Verfahren zum Messen von RNA
5. Dezember 2016
Modifiziertes Northern - Blotting - Verfahren für N 6 -methyladenosine (m 6 A) Änderungen in RNA Messung beschrieben. Die aktuelle Methode können Änderungen in diversen RNAs und Kontrollen unter verschiedenen experimentellen Designs erkennen.
Das übergeordnete Ziel der modifizierten Northern-Blot-Technik besteht darin, N6-Methyladenosin-, n6A-Modifikationen in RNA zu messen und Modifikationen in verschiedenen RNAs nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Rolle der RNA-Epigenetik, wie beispielsweise N6-Methyladenosin-Modifikationen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine effektive Trennung der RNA, eine bessere Standardisierung für experimentelle Versuchsdesigns sowie eine klare Abgrenzung der n6A-Modifikation in RNAs ermöglicht.
Diese Methode kann Einblicke in n6A-Modifikationen in RNA gewähren und kann auch auf andere RNA-Modifikationen mit unterschiedlichen Nachweisantikörpern angewendet werden. Um das Experiment zu beginnen, sprühen Sie eine Ribonuklease-Entkontaminationslösung auf Papierhandtücher und wischen Sie die Pipetten sowie die Laborbankoberflächen ab. Befeuchten Sie die Papierhandtücher mit nukleasefreiem Wasser und wischen Sie die Pipetten sowie die Laborbankoberflächen erneut ab.
RNA-Isolationslösung, die bei vier Grad Celsius aufbewahrt wurde, entnehmen und ein Milliliter dieser Lösung zu etwa 75 Milligramm Mausgewebe hinzufügen. Das Gewebe mit einem Rührwerk homogenisieren. Anschließend 100 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan oder BCP pro Milliliter der Probenhomogenat hinzufügen.
Schütteln Sie die Röhrchen kräftig für 15 Sekunden und fahren Sie mit der Isolierung der gesamten RNA fort. Bestimmen Sie mithilfe eines Spektrophotometers die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 Nanometern und 280 Nanometern messen. Überprüfen Sie die Qualität der RNA-Probe durch Durchführung einer 0,8 %igen Agarose-Gelelektrophorese.
Spülen Sie die gesamte Elektrophorese-Ausrüstung mit Diethylpyrocarbonat oder DEPC-Wasser. Geben Sie 2,5 Gramm Agarose und anschließend 215 Milliliter DEPC-Wasser in einen Erlenmeyerkolben und schmelzen Sie die Mischung vollständig in einer Mikrowelle. Nach dem Schmelzen der Lösung fügen Sie 12,5 Milliliter 10X MOPS-Puffer hinzu.
Und 22,5 Milliliter 37 % Formaldehyd zum Kolben geben. Dann die Lösung in die Elektrophoreseapparatur mit einem 1,5 Millimeter dicken Kamm gießen. Mit einem sauberen Kamm die Blasen an die Ränder des Gels schieben.
Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren. Spülen Sie anschließend die Vertiefungen des Gels mit zuvor hergestelltem 1X MOPS-Laufpuffer und führen Sie einen Vorlauf des Gels durch. Geben Sie die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels und führen Sie dann den Elektrophoreselauf durch.
Am nächsten Tag das Gel unter UV-Licht untersuchen und fotografieren. Zum Vorbereiten des Transfers das Gel zuschneiden und den ungenutzten Teil entfernen. 500 Milliliter 10X Salin-Natriumcitrat- oder SSC-Puffer herstellen.
Waschen Sie das Gel zweimal mit 10X SSC-Puffer. Schneiden Sie ein Filterpapier groß genug zu, um das Gel abzudecken. Schneiden Sie vier Stücke Filterpapier auf die gleiche Größe wie das Gel zu.
Schneiden Sie als Nächstes ein Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel zu. Markieren Sie eine Kerbe am Gel und an der Membran als Orientierungshilfe, um die korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Tauchen Sie die Membran in 2X SSC-Puffer ein.
Geben Sie 500 Milliliter 10X SSC-Puffer in die Transferwanne. Legen Sie das große Filterpapierblatt über die Glasplatte und benetzen Sie das Filterpapier mit Transferpuffer. Anschließend verwenden Sie eine Pipette, um eventuelle Blasen herauszurollen.
Befeuchten Sie zwei Stücke vorgeschnittener Filterpapier in Transferpuffer und legen Sie sie in die Mitte des Filterpapiers. Entfernen Sie eventuelle Blasen. Legen Sie dann das Gel mit der Oberseite nach unten auf das Filterpapier und platzieren Sie die Membran auf dem Gel, wobei Sie sicherstellen, dass die Kerben des Gels und der Membran ausgerichtet sind.
Als Nächstes zwei Stücke vorgeschnittener Filterpapier auf die Membran legen. Eventuelle Blasen zwischen den Schichten entfernen. Plastikfolie um das Gel geben, um sicherzustellen, dass die Tücher nur Puffer aufnehmen, der durch das Gel und die Membran hindurchtritt.
Dann stapeln Sie Papiertücher auf das Filterpapier. Legen Sie eine übergroße Glasplatte auf die Tücher, setzen Sie ein Gewicht auf den Stapel und lassen Sie die RNA über Nacht aus dem Gel auf die Membran übergehen. Nach dem Transfer halten Sie die Membran in 2X SSC-Puffer feucht.
Tauchen Sie zwei Filterpapierblätter in 10X SSC-Puffer ein und legen Sie die Blätter anschließend in den UV-Vernetzer. Achten Sie darauf, dass die Seite mit der absorbierten RNA nach oben zeigt, und legen Sie dann die Membran auf das Filterpapier. Wählen Sie den automatischen Vernetzungsmodus aus und drücken Sie die Starttaste, um die Bestrahlung zu beginnen.
Überprüfen Sie die Membran und das Gel mit einem UV-Gelbildaufnahmesystem, um die RNA-Übertragung vom Gel auf die Membran zu bestätigen. Blockieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 5 % fettfreier Milch in TBST-Puffer. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius in der m6A-Antikörperlösung.
Am nächsten Tag die Membran dreimal für jeweils 15 Minuten mit TBST-Puffer waschen. Anschließend die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur in der mit HRP konjugierten Esel-anti-Kaninchen-Antikörper-Lösung inkubieren. Nach einer Stunde die Membran dreimal für jeweils 15 Minuten mit TBST-Puffer waschen.
Tragen Sie das verbesserte Chemilumineszenz-Substrat auf. Erfassen Sie die Chemilumineszenz mit einem digitalen Bildgebungssystem. Schreiten Sie abschließend zur m6A-Quantifizierung fort und messen Sie die relative m6A-Chemilumineszenzintensität mithilfe von ImageJ. Mausleber-RNAs wurden in Vier-Stunden-Abständen entnommen und mit der modifizierten Northern-Blotting-Technik untersucht.
Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleinen RNAs wurde eindeutig nachgewiesen. Repräsentative m6A-Blots wurden für Gesamt-RNA und RNA ohne rRNA aus Lebern von Wildtyp-Mäusen durchgeführt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der RNA-Epigenetik den Weg, um Auswirkungen auf die menschliche Physiologie im Zusammenhang mit dem circadianen Rhythmus und Adipositas zu untersuchen.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine modifizierte Northern-Blot-Methode zur Messung von N6-Methyladenosin (m6A)-Modifikationen in RNA. Die Technik ermöglicht den Nachweis von Modifikationen in verschiedenen RNA-Proben und ist unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen anwendbar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Epigenetik
- m6A-Modifikationen
- Experimentelle Techniken
Hintergrund
- N6-Methyladenosin ist eine bedeutende RNA-Modifikation.
- Das Verständnis von RNA-Modifikationen ist entscheidend, um Einblicke in die Genregulation zu gewinnen.
- Aktuelle Methoden zur Detektion von m6A sind begrenzt.
- Diese modifizierte Technik zielt darauf ab, die Detektion und Analyse zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zum Nachweis von m6A-Modifikationen in RNA.
- Verbesserung des Verständnisses der RNA-Epigenetik.
- Bereitstellung eines standardisierten Ansatzes für verschiedene experimentelle Designs.
Verwendete Methoden
- RNA-Isolierung aus Mausgewebe.
- Elektrophorese zur Beurteilung der RNA-Qualität.
- Übertragung der RNA auf eine Nylonmembran.
- Nachweis mittels m6A-Antikörpern und Chemilumineszenz.
Hauptergebnisse
- Nachweis von m6A-Modifikationen in rRNAs, mRNAs und kleinen RNAs erfolgreich möglich.
- Deutliche Abgrenzung von m6A-Modifikationen in verschiedenen RNA-Proben.
- Die Methode kann innerhalb von vier Tagen effizient durchgeführt werden.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte Northern-Blotting-Technik eignet sich zur Untersuchung von RNA-Modifikationen.
- Diese Methode erschließt neue Forschungsmöglichkeiten in der RNA-Epigenetik.
- Zu den möglichen Anwendungen gehören Studien zu circadianen Rhythmen und Fettleibigkeit.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die genaue Messung von RNA-N6-Methyladenosin-(m6A)-Modifikationen unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der RNA-Epigenetik, indem sie eine quantitative Beurteilung der epitranskriptomischen Regulation ermöglicht. Diese Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei mechanistischen Studien, die m6A mit physiologischen Prozessen wie circadianen Rhythmen und dem Stoffwechsel verknüpfen. Sie bietet eine standardisierte und reproduzierbare Plattform zur Absicherung therapeutischer Hypothesen in der Entdeckungsbiologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der von m6A-abhängigen RNA-Stabilität, Translation und Spleißen, um die funktionellen Rollen epigenetischer Regulatoren in Genexpressionsnetzwerken zu klären.
- Operationaler Wert: Bietet eine klare Abgrenzung von m6A über verschiedene RNA-Spezies hinweg und unterstützt so die Identifizierung biomarkerrelevanter Zielstrukturen in Krankheitsmodellen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Dosis-Wirkungs- und Zeitverlaufs-Analyse von m6A-Spiegeln und verbessert dadurch die Zuverlässigkeit bei der Beurteilung der Zielstrukturenbindung und der Modulation von Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative chemilumineszente Signale, die mit hochauflösender Bildgebung zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen kompatibel sind.
- Operativer Wert: Standardisiert den RNA-Transfer und die Detektion mittels Nylonmembran und antikörperbasierter Nachweisverfahren und verringert so die Variabilität bei der Profilierung von Modifikationen.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Ermöglicht den direkten Vergleich von modifizierter und unmodifizierter RNA als Kontrollen und unterstützt die Assay-Validierung für epigenetische Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet m6A-Dynamiken in der Leber-RNA mit metabolischen und zirkadianen Phänotypen und unterstützt damit die translationale Erforschung von Biomarkern in präklinischen Modellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht Längsschnitt-Stichproben (z. B. im Vier-Stunden-Abstand), um zeitliche Modifikationsmuster zu erfassen, die für physiologische Rhythmen relevant sind.
- Risikominderung: Verringert die Unsicherheit bei der Messung von RNA-Modifikationen und verbessert die Reproduzierbarkeit in Workflows zur Zielvalidierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckungsbiologie bis zur Lead-Identifizierung ein, indem sie die Validierung der epigenetischen Ebene bietet, die transkriptionelle und proteomische Profilierungen ergänzt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von m6A-Schreibern, -Löschern und -Lesern durch direkte Messung des Modifikationszustands in RNA.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf epitranskriptomische Markierungen in zellbasierten oder gewebebasierten Systemen.
- Analytik: Ermöglicht die bildbasierte Quantifizierung der m6A-Signalintensität und damit statistische Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen oder genetischen Hintergründen.
- Translationale Forschung: Verbindet epigenetische Veränderungen in RNA mit physiologischen Ergebnissen und unterstützt die biomarkerbasierte präklinische Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an verschiedene RNA-Typen und modifikationsspezifische Antikörper, wodurch eine Wiederverwendung über mehrere epigenetische Zielstrukturen und Krankheitsbereiche hinweg ermöglicht wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung von RNA-epigenetischen Zielstrukturen durch direkte, modifications-spezifische Detektion.
- Operationaler Wert: Standardisierter Workflow mit definierten Übertragungs-, Blockierungs- und Nachweisschritten, die die Übertragbarkeit zwischen Laboren sicherstellen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die funktionelle Relevanz von m6A in krankheitsrelevanten Signalwegen geklärt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung epigenetischer Zielstrukturen basierend auf quantifizierbaren Modifikationsdynamiken.
Durchführungsaspekte
- Es sind Kenntnisse im Umgang mit RNA, Elektrophorese und Immunblotting-Techniken erforderlich.
- Zur Ausrüstung gehören ein UV-Vernetzungsgerät, ein digitales Bildgebungssystem und ein Spektrophotometer zur RNA-Quantifizierung.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen erfordert die konsequente Verwendung von DEPC-behandelten Lösungen und kontrollierten Übertragungsbedingungen.
- Die Anpassung auf andere RNA-Modifikationen hängt von der Verfügbarkeit spezifischer, modifikationserkennender Antikörper ab.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen das Risiko der RNA-Degradation sowie die Notwendigkeit der Optimierung von Antikörper-Inkubations- und Waschbedingungen.
