Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen in vitro Surrogat-Biosensor zum Testen der Reaktion von Mikroglia auf Nanopartikel zu beschreiben. Wir werden dann die Neurotoxizität nach Exposition gegenüber konditionierten Medien von Mikroglia bestimmen, die mit Nanopartikeln stimuliert wurden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie aktiv Nanopartikel auf Neurotoxizität untersucht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass unser Modell die Möglichkeit bietet, Mikroglia direkt zu aktivieren und zu bestimmen, ob es sich bei sezernierenden Faktoren um Neurotoxine handelt, ohne dass teure Langzeitstudien an Nagetieren durchgeführt werden müssen. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über den durch Mikroglia induzierten Zelltod nach Mikropartikel-Exposition geben. Es kann auch auf andere Modelle neurodegenerativer Erkrankungen im Rahmen der Prüfung potenzieller neurotoxischer Umweltschadstoffe angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, mit dem Schritt der Filtration von Zustandsmedien zu kämpfen haben. Denn die Filtrationseffizienz kann je nach Größe, Form und Konzentration der Nanopartikel unterschiedlich sein. Zur Vorbereitung das DMEM mit 10%FBS und 1%PSN auf 37 Grad Celsius erwärmen.

Nehmen Sie dann gefrorene BV2-Mikrogliazellen aus den Passagen 18 bis 25 und tauen Sie sie schnell bei 37 Grad Celsius auf. Anschließend werden die aufgetauten Zellen vorsichtig in einen 75 Quadratzentimeter großen, belüfteten Kolben mit 10 Millilitern Medium überführt und den Kolben inkubiert. Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Medium und züchten Sie die Zellen weiter, bis sie eine Konfluenz von 70-80% erreichen. Zu diesem Zeitpunkt aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 500 Mikroliter warme 1 ex Trypsin-EDTA-Lösung hinzu.

Nachdem Sie den Kolben noch einige Minuten inkubieren gelassen haben, werden die Zellen mit einem Schaber in 5 Milliliter warmes DMEM aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen mit einem 70-Mikron-Sieb aus dem Kolben filtriert. Wiederholen Sie diese Filtration dreimal mit demselben Sieb und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Nach dem Filtrieren werden die Zellen gezählt und dann eine schwarzwandige, durchsichtige Bodenplatte mit 8000 Zellen pro Vertiefung in 200 Mikroliter supplementiertem DMEM ausgesät. Ersetzen Sie nach 24 Stunden Inkubation das Medium in den Vertiefungen durch serumfreies DMEM, um die Mikroglia auszuhungern. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation fahren Sie mit der Aktivierung der Mikroglia fort.

Dazu verdünnen Sie zunächst Silbernanopartikel in serumfreiem DMEM auf die gewünschte Arbeitskonzentration. Ersetzen Sie dann 100 Mikroliter Medium durch die Behandlungsmasse. Achten Sie darauf, eine Negativkontrolle der verdünnten Fahrzeuglösung ohne die Nanopartikel einzuschließen.

Setzen Sie nun die Inkubation für 24 Stunden fort und fahren Sie mit der Analyse fort. Zu Beginn werden 200 Mikroliter überstehendes Medium aus jeder Plattenvertiefung gesammelt und auf einen Filter geladen, der die Nanopartikel entfernt, die über ein Mikrozentrifugenröhrchen gelegt werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass bei der Filterung der Nanopartikel ihre Größe, Form und Konzentration ein Faktor für die Fusionseffizienz sind.

Es empfiehlt sich also, die Filtration vorher zu testen. Schleudere nun die Tuben bei 14000g bei Raumtemperatur für 15 Minuten herunter. Entsorgen Sie dann den Durchfluss, der die Nanopartikel enthält, und legen Sie die Filter kopfüber in neue Auffangröhrchen.

Drehen Sie die Filter zwei Minuten lang bei 1000 g auf den Kopf, um konzentriertes konditioniertes Medium mit Zytokinen zu sammeln. Erhöhen Sie anschließend das Volumen der Sammlung auf 400 Mikroliter mit frisch hergestelltem zusätzlichem DMEM und lagern Sie die Röhrchen auf Eis. Um sicherzustellen, dass schwefelrestliche Nanopartikel aus gefilterten Medien entfernt werden, bereiten Sie ungefilterte Nanopartikelstandards in einem Konzentrationsbereich von Blindwert bis 0,2 Mikrogramm pro Milliliter in serumfreiem DMEM vor.

Anschließend aliquotieren Sie 50 Milliliter der gefilterten Proben und jedes Standards in eine durchsichtige Bodenplatte mit schwarzen Wänden und messen die Absorption von 390 bis 410 Nanometern. Um die Konzentration von TNF-alpha in den Proben zu messen, verwenden Sie die Hälfte des verbleibenden Volumens in einem kommerziell erhältlichen Kit. Für diesen Assay werden hypothalamische Zellen aus gefrorenen Beständen hergestellt.

Unter Verwendung der gleichen Methoden, die für die Etablierung von Mikrogliakulturen beschrieben wurden. Verwenden Sie sie schließlich, um schwarzwandige, durchsichtige Bodenplatten mit 5000 Zellen pro Vertiefung in 200 Mikroliter supplementiertes DMEM zu säen. Entfernen Sie nach 24 Stunden Kultivierung 100 Mikroliter Medium und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter gefiltertes und konzentriertes Medium, das aus den aktivierten Mikroglia-Zellkulturen gesammelt wurde, und inkubieren Sie die Platte dann 24 Stunden lang unter Standardbedingungen.

Geben Sie am nächsten Tag 22 Mikroliter Resazurin-Reagenz in jede Vertiefung und setzen Sie die Inkubation für 20 Minuten fort. Nehmen Sie dann mit einem Multimode-Spektralphotometer eine Floreszenzmessung vor, um die Lebensfähigkeit der Zellen in relativen Fluoreszenzeinheiten abzuschätzen. Mit dem skizzierten Protokoll kann die Mikroglia-Funktion als Ersatz-Biosensor für die Reaktion des Gehirns auf Nanopartikel verwendet werden.

Die TNF-alfa-Sekretion durch Mikroglia war nach Exposition mit Silber-Nanopartikeln signifikant erhöht. Wenn hypothalamische Neuronen konditioniertem Medium aus den durch Silbernanopartikel aktivierten Mikroglia ausgesetzt wurden, war die Lebensfähigkeit der Neuronen signifikant reduziert. Im Prinzip aktivierte die Exposition gegenüber den Silbernanopartikeln die Mikroglia in einen proinflammatorischen M1-Zustand.

Dann tragen die freigesetzten entzündungsfördernden Zytokine zum umgebenden Zelltod bei. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Mikroglia als Ersatz-Biosensor verwendet werden können, um die Reaktion auf Nanopartikel zu testen, und ob diese Reaktion neurotoxisch ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei oder vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Profilierung anderer sezernierter Zytokine nach der Aktivierung von Mikroglia, durchgeführt werden, um die Aktivierungszustände der Mikroglia zu phänotypisieren.