Überprüfung der Reaktion auf Nanopartikel und ob diese Reaktion neurotoxisch ist, verwendet werden können. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in drei oder vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Mit dieser Methode können weitere Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise die Profilierung anderer sezernierter Zytokine nach Aktivierung von Mikroglia, um die Aktivierungszustände der Mikroglia zu charakterisieren.

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Registrierte Bioimaging von Nanomaterialien für Diagnostische und Therapeutische Überwachung

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Dieses Video demonstriert eine Methode zur Bewertung der neurotoxischen Wirkungen von Nanopartikeln anhand von Mikroglia. Es werden die Schritte zur Aktivierung von Mikroglia mit Nanopartikeln, zum Filtern konditionierter Medien zur Isolierung von Mikroglia-abgeleiteten proinflammatorischen Zytokinen und zum Testen der Toxizität von hypothalamischen Neuronen mit den konditionierten Medien beschrieben.

Bestimmung der Nanopartikel-induzierten Toxizität in Neuronen unter Verwendung von Mikroglia als Surrogat-Biosensor

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Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

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Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

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Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

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Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

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