Verfahren zum Messen von RNA N 6 -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben
5. Dezember 2016
Modifiziertes Northern - Blotting - Verfahren für N 6 -methyladenosine (m 6 A) Änderungen in RNA Messung beschrieben. Die aktuelle Methode können Änderungen in diversen RNAs und Kontrollen unter verschiedenen experimentellen Designs erkennen.
Das übergeordnete Ziel der modifizierten Northern-Blotting-Technik ist es, N6-Methyladenosin, n6A-Modifikationen in RNA zu messen und Modifikationen in verschiedenen RNAs nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zur Rolle der RNA-Epigenetik zu beantworten, wie z. B. N6-Methyladenosin-Modifikationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effektive Trennung von RNA, eine bessere Standardisierung für experimentelle Designs und eine klare Abgrenzung der n6A-Modifikation in RNAs ermöglicht.
Diese Methode kann Einblicke in n6A-Modifikationen in RNA geben und sie kann auch auf andere RNA-Modifikationen mit unterschiedlichen Nachweisantikörpern angewendet werden. Sprühen Sie zu Beginn des Experiments Ribonuklease-Dekontaminationslösung auf Papiertücher und wischen Sie die Pipetten und die Oberflächen des Labortisches ab. Befeuchten Sie die Papiertücher mit nukleasefreiem Wasser und wischen Sie die Pipetten und die Oberflächen des Labortisches erneut ab.
Besorgen Sie sich eine RNA-Isolierungslösung, die bei vier Grad Celsius gehalten wird, und geben Sie einen Milliliter der Lösung zu etwa 75 Milligramm Mausgewebe. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das Gewebe zu homogenisieren. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan oder BCP pro einem Milliliter Probenhomogenat hinzu.
Schütteln Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig und fahren Sie mit der vollständigen RNA-Isolierung fort. Bestimmen Sie mit einem Spektralphotometer die RNA-Konzentration, indem Sie die Extinktion bei 260 Nanometern und 280 Nanometern notieren. Überprüfen Sie die Qualität der RNA-Probe, indem Sie eine 0,8%ige Agarose-Gelelektrophorese durchführen.
Spülen Sie alle Elektrophoresegeräte mit Diethylpyrocarbonat oder DEPC-Wasser. 2,5 Gramm Agarose, dann 215 Milliliter DEPC-Wasser in einen Erlenmeyerkolben geben und die Mischung in der Mikrowelle vollständig schmelzen. Nachdem die Lösung geschmolzen ist, fügen Sie 12,5 Milliliter 10X MOPS-Puffer hinzu.
Und 22,5 Milliliter 37%iges Formaldehyd in den Kolben. Gießen Sie dann die Lösung mit einem 1,5 Millimeter dicken Kamm in das Elektrophoresegerät. Schiebe die Blasen mit einem sauberen Kamm an die Ränder des Gels.
Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren. Verwenden Sie anschließend den zuvor vorbereiteten 1X MOPS-Laufpuffer, um die Vertiefungen des Gels zu spülen und das Gel vorzulaufen. Laden Sie die RNA-Proben in die Vertiefungen des Gels und lassen Sie das Gel dann laufen.
Untersuchen und fotografieren Sie das Gel am nächsten Tag unter UV-Licht. Um den Transfer vorzubereiten, schneiden Sie das Gel ab und entfernen Sie den nicht verwendeten Teil. Bereiten Sie 500 Milliliter 10X Kochsalzlösungs-Natriumcitrat oder SSC-Puffer vor.
Waschen Sie das Gel zweimal mit 10X SSC-Puffer. Schneiden Sie ein Filterpapierblatt ab, das groß genug ist, um das Gel zu bedecken. Schneide vier Stücke Filterpapier auf die gleiche Größe wie das Gel zu.
Schneiden Sie als Nächstes ein Blatt positiv geladene Nylonmembran auf die gleiche Größe wie das Gel zu. Markieren Sie eine Kerbe auf dem Gel und der Membran als Markierung, um die richtige Ausrichtung zu gewährleisten. Weichen Sie die Membran in 2X SSC-Puffer ein.
Gießen Sie 500 Milliliter 10X SSC-Puffer in die Transferschale. Legen Sie das große Filterpapierblatt über die Glasplatte und befeuchten Sie das Filterpapier mit Transferpuffer. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Blasen auszurollen.
Tränken Sie zwei Stücke vorgestanztes Filterpapier in Transferpuffer und legen Sie sie in die Mitte des Filterpapiers. Entfernen Sie alle Blasen. Legen Sie dann das Gel mit der Oberseite nach unten auf das Filterpapier und legen Sie die Membran auf das Gel, wobei Sie darauf achten, dass die Kerben des Gels und der Membran ausgerichtet sind.
Legen Sie anschließend zwei Stücke vorgestanztes Filterpapier auf die Membran. Entfernen Sie alle Blasen zwischen den Schichten. Tragen Sie Plastikfolie um das Gel auf, um sicherzustellen, dass die Handtücher nur Puffer aufsaugen, der durch das Gel und die Membran gelangt.
Stapeln Sie dann Papiertücher auf das Filterpapier. Legen Sie eine übergroße Glasplatte auf die Handtücher, legen Sie ein Gewicht auf den Stapel und lassen Sie die RNA über Nacht vom Gel auf die Membran übertragen. Halten Sie die Membran nach dem Transfer in 2X SSC-Puffer feucht.
Tauchen Sie zwei Blatt Filterpapier mit 10x SSC-Puffer ein und legen Sie die Blätter dann in den UV-Vernetzer. Stellen Sie sicher, dass die RNA-absorbierte Seite nach oben zeigt, und legen Sie dann die Membran auf das Filterpapier. Wählen Sie den Auto-Cross-Link-Modus und drücken Sie die Starttaste, um die Bestrahlung zu starten.
Untersuchen Sie die Membran und das Gel mit einem UV-Gel-Bildfänger, um den RNA-Transfer vom Gel zur Membran zu bestätigen. Blockieren Sie die Membran in 5%iger fettfreier Milch in TBST-Puffer bei Raumtemperatur für eine Stunde. Inkubieren Sie die Membran über Nacht in m6A-Antikörperlösung bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal 15 Minuten lang mit TBST-Puffer. Inkubieren Sie anschließend die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der HRP-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran nach einer Stunde dreimal 15 Minuten lang mit TBST-Puffer
.Tragen Sie das verstärkte Chemilumineszenzsubstrat auf. Erfassen Sie die Chemilumineszenz mit einem digitalen Imager. Fahren Sie schließlich mit der m6A-Quantifizierung fort und messen Sie die relative m6A-Chemilumineszenzintensität mit Hilfe von Bild J. Maus-Leber-RNAs wurden in vierstündigen Intervallen entnommen und mit der modifizierten Northern-Blotting-Technik untersucht.
Die Methylierung von rRNAs, mRNAs und kleinen RNAs konnte eindeutig nachgewiesen werden. Repräsentative m6A-Blots wurden für Gesamt-RNA und ohne rRNA aus der Leber von Wildtyp-Mäusen durchgeführt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Epigenetik, um die Auswirkungen auf die menschliche Physiologie im Zusammenhang mit dem zirkadianen Rhythmus und Fettleibigkeit zu untersuchen.
Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine modifizierte Northern-Blotting-Methode zur Messung von N6-Methyladenosin (m6A) Modifikationen in RNA. Die Technik ermöglicht die Erkennung von Modifikationen in verschiedenen RNA-Proben und ist unter verschiedenen experimentellen Designs anwendbar.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- RNA-Epigenetik
- m6A-Modifikationen
- Experimentelle Techniken
Hintergrund
- N6-Methyladenosin ist eine bedeutende RNA-Modifikation.
- Das Verständnis von RNA-Modifikationen ist entscheidend für Einblicke in die Genregulation.
- Aktuelle Methoden zum Nachweis von m6A sind begrenzt.
- Diese modifizierte Technik zielt darauf ab, die Erkennung und Analyse zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Erkennung von m6A-Modifikationen in RNA zu entwickeln.
- Das Verständnis der RNA-Epigenetik zu verbessern.
- Einen standardisierten Ansatz für verschiedene experimentelle Designs bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- RNA-Isolierung aus Mausgewebe.
- Elektrophorese zur Qualitätsbewertung von RNA.
- Transfer von RNA auf eine Nylonmembran.
- Erkennung mithilfe von m6A-Antikörpern und Chemilumineszenz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erkennung von m6A-Modifikationen in rRNAs, mRNAs und kleinen RNAs.
- Klare Abgrenzung von m6A-Modifikationen in verschiedenen RNA-Proben.
- Die Technik kann effizient innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte Northern-Blotting-Technik ist effektiv für die Untersuchung von RNA-Modifikationen.
- Diese Methode eröffnet Möglichkeiten für die Forschung in der RNA-Epigenetik.
- Potenzielle Anwendungen umfassen Studien zu zirkadianen Rhythmen und Fettleibigkeit.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of RNA N6-methyladenosine (m6A) modifications supports target validation in RNA epigenetics by enabling quantitative assessment of epitranscriptomic regulation. This method enhances predictive confidence in mechanistic studies linking m6A to physiological processes such as circadian rhythms and metabolism. It provides a standardized, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of m6A-dependent RNA stability, translation, and splicing to clarify functional roles of epigenetic regulators in gene expression networks.
- Operational Value: Provides clear delineation of m6A across RNA species, supporting biomarker-relevant target identification in disease models.
- Predictive Value: Facilitates dose-response and time-course analysis of m6A levels, improving confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chemiluminescent readouts compatible with high-resolution imaging for comparative analysis across experimental conditions.
- Operational Value: Standardizes RNA transfer and detection via nylon membrane and antibody-based probing, reducing variability in modification profiling.
- Assay Readiness: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified RNA controls, supporting assay validation for epigenetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links m6A dynamics in liver RNA to metabolic and circadian phenotypes, supporting translational biomarker exploration in preclinical models.
- Operational Value: Permits longitudinal sampling (e.g., four-hour intervals) to capture temporal modification patterns relevant to physiological rhythms.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in RNA modification measurements, improving reproducibility in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing epigenetic layer validation that complements transcriptional and proteomic profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of m6A writers, erasers, and readers through direct measurement of modification status in RNA.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assessing compound effects on epitranscriptomic marks in cell-based or tissue-derived systems.
- Analytics: Enables image-based quantification of m6A signal intensity, facilitating statistical comparison across treatment groups or genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects epigenetic changes in RNA to physiological outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical progression.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various RNA types and modification-specific antibodies, allowing reuse across multiple epigenetic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA epigenetic targets through direct, modification-specific detection.
- Operational Value: Standardized workflow with defined transfer, blocking, and detection steps ensuring inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the functional relevance of m6A in disease-relevant pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on quantifiable modification dynamics.
Implementation Considerations
- Expertise in RNA handling, electrophoresis, and immunoblotting techniques is required.
- Instrumentation includes UV crosslinker, digital imager, and spectrophotometer for RNA quantification.
- Standardization across teams requires consistent use of DEPC-treated solutions and controlled transfer conditions.
- Adaptation to other RNA modifications depends on availability of specific modification-recognizing antibodies.
- Practical limitations include RNA degradation risk and the need for optimization of antibody incubation and washing conditions.
