Name: Entfernung von Drosophila Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Lernen Sie die Entfernung von Muskelgewebe aus Drosophila-Larven für die Immunfluoreszenzanalyse sensorischer Neuronen und epidermaler Zellen. Diese Methode verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht hochauflösende Mikroskopie.

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Wir danken Gary Laevsky für hilfreiche Diskussionen über die Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert gewährt R01GM061107 und R01GM067758 zu ERG

Hinweis: Das Verfahren für die Muskelentfernung (Abbildung 1) ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verfahren für die Larven Filets vor. Die Schritte , die Muskelentfernung vorangehen und folgen , werden kurz skizziert und der Leser wird auf die bisherige Arbeit 10 bezeichnet, 11 für detailliertere Beschreibungen. 1. Dissect Larve in Cold Saline <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von kaltem HL3.1 Salz 15 oder kalt Ca 2+ -freien HL3.1 saline 11 (Tabelle 1). Legen Sie die Larve in einem Silikon-Elastomer-Schale mit gerade genug kaltem Salz den Boden der Schale zu bedecken. HINWEIS: Siehe Diskussion in Bezug auf die Wahl der Kochsalzlösung. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 Kochsalzlösung (pH 7,2) </td></tr><tr><td> 5 mM HEPES </td></tr><tr><td> 70 mM NaCl </td></tr><tr&gt; <td> 5 mM KCl </td></tr><tr><td> 1,5 mM CaCl 2 (weglassen für Ca 2+ -freien Salzlösung) </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 mM Trehalose </td></tr><tr><td> 115 mM Sucrose </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Filter zu sterilisieren und lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Hinweis: Zusammensetzung ahmt Insekten Hämolymphe </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammensetzung des Kalten Saline. <ol start="2"><li> Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben. Die ventrale Oberfläche der Larven durch die Bauch Dentical Riemen und der Rückenseite durch die primären Larven Trachealtuben von anterior nach posterior verlauf identifiziert werden. Dehnen Sie die Larve in der anterior-posterioren Richtung und stecken den Kopf und den Schwanz einSiliconelastomerschale mit Insektenstifte sezieren. Verwenden Sie feine Präparierscheren entlang der ventralen Mittellinie zu schneiden, die an einem Ende beginnen und Fortschritte in Richtung auf die andere. HINWEIS: Diese Ausrichtung bewahrt die häufigsten studierte dorsalen Cluster von da Neuronen. </li><li> Nachdem die Larve aufgeschnitten wird, an die Sezieren Gericht die vier Ecken stecken, als ob ein Buch zu öffnen. Verwenden einer Pinzette zu greifen und entfernen Sie die inneren Organe einschließlich des ZNS, Darm und Luftröhre. Stellen Sie Insektenstifte, so dass das Filet ist straff, aber nicht maximal gestreckt. HINWEIS: Die Muskeln werden auf Segmentgrenzen an der Körperwand verankert. Obwohl Muskeln die meisten der Körperwand bedecken, sind sie in einem engen Bereich in der Nähe der Rückenmittellinie fehlt. </li></ol> 2. Muskelentfernung <ol><li> Suchen Sie die Rückenmittellinie der Larve, wo Muskelgewebe fehlt. Positionieren Sie eine einzelne Zange Zinke so dass es unter dem Muskelgewebe in der flachste mögliche Ausrichtung eingefügt werden. </li><li> Beginnt umder Rückenmittellinie in der Nähe der vorderen Begrenzung des Segments gleitet vorsichtig die Zange Zinke zwischen dem Muskel und der Epidermis, wobei darauf geachtet Kontakt zwischen der Zange und der Epidermis zu minimieren. </li><li> Ziehen Sie die Zange nach oben die Befestigung des Muskels an der Körperwand an einem Ankerpunkt zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Hemi-Segment (e) von Interesse. HINWEIS: Dieses Protokoll Erhaltung des hinteren jedes da Neuron Dendriten Bereich optimiert. Um den vorderen Teil des Dendriten Feld zu erhalten, ist es am besten, die Zange Zinke am hinteren Ende jedes Segments einzufügen. </li><li> Nachjustieren Insektenstifte, so dass die Larven Filet maximal in alle Richtungen gedehnt wird. </li><li> Befestigen Sie das Filet, während es noch auf dem Sezieren Schüssel mit kaltem, frisch zubereiteten 4% Formaldehyd in PBS für 25 min fixiert ist. </li><li> Spülen Sie 5-mal in PBS. </li><li> Verwenden einer Pinzette vorsichtig Muskelgewebe von den übrigen Ankerpunkte ziehen weg, wobei darauf geachtet Conta zu minimierenct mit der Epidermis. </li><li> Loslösen und entfernen Sie das Filet vom Sezieren Schale in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie alle nachfolgenden Waschen, Sperrung und Immunfluoreszenzanfärbung Schritte, wie zuvor 11 beschrieben. </li></ol> 3. Montieren Sie den Larval Fillet <ol><li> Entfernen Sie zuerst den Kopf und Schwanz mit feinen Präparierschere, um die Probe so flach wie möglich zu machen. Montieren Sie das Filet auf einem Deckglas in Antifade mountant mit der inneren Oberfläche des Filets das Deckglas gegenüber. </li><li> Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig die Montage Medium zu dispergieren. Klappen Sie den Mikroskop-Objektträger über und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack. Objektträger für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol>

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<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier ist ein Protokoll für die manuelle Entfernung von Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets beschrieben. Dieses Protokoll modifiziert vorher Larven- Dissektion Techniken beschrieben 10,11. Nachdem die Larven in einer Silikonelastomerschale zergliedert wird, wird der dorsalen Mittellinie befindet. Eine einzelne Zange Zinke, in seiner flachsten mögliche Ausrichtung, ist zwischen dem Muskelgewebe und der Epidermis, in der Nähe der Rückenmittellinie sorgfältig eingeführt. Die Zange gezogen sanft nac...

Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen bieten ein wertvolles Modell für die neuronale Entwicklung des Studiums aufgrund ihrer Zugänglichkeit für genetische Manipulation und die Leichtigkeit , mit der sie abgebildet werden kann. Diese sensorischen Neuronen wurden bei der Identifikation zahlreicher Wege instrumental die Dendriten Morphogenese 1-3 steuern. Vier Klassen von da Neuronen (Klasse I - IV) innervate die Larven Epidermis. Diese Neuronen liegen zwischen der Basalmembran der Epidermis und mit ihren Dendriten bilden weitgehend zweidimensionale Arrays 4,5. Von den vier Klassen, Klasse IV da Neuronen sich die hochverzweigten Lauben haben und, wie sensorische Neuronen von anderen Tieren, erfordert die Ausarbeitung dieser Dorne intrinsischen Faktoren sowie Hinweise aus benachbarten Geweben, insbesondere die Epidermis, für ihre Entwicklung 6-9 . Studien, um festzustellen, wie solche neuronale und extra neuronale Tatsacheors steuern Dendriten Morphogenese Nutzen aus der Fähigkeit , die Proteinexpression in situ durch Immunfluoreszenz nachzuweisen. Die äußere Kutikula der Larve ist undurchdringlich für Antikörper, aber dieses Hindernis wird durch die Herstellung von Larven Filets durch gut etablierte Dissektion Methoden 10,11 leicht zu überwinden. Allerdings stellt die Körperwand Muskelgewebe, die gerade Inneren der Basalmembran liegt einige Herausforderungen zu Visualisierung von da Neuronen und epidermalen Zellen. Erstens, das Muskelgewebe, welche Linien die meisten der Körperwand, verschleiert stark fluoreszierende Signale von neuronalen oder epidermale Gewebe ausgeht. Dies reduziert erheblich das Signal-Rausch-Verhältnis in der Probe. Zweitens sind viele relevante Proteine ​​werden in das Muskelgewebe sowie in den Neuronen oder Epidermis exprimiert wird. Dieser Muskel abstammenden Fluoreszenzsignal wird weiter zu verdunkeln Erfassung eines Fluoreszenzsignals von dem Neuron oder Epidermis wahrscheinlich. Schließlich Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien keinew Genehmigung Bildgebung von Proben , die bei Unterbeugungs Auflösung und kann besonders hilfreich bei der Lokalisierung von Proteinen anspruchsvolle , die in Neuronen und die umliegenden Zellen der Epidermis 12,13 exprimiert werden. Allerdings Bildgebung mittels superauflösende Mikroskopie profitiert von einem starken Signal-Rausch-Verhältnis und die Nähe der Probe auf dem Deckglas. Zusätzlich zu dem Signal-Rausch-Verhältnis zu reduzieren, die Larvenkörperwand Muskel Abstände da Neuronen aus dem Deckglas, wodurch die verbesserte Bildauflösung zu begrenzen, die mit Superauflösungsmikroskopieverfahren erreicht werden kann. Neben Herausforderungen für die Immunfluoreszenzanalyse, stellt das Muskelgewebe eine Barriere für die Aufnahme elektro von sensorischen Neuronen im Larvenkörperwand. Seine Entfernung profitiert daher neurophysiologischen Manipulation von sensorischen Neuronen 14. Hier ist ein Verfahren zur manuellen Entfernung von Drosophila Larve Muskelgewebe beschrieben. Wir zeigen, dass unser Protokoll permits Immunofluoreszenz Bildgebung von Proteinen, die sonst durch Muskelgewebe verdeckt, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis für die Visualisierung der Klasse IV da Neuronen und ermöglicht die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie zur besseren räumlichen Beziehungen von Proteinen und Zellstrukturen in da Neuronen unterscheiden und die Epidermis.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere, 8 cm, gerade, 5 mm Klingen, 0,1 mm Spitzen</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer</td><td>Kit Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>für Präparierplatten</td></tr><tr><td>Austerlitz Insektenstifte, 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 Lichtquelle</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifading-Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>für die konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade-Eindeckmittel</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung</td></tr><tr><td>Mikro-Deckglas, 22 x 22 mm, Nr. 1,5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Coracle Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>Überstand, verdünnt 1:50</td></tr><tr><td>Maus Anti-Scheiben große Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>Überstand, verdünnt 1:50</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-dsRed-Antikörper</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>verdünnt 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziege, Alexa Fluor 568 konjugierter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>verdünnter 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-Maus-Antikörper aus Ziege, Alexa Fluor 488 konjugierter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>verdünnt 1:500</td></tr></tbody></table>

entfernung von<em&gt; drosophila</em&gt; muskelgewebe aus larval filets für immunfluoreszenzanalyse von sensorischen neuronen und epidermalen zellen

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen sind ein beliebtes Modell für Mechanismen der neuronalen Morphogenese zu untersuchen. Da Neuronen entwickeln in Kommunikation mit den Epidermiszellen sie innervieren und so ihre Analyse Nutzen aus in situ Visualisierung beider neuronal und epidermal exprimierten Proteine durch Immunofluoreszenz. Traditionelle Methoden der Larven Filets für Immunofluoreszenz Experimente vorbereiten lassen das Muskelgewebe intakt, dass die meisten der Körperwand erstreckt, mehrere Herausforderungen zu meistern neuronalen und epidermalen Proteine ​​Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Muskelgewebe von Drosophila Larven Filets entfernen. Dieses Protokoll ermöglicht die Abbildung von Proteinen, die ansonsten durch Muskelgewebe verdeckt sind, verbessert die Signal-Rausch-Verhältnis, und erleichtert die Verwendung von Superauflösungsmikroskopie DA-Neuronenentwicklung zu untersuchen.

Wir zeigen den Nutzen des Muskels Entfernungsprozedur für das Signal-Rausch-Verhältnis in Immunofluoreszenz Experimente Verbesserung der septate Junction-Proteine ​​Coracle (Cora) und Disketten-large (DLG) zusammen mit der Klasse IV da Neuronen mit der Membran Marker markiert zusammen visualisieren CD4- tdTomato. Cora wurde bisher verwendeten Flächen zu identifizieren , wo DA Neuron Dendriten von epidermalen Zellen eingeschlossen sind , und ist eine von viele...

Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Muskelgewebe von einer Drosophila-Larve zu entfernen, um eine Immunfluoreszenz-Analyse der dendritischen Arborisation oder der da-Neuronen und des epidermalen Gewebes der Larve vorzubereiten. Heute werden wir eine Methode demonstrieren, die die Visualisierung neuronaler und extraneuronaler Faktoren verbessert, die an der Dendriten-Morphogenese beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Immunfluoreszenz-Aufnahme von Proteinen ermöglicht, die andernfalls durch Muskelgewebe verdeckt wären, das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert und die Anwendung der Super-Resolution-Mikroskopie erlaubt. Beginnen Sie damit, so viel kalte Kochsalzlösung in eine Silikonelastomer-Schale zu geben, dass die Bodenfläche bedeckt ist. Geben Sie die Versuchslarve in die Schale und stellen Sie diese unter das Stereomikroskop. Achten Sie auf eine korrekte Platzierung der Beleuchtung.Positionieren Sie die Larve mit der Bauchseite nach oben, die anhand der Bauchborstengürtel identifiziert werden kann. Dehnen Sie die Larve in anteroposteriorer Richtung aus und befestigen Sie Kopf und Schwanz mit Insektennadeln am Boden der Petris

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Drosophila Larven NMJ Dissection

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Dieses Video beschreibt, wie Larvenfilets präpariert werden, die zur Visualisierung von Neuronen der sensorischen dendritischen Arborisation (da) und den zugehörigen Epidermiszellen verwendet werden. Das vorgestellte Protokoll zeigt im Detail, wie Muskelgewebe aus der Körperwand entfernt werden kann, während die Morphologie der Zellen erhalten bleibt, was die Immunfärbung und die Visualisierung der sonst verdeckten da-Neuronen und Epidermiszellen verbessert.

Larvenfiletvorbereitung: Eine Methode zur Visualisierung intakter sensorischer Neuronen und assoziierter Epidermiszellen

Die Drosophila-Flugmuskeln werden als Modellsystem für Muskelentwicklung und Physiologie verwendet. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und zeigt ein Protokoll zur Dissektion der sich entwickelnden indirekten Flugmuskulatur, die für die RNA-Sequenzierung von Puppen geeignet ist.

Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Drosophila Flugmuskel ist ein leistungsfähiges Modell, um Transkriptionsregulation, alternative Spleißung, Stoffwechsel und Mechanobiologie zu studieren. Wir präsentieren ein Protokoll zur Zerlegung von fluoreszierend markierten Flugmuskeln aus lebenden Pupas, um hoch angereicherte Proben zu erzeugen, die ideal für Proteomik und Tiefensequenzierung sind. Diese Proben können wichtige mechanistische Einblicke in verschiedene Aspekte der Muskelentwicklung bieten.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell, um die grundlegenden Mechanismen der Myogenese zu verstehen. Dieses Protokoll für die Dissektion und Präparation von Thorax-Hemisektionen ermöglicht die mikroskopische Analyse des indirekten Flugmuskels sowohl im Puppen- als auch im Erwachsenenstadium. Dieses Protokoll ermöglicht die konfokale Bildgebung der zellulären Morphologie, der Proteinlokalisierung, der Muskelstruktur und mehrerer anderer Aspekte der Myogenese.

Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

Lernen Sie die Entfernung von Muskelgewebe aus Drosophila-Larven für die Immunfluoreszenzanalyse sensorischer Neuronen und epidermaler Zellen. Diese Methode verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht hochauflösende Mikroskopie.

Entfernung von Drosophila Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen (Video) | JoVE Journal

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