Name: Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester Drosophila Oozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Oozyten für die zytologische Untersuchung der Spindelbildung und Chromosomenorientierung während der Meiose I. Diese Methode ermöglicht Immunfluoreszenz-Imaging zur Analyse bipolarer Spindeln.

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Wir danken Christian Lehner für die Bereitstellung des CENP-C-Antikörpers und Eric Joyce für Empfehlungen zu FISH. Die Arbeit im McKim-Labor wurde durch einen Zuschuss des NIH (GM101955) finanziert.

Anmerkung: Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden Temperaturen für das Fliegenzucht zu halten und Kreuze, sofern nicht anders vermerkt. 1. Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie Flies. <ol><li> Oozyten Sammlungen Prometaphase angereicherte. <ol><li> Klar erwachsenen Fliegen von gesunden, jungen Aktien oder Quer Kulturen. Alter Flaschen für zwei Tage bei 25 ° C. HINWEIS: In der Regel zwei gesunde Flaschen genügt, wenn auch für einige Quer Kulturen benötigt werden. </li><li> Nach zwei Tagen sammeln ~ 100 bis 300 Frauen (die zu diesem Zeitpunkt 0 bis 2 Tage alt sind) aus den Flaschen. Die Weibchen müssen nicht Jungfrauen zu sein. Fügen Sie einen Klecks Hefe-Paste auf die Seite eines Fläschchens und legen 30 Frauen und 10 bis 15 Männer jeweils in die yeasted Fläschchen. Alter Phiolen für zwei Tage bei 25 ° C. </li></ol></li><li> Metaphase angereicherte Oozyten Kollektionen. <ol><li> Sammeln Sie ~ 100 bis 300 Frauen ab Lager oder Quer cultures. Fügen Sie einen Klecks Hefe-Paste auf die Seite eines Fläschchens und legen 30 Frauen jeweils (ohne Männchen hinzugefügt) in die yeasted Fläschchen. Alter Phiolen für drei bis fünf Tage bei 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Sie Lösungen. Hinweis: Die Lösungen werden bei Raumtemperatur unbegrenzt gelagert, wenn nicht anders angegeben. <ol><li> Prepare Modifizierte Robb-Puffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM Sucrose, 275 mM Natriumacetat, 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Glucose, 6 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Calciumchlorid. Verwenden 10 N 11: 8 Natriumhydroxid: Kaliumhydroxid pH auf 7,4 zu bringen. Sterilisieren durch Filtration; nicht im Autoklaven. Lagerung bei -20 ° C. nach Bedarf auftauen ~ 200 ml 1x Robb prep pro Eizelle vorzubereiten. </li><li> Fixation Solutions. <ol><li> Option # 1: Vorbereiten Formaldehyd / Heptan-Fixierung. Vorbereitung Fixation Buffer: 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) plus 150 mM Saccharose. Verwenden zu können, machen frisch mit 687,5 ul Fixation Buffer und 312,5 ul 16% Formaldehydpro Eizelle prep. ACHTUNG: Handschuhe tragen bei der Verwendung von Formaldehydlösungen in einem Abzug. Entsorgen von Abfällen gemäß gültiger Richtlinien. </li><li> Option # 2: Vorbereiten Formaldehyd / Cacodylat Fixierung. Vorbereitung Fix Mix: 250 mM Sucrose, 100 mM Kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM Natriumacetat (pH 7,0) und 25 mM EGTA (pH 8,0). Zur Verwendung machen frisch mit 400 ul Fix-Mix, 100 ul Kaliumcacodylat (1 M, pH 7,2) und 500 &amp; mgr; l 16% Formaldehyd pro Eizelle prep. ACHTUNG: Kaliumcacodylat enthält Arsen. </li></ol></li><li> Bereiten PBS / Triton X-100: 1x PBS plus 1% oder 0,05% Triton X-100. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten PBS-Tween 20-Rinderserumalbumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v) und 0,1% Tween-20. Kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Lösungen. <ol><li> Bereiten 20X Natriumchlorid-Natriumcitrat (SSC): 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat. </li><li> Bereiten 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Machen Sie frische, ~ 20 ml pro Eizelle prep. </li><li> Bereiten Formamid-Lösungen: 2 x SSC, 0,1% Tween-20, sowie Formamid. Machen Sie frische, 1 ml 20% Formamid, 0,5 ml 40% Formamid und 2 ml 50% Formamid pro Eizelle prep. ACHTUNG: Handschuhe tragen, während Formamid Lösungen in einem Abzug mit. Entsorgen von Abfällen gemäß gültiger Richtlinien. </li><li> Bereiten Hybridisierungslösung: 2x SSC, 50% Formamid und 10% Dextransulfat (w / v). Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> FISH-Sonden. <ol><li> Bestellen Oligonukleotide (Tabelle 1 für Sequenzen sehen) mit HPLC - Reinigung und Wunsch 5 &#39;fluoreszierende Modifikation (zB Cy3 oder Cy5). Resuspendieren in Tris-EDTA (TE) bei 50 ng / &amp; mgr; l. Hinweis: Schützen Sie Oligos von Lichtexposition zu allen Zeiten. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sammlung der Late-Stage Drosophila Oozyten <ol><li> Wie <em&gt; Drosophila Oozyten mit Membranen intakt haften auf Kunststoff und Glas, Pre-Beschichtung der Innenseite einer 5 - ml - Röhrchen und einer Pasteur - Pipette pro Eizelle prep mit PTB. </li><li> Anesthetize alle ~ 100 bis 300 yeasted Fliegen mit Kohlendioxid und fügen Sie in einen Mischer enthält ~ 100 ml 1x Robb Buffer. Pulse dreimal (~ 1 Sekunde pro Stück). Halten Sie Eizellen in Robb für &lt;20 min Aktivierung zu vermeiden. HINWEIS: Alternativ Eizellen von Frauen von Hand präpariert werden können. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es weniger Weibchen erfordert. Allerdings ist darauf zu Exposition gegenüber Kohlendioxid nur wenige Minuten in Anspruch zu nehmen Artefakte mit Hypoxie assoziiert 7 zu vermeiden. </li><li> Filter durch große Netz (~ 1500 &amp; mgr; m) in 250-ml-Becher große Körperteile zu entfernen. Wenn viele intakte abdomens bleiben auf Mesh, Nachschliff Material zusätzliche Robb Puffer und Filter wieder. Lassen Sie siedeln ~ 2 min, dann obere Schicht absaugen, da viele der großen Körperteile wie möglich zu entfernen. </li><li> Filter durch kleine Maschen (~ 300 &amp; mgr; m) in einen 250-ml-Becher. Spülen restlichen Eizellen aus den ersten Becher mit zusätzlichen Robb und beschichteten Pasteur-Pipette. Lassen Sie settle ~ 3 min; Eizellen werden absetzen. Aspirieren aber ~ 10 ml ab. </li><li> Gießen Sie so viel von den 10 ml wie in beschichteten 5-ml-Röhrchen passen. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, und wiederholen Sie mit Rest. Spülen restlichen Eizellen aus Becherglas mit zusätzlichen Robb und beschichteten Pasteur-Pipette. Lassen Sie siedeln in 5-ml-Tube für ~ 3-5 min. </li></ol> 3. Behandlungen mit Arzneimitteln (Optional) <ol><li> Mantel ein zweites 5-ml-Röhrchen mit PTB für jede Eizelle prep. Hinzufügen geeigneten Lösungsmittel (Kontrolle) oder Arzneimittel zu 1 ml Robbs jeweils für jede Oocyte prep (Tabelle 2). </li><li> Split Eizellen in die zweite beschichtete 5-ml-Tube. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit und 1 ml Robb plus Lösungsmittel in ein Röhrchen und 1 ml Robb plus Medikament in die zweite Röhre. Nutation für entsprechende Menge an Zeit für die Arzneimittelbehandlung (Tabelle 2). Let begleichen. </li></ol> 4. Fixation <ol><li> Absaugen alle Flüssigkeit und fügen sofort 1 ml Fix. </li><li> Option 1: Formaldehyd / Heptan Fixation (Fixation Buffer plus 5% Formaldehyd). <ol><li> Fix für 2,5 min auf einer Nutator. 1 ml Heptan und Wirbel 1 min. Lassen Sie settle ~ 1 min. </li><li> Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und fügen Sie dann 1 ml 1x PBS. Vortex 30 Sekunden. Lassen Sie settle ~ 1 min. </li><li> Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und dann füllen Rohr mit 1x PBS. HINWEIS: Die Oocyten können sofort oder gehalten auf der Nutator mehrere Stunden bei Raumtemperatur verwendet werden. </li></ol></li><li> Option 2: Formaldehyd / Cacodylat Fixierung (Fix Mix plus 8% Formaldehyd und 100 mM Cacodylat). <ol><li> Fix für 6 min auf einem Nutator. Lassen Sie 2 Minuten absetzen. Entfernen Sie Flüssigkeit, und dann füllen Rohr mit 1x PBS. HINWEIS: Die Oocyten können sofort oder gehalten auf der Nutator mehrere Stunden bei Raumtemperatur verwendet werden. </li></ol></li></ol> 5. Die Membranen Entfernen ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Mit beschichteten Pasteur-Pipette, fügen ~ 500 bis 1.000 Eizellen zur mattiert (sandgestrahlte) Teil eines Glasträger. Entfernen Sie alle Körperteile und Fremdmaterial mit einer Pinzette. Lassen Sie sich nicht Eizellen austrocknen; 1x PBS bei Bedarf hinzufügen. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Eizellen und sanft &quot;rollen&quot; Eizellen, bis alle Membranen werden entfernt (Ziehen der Kante des Deckglases über die Eizellen am besten funktioniert.) Überprüfen Sie regelmäßig die Fortschritte unter dem Mikroskop, das Hinzufügen von mehr 1x PBS wie nötig. Achten Sie darauf, wie zu viel Druck wird die Eizellen zerstören. HINWEIS: Nur für Immunofluoreszenz mit 6. Schritt weiter für Fische (mit oder ohne Immun), fahren Sie mit Schritt 7. </li></ol> 6. Antikörper - Färbung von Drosophila Oozyten <ol><li> Extraktion und Blockierung <ol><li> Spülen gewalzten Oozyten in ein 15 ml konisches Röhrchen mit ~ 15 ml PBS / 1% Triton X-100. Nutation Oozyten in dieser Lösung nicht weniger als 1,5 Stunden und nicht mehr als 2 Stunden.Dieser Schritt ermöglicht Antikörper Penetration. </li><li> Lassen Sie Eizellen absetzen ~ 2 min. Entfernen Flüssigkeit zusammen mit so vielen Membranen wie möglich, dann fügen PBS / 0,05% Triton X-100. HINWEIS: Die Membranen werden siedeln langsamer als gerollt Eizellen. </li><li> Lassen Eizellen absetzen ~ 2 min, dann entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml Flüssigkeit. Transfer-Oozyten abgestuft bis 1,5-ml-Röhrchen und restliche Flüssigkeit zu entfernen. 1 ml der PTB für die Sperrung und Nutation für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Antikörper-Färbung <ol><li> Pre-Absorption von sekundären Antikörpern gegen Embryonen. HINWEIS: Dieser Schritt eliminiert Hintergrundfärbung von nicht-spezifischen Antikörper - Wechselwirkungen mit Drosophila - Proteine. <ol><li> Sammeln und beheben Drosophila - Embryos (~ 25 &amp; mgr; l) pro typisches Verfahren 8. Speichern in Methanol bei -20 ° C. </li><li> Entfernen von Methanol aus Embryonen, fügen Sie 800 ul Methanol plus 200 ul 1x PBS und Nutation für 15 min. Entfernen Sie 500 ul Überstand und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Dann nutiert für 15 min. Wiederholen Sie zweimal (für insgesamt ca. 1 Stunde von Waschungen) und dann in der PTB zu beenden. HINWEIS: Die Embryonen verwendet werden können, sofort oder auf der Nutator für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gehalten. </li><li> Entfernen Sie Flüssigkeit füllen mit PTB bis 200 &amp; mgr; l pro Eizelle prep, und fügen Sie fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper in geeigneten Verdünnungen (wenn man bedenkt, dass das endgültige Volumen von 300 &amp; mgr; l wird, vgl. Schritt 7.4) Nutation bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden. HINWEIS: Die vorge absorbierte Antikörper werden in Schritt 6.2.4 verwendet werden. HINWEIS: Bewahren Sie Proben im Dunkeln, so viel wie möglich, sobald fluoreszierende Antikörper hinzugefügt wurden. </li></ol></li><li> Entfernen von Flüssigkeit aus Oozyten, füllen mit PTB bis 300 &amp; mgr; l, und fügen Sie primären Antikörper bei geeigneten Verdünnungen. Nutiert bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden. </li><li> Wasch Oozyten viermal für jeweils 15 min mit 1 ml PTB. </li><li> EntfernenFlüssigkeit aus Oozyten wurden 200 ul Überstand von Embryonen (vorabsorbiert Sekundärantikörper) hinzuzufügen. Dann füllen sich mit PTB bis 300 &amp; mgr; l. über Nacht nutiert für 3 bis 4 h (bevorzugt) oder bei 4 ° C bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie Eizellen einmal für 15 Minuten mit 1 ml PTB, entfernen Flüssigkeit. Dann fügen 0,5 ul Hoechst 33342 und 500 ul PTB und Nutation für 7 min. </li><li> Waschen Oozyten zweimal für jeweils 15 min mit 1 ml PTB. HINWEIS: Die Oocyten können unmittelbar an einem Schlitten montiert werden, oder kann für die Bildgebung in PTB bei 4 ° C bis bereit gespeichert werden. </li></ol></li></ol> 7. FISH (weiter von Schritt 5 oben) <ol><li> Spülen Sie rollte Eizellen in eine 15 ml konischen Röhrchen mit ~ 15 ml 2x SSCT-. Lassen Sie Eizellen absetzen ~ 2 min. Entfernen Sie alle ~ 0,5 ml Flüssigkeit zusammen mit so vielen Membranen wie möglich. HINWEIS: Die Membranen werden siedeln langsamer als gerollt Eizellen. </li><li> Transfer-Oozyten bis 0,5-ml-Röhrchen und entfernen restliche Flüssigkeit. Nacheinander hinzufügen und 500 ul entfernen20%, 40% und 50% Formamid-Lösungen, Taumel für 10 min in jeder Lösung. HINWEIS: Die Oozyten werden mit einem höheren Prozentsatz an Formamid langsamer absetzen. </li><li> Entfernen Sie Flüssigkeit, fügen Sie dann 500 ul 50% Formamid-Lösung und Nutation bei 37 ° C für 1 bis 5 Stunden. HINWEIS: Längere Inkubationen führen zu einer besseren Sonde Penetration. </li><li> Entfernen Flüssigkeit und hinterlässt nicht mehr als ~ 100 &amp; mgr; l - Oozyten und fügen 36 ul Hybridisierungslösung plus 2 &amp; mgr; l Sonde (50 ng / ul) und 2 ul Wasser oder 2 &amp; mgr; l einer 2 nd Sonde (Tabelle 1). </li><li> bei 91 ° C inkubieren 3 min (FISH only) oder 80 ° C für 20 min (FISH und Immunofluoreszenz), gefolgt von einer Inkubation über Nacht in einem Wasserbad 37 ° C. Hinweis: diese Schritte in einem Thermocycler durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie nicht flüssig. Hinzufügen 500 ul 50% Formamid-Lösung und nutiert bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, 500 &amp; mgr; l 50% Formamid-Lösung eind nutiert bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, 500 &amp; mgr; l 20% Formamid-Lösung und Nutation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Führen Sie drei schnelle Waschungen in 500 ul 2x SSCT- (lassen, Entfernen dann Flüssigkeit hinzufügen, kehren mehrmals wiederholen.) Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, dann fügen Sie 500 ul PTB und Nutation für 4 Stunden. </li></ol> 8. Antikörper-Färbung nach FISH <ol><li> Entfernen von Flüssigkeit aus Oozyten, füllen mit PTB bis 300 &amp; mgr; l, und dann werden 10 &amp; mgr; l anti-α-Tubulin-Antikörper an FITC konjugiert. Alternativ können auch andere Antikörper verwendet werden, nach oben Protokoll. über Nacht bei Raumtemperatur Nutation. </li><li> Waschen Sie Eizellen einmal für 15 Minuten mit 500 ul PTB, entfernen Flüssigkeit, dann fügen 0,5 ul Hoechst 33342 und 500 ul PTB und Nutation für 7 min. </li><li> Waschen Oozyten zweimal für 15 min mit jeweils 500 ul PTB. HINWEIS: Die Oocyten können unmittelbar an einem Schlitten montiert werden, oder sie können für in PTB bei 4 ° C bis bereit gespeichert werdenBildgebung. Halten Sie Eizellen im Dunkeln, so viel wie möglich, sobald fluoreszierende Antikörper hinzugefügt wurden. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Wiederholen Sie Namen </td><td fo:width="1in"> Chromosom </td><td> Oligo Sequenz * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeca </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1,686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 - Sequenz von Eric Joyce, persönliche Kommunikation, andere Sequenzen von Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabelle 1: FISH - Sonden für Drosophila zentromerischen wiederholt. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droge </td><td> Lösungsmittel </td><td> Auf Konzentration </td><td> Die Endkonzentration </td><td> Behandlungszeit </td><td> Bewirken </td></tr><tr><td> Colchicin </td><td> Ethanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 &amp; mgr; M </td><td> 10 min oder 30 min </td><td> destabilisieren nicht kinetochore (10 min) 9 oder alle (30 min) Mikrotubuli </td></tr><tr><td> Paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 &amp; mgr; M </td><td> 10 Minuten </td><td> stabilisieren microtubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 &amp; mgr; M </td><td> 20 Minuten </td><td> hemmen Aurora B - Kinase 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Die medikamentöse Behandlung.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Staging Drosophila Oozyten Obwohl ein längliches karyosome oft in der Prometaphase Oocyten gesehen wird, karyosome Form unter Verwendung von Metaphase Prometaphase Oozyten unterscheiden kann problematisch sein. Während Prometaphase beginnt die karyosome als eine runde Form, längt, und zieht dann in eine runde Form wie die Eizelle die Verhaftung Metaphase nähert. Dies bedeutet, dass viele der Prometaphase Oozyten keine längliche karyosome haben. Darüber hinaus, wenn ...

Das Studium der Meiose wird manchmal als die "Genetik der Genetik" bezeichnet. Dies liegt daran, dass die grundlegenden Eigenschaften der Chromosomenvererbung und des unabhängigen Sortiments durch die Segregation der Chromosomen während der Gametenproduktion erreicht werden. Ein wichtiger Beweis für die Chromosomentheorie der Vererbung kam 1916 durch die Arbeit von Calvin Bridges an Drosophila melanogaster1. Diese und andere klassische genetische Studien an Drosophila trugen wesentlich zu unserem Verständnis der Genetik bei. Die zytologische Untersuchung der meiotischen Chromosomen in Drosophila-Eizellen war jedoch eine Herausforderung. Dies liegt vor allem daran, dass die Immunfluoreszenz von Drosophila-Eizellen im Spätstadium, wenn sich die Spindel zusammensetzt und die Chromosomen für die Segregation ausgerichtet sind, durch das Vorhandensein von Membranen behindert wird, die die Eizelle für Antikörper undurchdringlich machen.
Trotz dieser Herausforderung bleiben Drosophila-Eizellen ein attraktives Modell für die Untersuchung des Chromosomenverhaltens und der Spindelassemblierung. Das liegt an den leistungsfähigen genetischen Werkzeugen, die in Drosophila zur Verfügung stehen, aber auch daran, dass die Eizellen in der Metaphase I verharren, wenn die Chromosomen ausgerichtet sind und die Spindel vollständig ausgebildet ist. Dies erleichtert die Entnahme und Untersuchung einer großen Anzahl von Eizellen in dieser wichtigen Phase der Zellteilung. Darüber hinaus kann ein einfacher Modellorganismus, der für genetische Manipulationen zur Untersuchung der Chromosomentrennung von Eizellen zugänglich ist, einen wichtigen Beitrag zu unserem Verständnis der menschlichen reproduktiven Gesundheit leisten. Fehler in der Chromosomenzahl sind die häufigste genetische Ursache für Fehlgeburten und Geburtsfehler beim Menschen2. Ein Großteil dieser Fehler kann auf die Eizelle zurückgeführt werden und korreliert mit zunehmendem Alter der Mutter. Das Durchschnittsalter der Mütter in den USA ist gestiegen, was dies zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit macht.
Wir beschreiben hier Methoden zur zytologischen Untersuchung von Drosophila-Eizellen, einschließlich einer Demonstration, wie die Eizellmembranen entfernt werden. Diese Methoden sind Modifikationen von Protokollen, die zuerst von Theurkauf und Hawley3, Zou et al. beschrieben wurden.4 und Dernburg et al.5. Wir schließen auch Methoden zur Anreicherung verschiedener Stadien von Eizellen ein, die auf einem Protokoll basieren, das zuerst von Gilliland et al. beschrieben wurde.6. Urheberrecht Schließlich fügen wir Anweisungen für die medikamentöse Behandlung von Drosophila-Eizellen hinzu. Zusammen ermöglichen diese Methoden die zytologische Untersuchung der Chromosomensegregation und des Spindelassemblierens von Eizellen in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>GEFÄHRLICH; nach dem Öffnen nach einem Monat entsorgen</td></tr><tr><td>250 ml Becher</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aktive Trockenhefe</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>mit Wasser mischen, um eine Paste herzustellen die Konsistenz von Erdnussbutter</td></tr><tr><td>Anti-&Alpha;-Tubulin Antikörper konjugiert an FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>Klon DM1A</td></tr><tr><td>Binuclein 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>Mixer</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid Verschiedenes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colchicin</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Nr. 1 1/2</td></tr><tr><td>Dextransulfat Verschiedenes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont Pinzette High Precision Grade Style 5</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>graduierte 1,5 ml Röhrchen</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>bei verschiedenen Anbietern erhältlich</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>großmaschiges (~1.500 &Mikro; m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>Vielzahl von Formaten und anderen Lieferanten, 12 oder 14 Mesh</td></tr><tr><td>kleine Maschen (~300 &micro; m)</td><td>Spektrumlabore</td><td>146 424</td><td>verschiedene Formate, z.B. , 146 422 oder 146 486</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Diverse</td> Kaliumacetat Diverse <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylsäure</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>GEFÄHRLICH; alternativ kann Natriumcacodylat Kalium substituiert werden</td></tr><tr><td> Hydroxid</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taxol (Paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>GEFÄHRLICH</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td>Sonstiges</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for imaging prometaphase und metaphase der meiose i in fester<em&gt; drosophila</em&gt; oozyten

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Die Chromosomensegregation in menschlichen Eizellen ist fehleranfällig und führt zu Aneuploidie, die die häufigste genetische Ursache für Fehlgeburten und Geburtsfehler ist. Die Untersuchung des Chromosomenverhaltens in Eizellen von Modellorganismen ist vielversprechend, um die molekularen Grundlagen der Anfälligkeit menschlicher Eizellen für Aneuploidie aufzudecken. Drosophila melanogaster ist mit über 100 Jahren Forschung, Gemeinschaft und Technikentwicklung anfällig für genetische Manipulationen. Die Visualisierung des Chromosomenverhaltens und der Spindelassemblierung in Drosophila-Eizellen stellt jedoch besondere Herausforderungen dar, da die Eizelle von Membranen umgeben ist, die für Antikörper undurchdringlich sind. Wir beschreiben hier Protokolle für die Sammlung, Aufbereitung und Bildgebung der Meiose-I-Spindelassemblierung und des Chromosomenverhaltens in Drosophila-Oozyten, die die molekulare Dissektion der Chromosomensegregation in diesem wichtigen Modellorganismus ermöglichen.

Die Methoden , die wir hier beschrieben haben , in der Sammlung von Spätstadium der Drosophila - Oozyten , die drei Stadien der Meiose (Abbildung 1) wird zur Folge haben . Oozyten in Prophase werden durch das Vorhandensein der Kernhülle aus, die durch das Fehlen von Tubulin - Signal in der Region um die karyosome (1A) sichtbar ist. Prometaphase ist die Zeit, nach der Kernhülle Zusammenbruch während der die Spindel montiert. Während Prometaphase ...

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Drosophila-Oozyten für die zytologische Untersuchung der Spindelbildung und Chromosomenorientierung während der Meiose I vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Meiose zu beantworten, beispielsweise wie die Spindelbipolarität etabliert wird und wie Chromosomen eine Biorientierung erreichen, obwohl keine Zentrosomen vorhanden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Oozytenmembranen, die den Antikörpern den Zugang versperren, effektiv entfernt werden, wodurch eine Immunfluoreszenz ermöglicht wird. Um zu beginnen, beschichten Sie die Innenseite eines fünf Millimeter großen Röhrchens und einer Pasteurpipette mit PTB, um zu verhindern, dass die Oozyten an den Oberflächen haften bleiben.Geben Sie 100 Milliliter ROB-Puffer in einen Mixer und fügen Sie dann 100 bis 300 anästhetisierte Fliegen hinzu. Pulsieren Sie dreimal für jeweils eine Sekunde. Filtern Sie die entstandene Suspension durch ein grobes Netz mit Poren von etwa 1.500 Mikrometern in einen 250-Milliliter-Becher. Lassen Sie das Filtrat etwa zwei Minuten lang absetzen und aspirieren Sie anschließend die obere Schicht, wobei Sie so viele große Körperteile wie möglich entfernen.Filtrieren Sie die Suspension erneut in ein 250-Milliliter-Becherglas durch ein feineres Sieb mit einer Porengröße von 300 Mikrometern. Spülen Sie das erste Becherglas mit zusätzlichem Puffer in der beschichteten Pipette aus, um die verbliebenen Oozyten zu sammeln. Lassen Sie die Suspension drei Minuten lang absetzen und aspirieren Sie alles bis auf die untersten 10 Milliliter. Geben Sie so viel wie möglich von den 10 Millilitern in das beschichtete Fünf-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Suspension etwa zwei Minuten lang absetzen und entfernen Sie anschließend vorsichtig die Flüssigkeit. Geben Sie den Rest der 10 Milliliter Suspension hinzu und lassen Sie das Gemisch erneut absetzen, bevor Sie die Flüssigkeit entfernen.Spülen Sie die restlichen Oozyten mit zusätzlichem Puffer aus der Pipette in das Becherglas. Lassen Sie die Spülflüssigkeit drei bis fünf Minuten in dem Fünf-Milliliter-Röhrchen absetzen. Um die Ovarien zu fixieren, aspirieren Sie zunächst die gesamte Flüssigkeit von dem Gewebe ab und geben Sie sofort ein Milliliter Fixierlösung hinzu.Platzieren Sie die Gewebe auf einem Nutschüttler für 2 1/2 Minuten. Geben Sie anschließend ein Milliliter Heptan hinzu, wirbeln Sie das Gefäß eine Minute lang im Vortex, und lassen Sie die Oozyten danach weitere eine Minute lang absetzen. Entfernen Sie alle Flüssigkeit vom abgesetzten Gewebe und fügen Sie dann ein Milliliter 1x PBS hinzu.Vortexen Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang und lassen Sie die Oozyten anschließend eine Minute lang absetzen. Danach entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus dem Röhrchen und füllen es mit fünf Millilitern 1x PBS. Geben Sie mithilfe der beschichteten Pipette etwa 500 bis 1.000 Oozyten auf einen mattierten Objektträger aus Glas.Entfernen Sie überflüssige Körperteile oder Materialien mit einer Pinzette. Legen Sie einen Deckel auf das Gewebe und rollen Sie die Oozyten vorsichtig, bis alle Membranen entfernt sind. Das Ziehen der Kante des Deckels über die Oozyten funktioniert gut.Überprüfen Sie regelmäßig den Fortschritt der Membranentfernung unter dem Mikroskop. Zu hoher Druck zerstört die Oozyten. Die effektivste Entfernung der Oozytenmembran wird erreicht, indem die maximale Bewegung der Oozyten mit dem minimalen Druck kombiniert wird.Verwenden Sie eine leichte Berührung und schnelle Bewegungen, um die Kante des Deckgläschens über die Oozyten zu ziehen. Geben Sie 15 Milliliter PBS mit 1 % Triton X-100 in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um die Extraktion und Blockierung zu beginnen. Spülen Sie die aufgerollten Oozyten in dieses Röhrchen und inkubieren Sie sie unter leichtem Schütteln (Nutation) für eine bis eineinhalb Stunden.Nachdem die Oozyten zwei Minuten lang gesetzt wurden, entfernen Sie die Flüssigkeit zusammen mit möglichst vielen Membranen und geben Sie 50 Milliliter PBS mit 0,05 % Triton X-100 hinzu. Lassen Sie die Oozyten weitere zwei Minuten sedimentieren und entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit bis auf etwa einen Milliliter. Überführen Sie die Oozyten in ein graduiertes 1,5-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit.Geben Sie ein Milliliter PTB zur Blockierung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde unter Nuten. Entfernen Sie die Flüssigkeit von den Oozyten und geben Sie anschließend 300 Mikroliter PTB hinzu. Fügen Sie danach den primären Antikörper der Wahl in der geeigneten Verdünnung hinzu, wobei darauf zu achten ist, die mit fluoreszierendem Antikörper behandelten Proben vor Licht zu schützen.Übernacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Oozyten waschen und viermal je 15 Minuten mit einem Milliliter PTB waschen. Die Flüssigkeit entfernen und 200 Mikroliter Überstand von den mit sekundärem Antikörper behandelten Embryonen hinzufügen.Filtern Sie bis zur 300-Mikroliter-Marke mit PTB und inkubieren Sie anschließend drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur unter Nutaion. Waschen Sie die Oozyten einmal für 15 Minuten mit einem Milliliter PTB. Entfernen Sie danach die Flüssigkeit und geben Sie 0,5 Mikroliter Hoechst 33342 sowie 500 Mikroliter PTB hinzu.Setzen Sie auf Nuten für sieben Minuten. Verwenden Sie ein Milliliter PTB, um die Oozyten zweimal für jeweils 15 Minuten zu waschen. Die Proben können nun unmittelbar mit Standardmethoden der konfokalen Mikroskopie montiert und abgebildet werden oder bei vier Grad Celsius in PTB aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden.Bilder von Oozyten im fortgeschrittenen Stadium, die mit der hier gezeigten Technik erzeugt wurden, zeigen drei verschiedene Stadien der Meiose. Oozyten in der Prophase zeichnen sich durch das Vorhandensein der Kernhülle aus, die aufgrund des Fehlens eines Tubulin-Signals in den Bereichen um das Karyosom herum sichtbar ist. Die charakteristische Verlängerung des Karyosoms in der Prometaphase wurde ebenfalls beobachtet, und die vierten Chromosomen sind getrennt vom Karyosom-Massenkomplex zu sehen.Die Metaphase wurde ebenfalls erfasst, und der Karyosom ist in eine runde Form zurückgezogen. Hier zeigt die Immunfärbung mit verschiedenen Antikörpern das Spindelapparat, die Zentromere und die zentrale Spindel in mit Formaldehyd und Heptan fixierten Oozyten. Oozyten, die mit dem Wirkstoff Colchicin behandelt wurden, wiesen nicht standardmäßige Phänotypen auf, bei denen die meisten nicht-kinetischen Mikrotubuli eliminiert waren, wodurch alle verbleibenden Mikrotubuli mit der an Zentromeren markierten DNA in Kontakt standen, die mit Phocyde gekennzeichnet war.Die Behandlung mit Paclitaxel führte zu Oozyten mit übermäßigen Mikrotubuli im Zytoplasma. Schließlich zeigten Oozyten, die mit Binuclein 2 zur Hemmung der Aurora-B-Kinase behandelt wurden, einen vollständigen Verlust der Spindel-Mikrotubuli. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich beim Entfernen der Oozytenmembran nicht zu beeilen, da der Erfolg des Protokolls von diesem Schritt abhängt.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Entfernen der Membranen Geduld und Übung erfordert. Diese Technik wird daher am besten erlernt, indem man beobachtet, wie jemand sie erfolgreich durchführt. Sobald sie beherrscht ist, kann das Rollen der Oozyten innerhalb von fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden.Es ist jedoch möglich, bis zu 30 Minuten in Anspruch zu nehmen, ohne die Qualität der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man späte Drosophila-Oozyten für die Bildgebung der biotischen Spindelbildung, der Spindelorganisation, der Chromosomenbewegungen und der chromosomalen Bi-Orientierung vorbereitet. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

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Biology

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