Name: Verfahren zum Messen von RNA N 6 -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie eine modifizierte Northern-Blot-Methode zur Detektion von N6-Methyladenosin-Modifikationen in RNA aus Mausgewebe. Diese Technik ermöglicht die effiziente Analyse verschiedener RNA-Typen für epigenetische Forschung.

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C.Y.W. erhielt Unterstützung vom National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), dem National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) und dem Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 und CMRPG3C1763).

HINWEIS: Die Gesamt - RNA m 6 A Ebene umfasst rRNA, mRNA, und andere kleine RNAs. Da ribosomale RNA hat reichlich m 6 A Änderungen, müssen die Messung von m 6 A - Levels , diese Tatsache zu berücksichtigen. 1. RNA-Isolierung <ol><li> Mit Hilfe der Ribonuklease Dekontaminationslösung (gesprüht auf Papiertücher), reinigen Sie die Pipetten und Labortisch Oberflächen. Nasse Papiertücher mit Nuklease-freies Wasser und wischen Sie Pipetten und Labortisch taucht wieder auf. </li><li> RNA-Extraktion <ol><li> Gesamt-RNA-Isolation <ol><li> Mit einem Overhead - Rührer, homogenisieren 50-100 mg Gewebe oder 5-10 x 10 6 Zellen in 1 ml RNA Isolationslösung bei 4 ° C gehalten. HINWEIS: Weitere Gewebe (100-150 mg) für Fettgewebe Proben von Mäusen erforderlich wegen der niedrigeren RNA-Konzentrationen darin. Proben aus Mäuse Herz, Leber, Skelettmuskel, Lunge, Gehirn stammen und Makrophagen zuvor 4 eingesetzt wurden. </li><li> Imcubate die Probe Homogenate für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l 1-Brom-3-chlorpropan (BCP) pro 1 ml Probe Homogenat. Schütteln der Röhrchen kräftig für 15 s und verfahren Gesamt - RNA zu isolieren , gemäß den Anweisungen des Herstellers 24. </li></ol></li><li> Die polyadenylierte mRNA Purification von isolierten Gesamt-RNA <ol><li> Reinige polyadenylierte mRNA unter Verwendung von erhältlichen Kits oder Protokolle. <ol><li> Schütteln gründlich resuspendieren jeder der folgenden Lösungen: 2x Bindungslösung, Oligo (dT) Polystyrol-Kügelchen und Waschlösung. Sicherzustellen, dass das Oligo (dT) -Kügelchen erwärme auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch. </li><li> Übertragung von 120 &amp; mgr; l Elutionslösung pro Zubereitung in ein Rohr und Wärme auf 70 ° C in einem Heizblock. </li><li> Pipette bis zu 500 ug Gesamt-RNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mit nukleasefreiem Wasser, stellen Sie die Lautstärke auf 250 &amp; mgr; l. </li><li> In 250 ul 2x Bindungslösung auf die Gesamt-RNA solution und Wirbel kurz den Inhalt zu mischen. </li><li> In 15 ul Oligo (dT) Perlen und Wirbel gründlich zu mischen. </li><li> Inkubieren der Mischung bei 70 ° C für 3 min. </li><li> Entfernen Sie die Probe aus dem Heizblock und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, hinter etwa 50 &amp; mgr; l zu verlassen. </li><li> In 500 ul Waschlösung zum Resuspendieren des Pellets durch Pipettieren. </li><li> Pipette, um die Suspension in einen Spinfilter / Sammelrohr-Set. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 g für 2 min. Entfernen Sie die Säule aus Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Durchfluss. Bringen Sie die Spalte an die Sammelröhrchen. </li><li> Pipette 500 ul Waschlösung auf den Spinfilter. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 x g für 2 min. </li><li> Übertragen Sie die Spinfilter in ein frisches Sammelröhrchen. </li><li> Pipettieren von 50 &amp; mgr; l Elutionslösung erhitztbis 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters. </li><li> Inkubieren für 2-5 min bei 70 ° C. Zentrifuge bei 15.000 × g für 1 min. </li><li> Pipettieren zusätzlich 50 &amp; mgr; l Elutionslösung auf 70 ° C auf das Zentrum des Spinfilters. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Je 100 &amp; mgr; g / mL Glykogen, 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumina absolutem Ethanol. Man fällt über Nacht bei -80 ° C. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 xg für 25 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Zentrifuge bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Sie vorsichtig das Ethanol zu entfernen. </li><li> Trockene Luft für 3-5 min. </li><li> Fügen Sie 10 ul Nuklease-freies Wasser, um das Pellet aufzulösen. </li><li> Lagern Sie bei -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> RNA Qualifizierung und Quantifizierung <ol><li> Verwendung eines Spektrophotometers, bestimmen die RNA-Konzentration durch NotIng der Absorption bei 260 nm und 280 nm. Die A 260 / A 280 Verhältnis sollte 1,8-2,2 sein. </li><li> Schauen Sie sich die RNA - Probe Qualität unter Verwendung von 0,8% Agarose - Gelelektrophorese 25. HINWEIS: Die intakte eukaryotischen Gesamt-RNA intensiv 28S und 18S rRNA-Banden zeigen. Das Verhältnis von 28S rRNA 18S gegen Bandenintensität für eine gute RNA-Präparation ist ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Gel-Elektrophorese und Übertragung HINWEIS: Die Puffervorbereitungsprotokollen sind in Tabelle 1. <ol><li> Formaldehyd-Gel-Vorbereitung (1%) <ol><li> Spülen Sie alle Elektrophoreseapparaturen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser. </li><li> Schmelze 2,5 g Agarose in 215 ml DEPC Wasser vollständig in einem Mikrowellenofen. </li><li> Hinzufügen 12,5 ml 10x 3- (N- Morpholino) propansulfonsäure (MOPS) -Puffer und 22,5 ml 37% Formaldehyd. </li><li> Gießen Sie es in die Elektrophorese-Gerät mit einer 1,5 mm dicken Kamm. </li><li> Beseitigen Sie Blasen oder Push them zu den Kanten des Gels mit einem sauberen comb. </li><li> Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung <ol><li> Mischen 1-10 ug Gesamt-RNA und 11,3 &amp; mgr; l Probenpuffer. </li><li> Mix 2 ug der RNA-Marker (1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) mit 11,3 &amp; mgr; l des Probenpuffers. </li><li> In nukleasefreiem Wasser zu den Proben von 2.2.1 und 2.2.2 bis zu einem Gesamtvolumen von 16 &amp; mgr; l. </li><li> Hitze bei 60 ° C für 5 min, und dann auf Eis kühlen. </li><li> Mischungs 16 &amp; mgr; l der Probe aus 2.2.3 mit 4 ul Tracking-Farbstoff, welche 0,1 &amp; mgr; g enthält / &amp; mgr; l Ethidiumbromid auf Eis. ACHTUNG: Ethidiumbromid ist möglicherweise teratogen und giftig beim Einatmen. Lesen Sie Ethidiumbromid Sicherheitsdatenblatt. </li></ol></li><li> Elektrophorese <ol><li> In 200 ml 10x MOPS bis 1.800 ml ddH 2 O - Puffer mit einem 1x MOPS Laufpuffer zu machen. </li><li> Verwenden Sie die 1x MOPS Laufpuffer die Vertiefungen des Gels zu spülen. </li><li> Pre-run ter Gel bei 20 V für 5 min. </li><li> Laden die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels. </li><li> Mit Folie abdecken Lichtexposition zu vermeiden. Führen Sie bei 35 V für etwa 17 Stunden (über Nacht) </li><li> Untersuchen und fotografieren Sie das Gel unter UV-Licht. </li></ol></li><li> Übertragung <ol><li> Schneiden Sie das Gel den ungenutzten Teil zu entfernen. </li><li> Bereiten 500 ml 10x SSC-Puffer (250 ml 20x SSC-Puffer und 250 ml DEPC-Wasser). </li><li> Waschen Sie das Gel zweimal mit 10x SSC-Puffer für 20 min mit 50 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Cut 1 Filterpapierblatt groß genug , um als Docht Papier zu dienen, die Transferpuffer aus der Übertragungsschale (Abbildung 1) aufnimmt. </li><li> Schneiden 4 Stück Filterpapier der gleichen Größe wie das Gel. </li><li> Geschnitten 1 Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel. </li><li> Markieren eine Kerbe auf dem Gel und die Membran als eine Markierung, um die richtige Ausrichtung zu gewährleisten. </li><li> Einweichen der Membran in 2 × SSC-Puffer für 15 min. </li><li> Gießen Sie 500 ml of 10x SSC-Puffer in die Transferschale. </li><li> Legen Sie das große Filterpapierbogen über der Glasplatte und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer. </li><li> Ausrollen alle Blasen mit einer Pipette. </li><li> Soak 2 Stück vorgeschnittene Filterpapier in Transferpuffer und legen sie auf die Mitte des Filterpapiers aus Schritt 2.4.5. Entfernen Sie alle Blasen. </li><li> Legen Sie das Gel von oben nach unten auf dem Filterpapier. </li><li> Legen Sie die Membran auf der Oberseite des Gels. Ausrichten der Kerben des Gels und der Membran. </li><li> Platz 2 Stücke von vorgeschnittenen Filterpapier auf der Oberseite der Membran und benetzt das Filterpapier mit Transferpuffer. </li><li> Entfernen Sie alle Blasen zwischen den Schichten. </li><li> Tragen Sie Plastikfolie um das Gel, um sicherzustellen, dass die Handtücher genießen nur Puffer durch das Gel vorbei und die Membran. </li><li> Stapeln Sie die Papiertücher auf dem Filterpapier. </li><li> Legen Sie eine überdimensionale Glasplatte auf der Oberseite der Handtücher. </li><li> Legen Sie ein Gewicht auf der Oberseite des Stapels. </li><li>Halten über Nacht die RNA zu ermöglichen, aus dem Gel auf die Membran zu übertragen. </li></ol></li></ol> 3. Nachweis von N 6 -methyladenosine <ol><li> Membran-Crosslinking <ol><li> Halten Sie die Membran feucht in 2x SSC-Puffer. </li><li> Platz 2 Blätter Filterpapier eingetaucht mit 10x SSC-Puffer in den UV-Vernetzer. </li><li> Platzieren Sie die Membran auf der Oberseite des Filterpapiers, mit dem RNA-adsorbierten Seite nach oben. </li><li> Wählen Sie &quot;autocrosslink Modus&quot; (120.000 &amp; mgr; J) und drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; die Bestrahlung zu initiieren. </li><li> Untersuche die Membran und das Gel mit einem UV Gelbild Fängers die RNA-Transfer von dem Gel auf die Membran zu bestätigen. </li></ol></li><li> Immunoblotting <ol><li> Blockieren die Membran in 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) Puffer bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Waschen dreimal mit TBST-Puffer für 15 min. </li><li> Inkubieren Sie die Membran über Nacht in m 6 A (&lt;em&gt; N 6 -methyladenosine) Antikörperlösung (1: 1000 in 5% fettfreier Milch TBST - Puffer) bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min. </li><li> Inkubieren der Membran in dem HRP-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung (1: 2000 in 5% fettfreier Milch TBST-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Puffer für 15 min. </li><li> Wenden Sie den verstärkten chemolumineszenten Substrat (0,125 ml pro cm 2 Membran). </li><li> Erfassen die Chemilumineszenz mit den optimalen Einstellungen des Digital Imager nach den Anweisungen des Herstellers 26. </li></ol></li><li> m 6 A Quantifizierung <ol><li> Messen Sie die relative m 6 A Chemilumineszenzintensität mit der ImageJ Software. <ol><li> Unter dem ImageJ Software Wählen Sie im Menü &quot;Datei&quot; Option, um die zugehörigen Datei zu öffnen. </li><li> Wählen Sie das &quot;Rechteck&quot; Werkzeug aus ImageJ und einen Rahmen ziehen umdie Signale. </li><li> Wenn ribosomale RNA nicht im Mittelpunkt der Experimente ist, vermeiden Sie die 18S und 28S ribosomale RNA m 6 A Bänder für die Berechnung. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Befehl&quot; und &quot;1&quot; die gewählte Spur zu bestätigen. </li><li> Drücken Sie die &quot;Command&quot; und &quot;3&quot; das ausgewählte Grundstück zu zeigen. </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Straight&quot; Werkzeug und Linien zeichnen den segmentierten Bereich zu trennen. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Wand&quot; Werkzeug, um die Messungen aufzuzeichnen. </li><li> Exportieren Sie die Daten. </li><li> Normalisieren die Niveaus von m 6 A mit der 18S ribosomale RNA - Bande aus dem Ethidiumbromidfärbung. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Modifikationen der RNA spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Funktion und Physiologie. Das derzeitige Verständnis der Regulation, Funktion und Homöostase dieser Modifikationen wird noch erforscht und erweitert8. Daher ist eine präzise und goldstandardmäßige Methode zur Bewertung der Modifikationen von RNA erforderlich. Die modifizierte Northern-Blotting-Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der RNA-Modifikationen und eine klare Abgrenzung der Modifikationen in verschiedenen RNAs. Obwohl die Methode mindestens 3 Tage benötigt, kann sie standardisiert und in verschiedenen Versuchsdesigns eingesetzt werden. Darüber hinaus kann es mit verschiedenen Antikörpern unterschiedliche RNA-Modifikationen nachweisen27.
Bei der Analyse von RNA-Modifikationen ist es wichtig, verschiedene RNAs zu trennen. Die ribosomale RNA macht einen großen Teil der Gesamtmenge an RNAaus 28,29. Die Ergebnisse der Analyse von RNA-Modifikationen nur in der Gesamt-RNA repräsentieren hauptsächlich die Veränderungen der rRNA. Methylierung und andere derartige Modifikationen von rRNA könnten möglicherweise die Veränderungen in anderen RNAs maskieren. Mit dem Verfahren der Geltrennung können die Modifikationen von mRNA und anderen kleinen RNAs genauer analysiert werden.
Die transkriptomweite Kartierung mit m6A, Immunpräzipitation und Sequenzierung bietet einen detaillierten Einblick in die Modifikation jedes RNA-22-Typs. Es liefert Informationen über die spezifischen RNAs und eine Auflösung von etwa 80-120 bp. Obwohl m6A-Seq die Modifikationen zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen vergleichen kann, ist die Auswahl geeigneter Standards und Kontrollen für solche Experimente schwierig18. Die Immunpräzipitation ist schwer zu reproduzieren und führt oft zu erheblichen Schwankungen zwischen den Wiederholungen. Darüber hinaus erfordert m6A-Seq die Fragmentierung von RNA-Proben vor der Immunpräzipitation und Sequenzierung30. Der Fragmentierungsprozess könnte möglicherweise zu unangemessenen Einflüssen auf die ursprünglichen RNA-Modifikationen führen. Wenn das Experiment nicht die spezifischen Geninformationen benötigt, sondern andere Vergleichsbedingungen erfordert, bietet die aktuelle Methode eine bessere Visualisierung und Kontrolle für verschiedene Versuchsaufbauten.
Die Modifikation der RNA ist ein wichtiger Schritt bei der Regulierung der transkriptionellen Kontrolle31. Die Homöostase und die Regulationsmechanismen verschiedener RNA-Modifikationen in verschiedenen physiologischen Bereichen sind jedoch noch unklar. Mit der vorliegenden modifizierten Northern-Blotting-Methode können verschiedene RNA-Modifikationen quantifiziert und verglichen werden. Darüber hinaus können die Veränderungen und Regulationsmechanismen von RNA-Modifikationen genauer untersucht werden. In Zukunft könnte es auch möglich sein, die experimentellen Daten sowohl aus dem klassischen Northern-Blotting-Protokoll als auch aus den modifizierten Northern-Blotting-Protokollen zu kombinieren und so bessere Einblicke in die RNA-Biologie zu erhalten.
Der wichtigste Faktor, der über den Erfolg des modifizierten Northern-Blotting-Protokolls entscheidet, ist die Integrität der RNA-Probe. RNAs mit einem gewissen Grad an Abbau können gute klassische Northern-Blotting-Ergebnisse liefern, aber dies könnte möglicherweise einen signifikanten Einfluss auf die modifizierten Northern-Blotting-Ergebnisse haben. Auch die Modifikationen der RNA in verschiedenen Geweben oder Zelllinien können sehr unterschiedlich sein. Es ist wichtig, die geeigneten RNA-Probenladungen für verschiedene Gewebe zu testen, bevor die endgültigen Experimente durchgeführt werden.
Da Blotting-Verfahren traditionell nach Dr. Southern und verschiedenen geografischen Richtungen benannt wurden, schlagen wir für die aktuelle Technik den Namen "Northeastern" Blotting vor.

Dynamische und reversible RNA-Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der RNA-Homöostase. Vor vier Jahrzehnten wurde festgestellt, dass N 6-Methyladenosin (m6A)-Modifikationen in eukaryotischen Transkriptomen reichlich vorhanden sind1. Sie haben vielfältige Funktionen in der Boten-RNA (mRNA), der ribosomalen RNA (rRNA), der kleinen nukleolären RNA, der Transfer-RNA und der microRNA2. Die m6A-Modifikationen der mRNA beeinflussen ihr Spleißen3, die Translation4, den Abbau5 und die Lokalisation2. Darüber hinaus beeinflussen sie die Biogenese der Ribosomen und die microRNA-Funktion6. Die evolutionäre Konservierung von m6A-Modifikationen der RNA wird bei einzelligen Bakterien bis hin zu mehrzelligen Menschen beobachtet7. Die Abgrenzung der Rollen von m6A Modifikationen wird derzeit umfassend untersucht. Es wird erwartet, dass die Bemühungen neue Erkenntnisse zur Transkriptionskontrolle liefern. Neuere Studien zeigen, dass auch andere chemische Modifikationen von mRNA8 eine entscheidende Rolle im RNA-Metabolismus spielen. 
Zirkadiane Rhythmen9, Stammzell-Pluripotenz10, Triglyceridstoffwechsel4, Fibrose11, Fettleibigkeit12 und schwere Depression13 sind einige Beispiele für Prozesse, bei denen m6A-Modifikationen bekannt sind, um die Ergebnisse zu kontrollieren. Viele Gentranskripte der zirkadianen Uhr haben m6A-Stellen14. Die Modulation von m6Eine Methylase oder Demethylase führt zu Veränderungen der zirkadianen Periode15. Mettl3, eine m6A Transferase, ist ein Regulator für die Pluripotenz von Stammzellen. Ein Mangel an Mettl3 führt zu einer frühen embryonalen Letalität und einem aberranten Lineage-Priming im Postimplantationsstadium10. Ein Mangel an Fettmasse- und Adipositas-assoziierter (FTO), einer m6A-Demethylase, in Adipozyten beeinflusst die Fettsäuremobilisierung und das Körpergewicht durch posttranskriptionelle Regulation von Angptl44. Diese Studien zeigen, dass m6A nicht nur die mRNA-Prozessierung steuert, sondern auch eine entscheidende Rolle in der embryologischen Entwicklung und Pathophysiologie spielt. Die Funktion der m6A-Modifikationen hat Auswirkungen auf therapeutische Überlegungen in der Zukunft.
Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um m6A-Modifikationen von RNA16-18 zu messen. Traditionell werden die Dünnschichtchromatographie (DC) und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt, um die Verteilung von m6A in mehreren RNAs zu untersuchen19,20. Die Massenspektrometrie ist ein empfindliches Werkzeug für den Nachweis von m6A-Modifikationen in RNA. Die RNA muss jedoch vor der Analyse mittels Massenspektrometrie durch RNase in kurze Fragmente herausgeschnittenwerden 21. Die Methyl-RNA-Immunpräzipitation und -Sequenzierung (m6A-Seq)22 immunpräzipitiert fragmentierte RNAs mit m6A-spezifischen Antikörpern und führt eine parallele RNA-Sequenzierung durch. Diese Methode erzeugt transkriptomweite m6A-Landschaften. Die hochauflösende Kartierung der Vernetzung und Immunpräzipitation von m6A mit individueller Nukleotidauflösung (miCLIP) bildet ferner m6A-Modifikationen mit einer Einzelnukleotidauflösungab 23. Beide Methoden liefern Details zur m6A-Modifikation über das gesamte Transkriptom mit Informationen über spezifische Gene. Quantifizierungen und Standardisierungen in beiden Methoden sind jedoch schwierig, wenn Experimente den Vergleich mehrerer Bedingungen erfordern. Darüber hinaus verändern Fragmentierungen der RNA für m6A-Seq die ursprüngliche RNA-Struktur, was sich auf die nativen m6A-Spiegel auswirken kann. Um globale m6A-Modifikationen von RNA und deren Veränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu detektieren, berichten wir über eine Methode, die ein modifiziertes Northern-Blotting-Protokoll verwendet. Bei dieser Methode wird RNA anhand des Molekulargewichts unter Verwendung der Gelelektrophorese18 aufgelöst. Dieses Verfahren bietet eine bessere Standardisierung und Quantifizierung für Experimente, die mehrere Bedingungen oder Stichproben umfassen. Es liefert auch spezifische m6A-Modifikationsinformationen für verschiedene RNAs, ob rRNA, mRNA oder microRNA.

<table><tbody><tr><td>RNaseZap-Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protokoll 1.1</td></tr><tr><td>TRI-Reagenzlösung</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protokoll 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Brom-3-chlorpropan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protokoll 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protokoll 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protokoll 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protokoll 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protokoll 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protokoll 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protokoll 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protokoll 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protokoll 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protokoll 2.1.3</td></tr><tr><td>37% Formaldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protokoll 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, Dinatriumsalz</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protokoll 2.1.3 10x MOPS Puffer</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protokoll 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Millennium Marker</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protokoll 2.2.2</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protokoll 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff</td></tr><tr><td>Xylol Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protokoll 2.2.5 Tracking-Farbstoff</td></tr><tr><td>Natriumchlorid-Dihydrat</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protokoll 2.4.2 20x SSC-Puffer</td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protokoll 2.4.2 20x SSC-Puffer</td></tr><tr><td>Hybond Löschpapier</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN6101M</td><td>Protokoll 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ Membran</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td>Protokoll 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protokoll 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>ANT Technology</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protokoll 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-Methyladenosin)</td><td>Synaptische Systeme</td><td>202003</td><td>Protokoll 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Kaninchen IgG, HRP-gebunden gesamt Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protokoll 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protokoll 3.2.8</td></tr></tbody></table>

verfahren zum messen von rna<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in zellen und geweben

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Methyladenosin (m6A) Modifikationen der RNA sind vielfältig und bei Eukaryoten allgegenwärtig. Sie kommen in mRNA, rRNA, tRNA und microRNA vor. Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese reversiblen RNA-Modifikationen das Spleißen, die Translation, den Abbau und die Lokalisierung der RNA beeinflussen. Mehrere physiologische Prozesse wie zirkadiane Rhythmen, Pluripotenz von Stammzellen, Fibrose, Triglyceridstoffwechsel und Fettleibigkeit werden ebenfalls durch m6A-Modifikationen gesteuert. Immunpräzipitation/Sequenzierung, Massenspektrometrie und modifiziertes Northern Blot sind einige der Methoden, die üblicherweise zur Messung von m6A-Modifikationen eingesetzt werden. Im Folgenden stellen wir eine nordöstliche Blotting-Technik zur Messung von m6A-Modifikationen vor. Das derzeitige Protokoll bietet eine gute Größentrennung der RNA, eine bessere Anpassung und Standardisierung für verschiedene experimentelle Designs und eine klare Abgrenzung von m6A-Modifikationen in verschiedenen RNA-Quellen. Während bekannt ist, dass m6A-Modifikationen einen entscheidenden Einfluss auf die menschliche Physiologie in Bezug auf zirkadiane Rhythmen und Fettleibigkeit haben, sind ihre Rollen in anderen (patho)physiologischen Zuständen unklar. Untersuchungen zu m6A-Modifikationen haben daher ein immenses Potenzial, wichtige Einblicke in die molekulare Physiologie zu liefern.

Nach 14 Tagen im normalen Licht-Dunkel-zirkadianen Phase, die Wildtyp-Mäuse wurden in konstanter Dunkelheit platziert. Die RNAs aus der Leber wurden bei 4 Stunden Intervallen abgetastet und mit modifiziertem Northern-Blotting untersucht. Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleine RNAs wurden eindeutig nachgewiesen (Figur 2). Der Vergleich zwischen den verschiedenen Tageszeiten (CT) kann genau mit der 18S rRNA-Standard berechnet werden. Es gab robuste zirkadiane Oszillation von m 6 A - Spiegel in rRNA, mRNA und kleinen RNAs. Um die Störungen zu vermeiden, indem rRNA dargebotene kann polyadenylierte RNA gereinigt werden, wie es in Schritt 1.2.2. Nach der Reinigung kann die rRNA weitgehend eliminiert zur besseren Visualisierung der anderen RNAs (Figur 3) zu ermöglichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Abbildung 1: Die Blot-Transfereinheit zusammenbauen. Die kapillare Übertragungseinheit für die RNA an die Membran-Blotting gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Abbildung 2: Circadian Rhythmus der m 6 A - Spiegel in C57BL / 6J - Mäusen. Diese Abbildung zeigt die m 6 A - Blot von Gesamt - RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen am ersten Tag des Dunkeldunkelphase nach 14 Tagen einer normalen Hell-Dunkel - Phase bei 4 h Intervallen geopfert. Die Quantifizierung wurde mit der m getan 6 A Bilddichteunterschied zwischen 18S und 28S rRNA. Die m 6 A Fluss wurde am Boden mit dem 18S - rRNA - Band aus dem Formaldehyd - Gel normalisiert.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die m 6 A Blots mit oder ohne rRNA. Representative m 6 A - Blots von Gesamt - RNA und polyadenylierte RNA aus der Leber von Wildtyp - Mäusen gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x MOPS-Puffer (pH 7,0, vor Licht schützen) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41,85 </td><td> G </td><td> 0,2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Natriumacetat </td><td> 4.1 </td><td> G </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, Dinatriumsalz </td><td> 3.7 </td><td> G </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Gesamt </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rühre bei Raumtemperatur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x SSC-Puffer (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Kochsalz </td><td> 175,3 </td><td> G </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Trinatriumcitrat </td><td> 88.3 </td><td> G </td><td> 0,3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Gesamt </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rühre bei Raumtemperatur, dann autoklaviert </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Tracking-Dye </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS-Puffer </td><td> 500 </td><td> ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0,75 </td><td> G </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Bromphenolblau </td><td> 0,01 </td><td> G </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Xylencyanol </td><td> 0,01 </td><td> G </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Gesamt </td><td> 5 </td><td> ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Lagerung bei -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Verdünnen Verhältnis bei 1: 1000 von DEPC in ddH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rühre über Nacht bei Raumtemperatur, dann autoklaviert </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> Probenpuffer (vor Licht schützen) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS-Puffer </td><td> 200 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% Formaldehyd </td><td> 270 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Formamid </td><td> 660 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Lagerung bei -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tabelle 1: Puffer und Lösungen.

Modifiziertes Northern - Blotting - Verfahren für N 6 -methyladenosine (m 6 A) Änderungen in RNA Messung beschrieben. Die aktuelle Methode können Änderungen in diversen RNAs und Kontrollen unter verschiedenen experimentellen Designs erkennen.

Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Das übergeordnete Ziel der modifizierten Northern-Blot-Technik besteht darin, N6-Methyladenosin-, n6A-Modifikationen in RNA zu messen und Modifikationen in verschiedenen RNAs nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Rolle der RNA-Epigenetik, wie beispielsweise N6-Methyladenosin-Modifikationen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine effektive Trennung der RNA, eine bessere Standardisierung für experimentelle Versuchsdesigns sowie eine klare Abgrenzung der n6A-Modifikation in RNAs ermöglicht.Diese Methode kann Einblicke in n6A-Modifikationen in RNA gewähren und kann auch auf andere RNA-Modifikationen mit unterschiedlichen Nachweisantikörpern angewendet werden. Um das Experiment zu beginnen, sprühen Sie eine Ribonuklease-Entkontaminationslösung auf Papierhandtücher und wischen Sie die Pipetten sowie die Laborbankoberflächen ab. Befeuchten Sie die Papierhandtücher mit nukleasefreiem Wasser und wischen Sie die Pipetten sowie die Laborbankoberflächen erneut ab.RNA-Isolationslösung, die bei vier Grad Celsius aufbewahrt wurde, entnehmen und ein Milliliter dieser Lösung zu etwa 75 Milligramm Mausgewebe hinzufügen. Das Gewebe mit einem Rührwerk homogenisieren. Anschließend 100 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan oder BCP pro Milliliter der Probenhomogenat hinzufügen.Schütteln Sie die Röhrchen kräftig für 15 Sekunden und fahren Sie mit der Isolierung der gesamten RNA fort. Bestimmen Sie mithilfe eines Spektrophotometers die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 Nanometern und 280 Nanometern messen. Überprüfen Sie die Qualität der RNA-Probe durch Durchführung einer 0,8 %igen Agarose-Gelelektrophorese.Spülen Sie die gesamte Elektrophorese-Ausrüstung mit Diethylpyrocarbonat oder DEPC-Wasser. Geben Sie 2,5 Gramm Agarose und anschließend 215 Milliliter DEPC-Wasser in einen Erlenmeyerkolben und schmelzen Sie die Mischung vollständig in einer Mikrowelle. Nach dem Schmelzen der Lösung fügen Sie 12,5 Milliliter 10X MOPS-Puffer hinzu.Und 22,5 Milliliter 37 % Formaldehyd zum Kolben geben. Dann die Lösung in die Elektrophoreseapparatur mit einem 1,5 Millimeter dicken Kamm gießen. Mit einem sauberen Kamm die Blasen an die Ränder des Gels schieben.Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren. Spülen Sie anschließend die Vertiefungen des Gels mit zuvor hergestelltem 1X MOPS-Laufpuffer und führen Sie einen Vorlauf des Gels durch. Geben Sie die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels und führen Sie dann den Elektrophoreselauf durch.Am nächsten Tag das Gel unter UV-Licht untersuchen und fotografieren. Zum Vorbereiten des Transfers das Gel zuschneiden und den ungenutzten Teil entfernen. 500 Milliliter 10X Salin-Natriumcitrat- oder SSC-Puffer herstellen.Waschen Sie das Gel zweimal mit 10X SSC-Puffer. Schneiden Sie ein Filterpapier groß genug zu, um das Gel abzudecken. Schneiden Sie vier Stücke Filterpapier auf die gleiche Größe wie das Gel zu. Schneiden Sie als Nächstes ein Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel zu. Markieren Sie eine Kerbe am Gel und an der Membran als Orientierungshilfe, um die korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Tauchen Sie die Membran in 2X SSC-Puffer ein.Geben Sie 500 Milliliter 10X SSC-Puffer in die Transferwanne. Legen Sie das große Filterpapierblatt über die Glasplatte und benetzen Sie das Filterpapier mit Transferpuffer. Anschließend verwenden Sie eine Pipette, um eventuelle Blasen herauszurollen.Befeuchten Sie zwei Stücke vorgeschnittener Filterpapier in Transferpuffer und legen Sie sie in die Mitte des Filterpapiers. Entfernen Sie eventuelle Blasen. Legen Sie dann das Gel mit der Oberseite nach unten auf das Filterpapier und platzieren Sie die Membran auf dem Gel, wobei Sie sicherstellen, dass die Kerben des Gels und der Membran ausgerichtet sind.Als Nächstes zwei Stücke vorgeschnittener Filterpapier auf die Membran legen. Eventuelle Blasen zwischen den Schichten entfernen. Plastikfolie um das Gel geben, um sicherzustellen, dass die Tücher nur Puffer aufnehmen, der durch das Gel und die Membran hindurchtritt.Dann stapeln Sie Papiertücher auf das Filterpapier. Legen Sie eine übergroße Glasplatte auf die Tücher, setzen Sie ein Gewicht auf den Stapel und lassen Sie die RNA über Nacht aus dem Gel auf die Membran übergehen. Nach dem Transfer halten Sie die Membran in 2X SSC-Puffer feucht.Tauchen Sie zwei Filterpapierblätter in 10X SSC-Puffer ein und legen Sie die Blätter anschließend in den UV-Vernetzer. Achten Sie darauf, dass die Seite mit der absorbierten RNA nach oben zeigt, und legen Sie dann die Membran auf das Filterpapier. Wählen Sie den automatischen Vernetzungsmodus aus und drücken Sie die Starttaste, um die Bestrahlung zu beginnen.Überprüfen Sie die Membran und das Gel mit einem UV-Gelbildaufnahmesystem, um die RNA-Übertragung vom Gel auf die Membran zu bestätigen. Blockieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 5 % fettfreier Milch in TBST-Puffer. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius in der m6A-Antikörperlösung.Am nächsten Tag die Membran dreimal für jeweils 15 Minuten mit TBST-Puffer waschen. Anschließend die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur in der mit HRP konjugierten Esel-anti-Kaninchen-Antikörper-Lösung inkubieren. Nach einer Stunde die Membran dreimal für jeweils 15 Minuten mit TBST-Puffer waschen.Tragen Sie das verbesserte Chemilumineszenz-Substrat auf. Erfassen Sie die Chemilumineszenz mit einem digitalen Bildgebungssystem. Schreiten Sie abschließend zur m6A-Quantifizierung fort und messen Sie die relative m6A-Chemilumineszenzintensität mithilfe von ImageJ. Mausleber-RNAs wurden in Vier-Stunden-Abständen entnommen und mit der modifizierten Northern-Blotting-Technik untersucht.Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleinen RNAs wurde eindeutig nachgewiesen. Repräsentative m6A-Blots wurden für Gesamt-RNA und RNA ohne rRNA aus Lebern von Wildtyp-Mäusen durchgeführt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der RNA-Epigenetik den Weg, um Auswirkungen auf die menschliche Physiologie im Zusammenhang mit dem circadianen Rhythmus und Adipositas zu untersuchen.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier haben wir ein Protokoll für die biochemische Charakterisierung der Hefe RNA-modifizierende Enzym, Mod5, beschreiben und diskutieren, wie dieses Protokoll auf andere RNA-modifizierende Enzyme angewendet werden könnte.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

Hier stellen wir ein Protokoll zur DNAzyme-abhängigen Spaltung der RNA vor. Dies ermöglicht eine schnelle und standortabhängige Analyse der RNA 2'-O-Methylierung. Dieser Ansatz kann für die vorläufige oder größere Bewertung der SnoRNA-Aktivität verwendet werden.

DNAzyme-abhängige Analyse der rRNA 2'-O-Methylierung

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m5C Modifikation bei Arabidopsis

Eine präzise und reproduzierbare Methode zur in vivo Nukleoside/Nukleotidquantifizierung in Pflanzen wird hier beschrieben. Diese Methode verwendet eine HPLC-MS/MS.

Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und quantitative Messung von freiem und proteingebundenem Arginin und Methyl-Argininen mittels 1H-NMR-Spektroskopie.

Erforschung des Arginin-Methyloms durch Kernspinresonanzspektroskopie

Posttranskriptionelle Modifikationen der RNA stellen eine wenig untersuchte Schicht der Translationsregulation dar, die kürzlich mit der Plastizität des zentralen Nervensystems in Verbindung gebracht wurde. Hier wird die Probenvorbereitung und der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Ansatz zur gleichzeitigen Charakterisierung zahlreicher RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen beschrieben.

Charakterisierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen mittels Massenspektrometrie

Das Protokoll enthält Anweisungen zur Modifizierung von RNA mit Dimethylsulfat für Mutationsprofilierungsexperimente. Es umfasst in vitro und in vivo Sondierung mit zwei alternativen Bibliothekspräparationsmethoden.

Untersuchung der RNA-Struktur mit Dimethylsulfat-Mutationsprofilierung mit Sequenzierung in vitro und in Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um globale m⁶A-Niveaus halb-quantitativ mittels Dot-Blot zu bewerten. Total RNA wird extrahiert, denaturiert, auf einer Nylonmembran gespottet, mit Anti-m⁶A-Antikörper untersucht und durch Chemilumineszenz visualisiert. Die Signalintensität, quantifiziert durch die ImageJ-Graustufenanalyse, spiegelt die relative Methylierungshäufigkeit wider und bietet so einen reproduzierbaren Forschungsfluss.

Dot-Blot-Assay zur Erkennung globaler N6-Methyladenosin-RNA-Modifikationsniveaus

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Ansatz zur Bewertung derm6A-Modifikationsniveaus spezifischer RNA mittels MeRIP-qPCR.

MeRIP-qPCR-Assay zur Erkennung vonm6A-Modifikationsniveaus spezifischer RNA in Osteosarkomzellen

Lernen Sie eine modifizierte Northern-Blot-Methode zur Detektion von N6-Methyladenosin-Modifikationen in RNA aus Mausgewebe. Diese Technik ermöglicht die effiziente Analyse verschiedener RNA-Typen für epigenetische Forschung.

Verfahren zum Messen von RNA

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