Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen
11. November 2016
Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion
.Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die parallele Beurteilung der zirkadianen Biolumineszenz und der sekretorischen Aktivität von humanen primären endokrinen Zellen, die en vitro kultiviert und synchronisiert werden. Diese Methode kann helfen, das zeitliche Muster der Zellsekretion zu untersuchen und wie es durch zellautonome zirkadiane Uhren reguliert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die zirkadianen Luciferine als Reporteraktivität zu überwachen und gleichzeitig das Ausflussmedium zu sammeln, um die Spiegel der sezernierten Hormone und Myokine zu messen. Um zirkadiane Biolumineszenz-Reporter durch lentivirale Transduktion in die Primärzellen einzuführen, werden zunächst die 3,5 cm großen Petrischalen mit humanen Myoblasten mit einer Konfluenz von 30 % bis 50 % in einen Laminar-Flow-Schrank überführt. Ersetzen Sie das humane Myoblastenmedium durch 2 ml Wachstumsmedium. Transduzieren Sie dann die primäre Zellkultur, indem Sie Lentiviruslösung in die Schale pipettieren, um eine Infektionsvielfalt von gleich drei zu erhalten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium. Um eine En-vitro-Synchronisation zu erreichen, fügen Sie 10 mikromolare Adenylylcyclase-Aktivatoren in 2 ml Medium pro 3,5 cm Petrischale hinzu, die die zuvor transfizierten Primärzellen enthält. Inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei 37
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Übersicht
Diese Studie beschreibt Methoden zur Überwachung der zirkadianen Biolumineszenz neben der sekretorischen Aktivität menschlicher Inselzellen und primärer Myotuben. Der Ansatz beinhaltet die lentivirale Genübertragung eines Luciferase-Core-Clock-Reporters, gefolgt von der In-vitro-Synchronisation und kontinuierlichen Zellperifusion zur Mediumsammlung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Chronobiologie
Hintergrund
- Zirkadiane Rhythmen spielen eine entscheidende Rolle bei zellulären Funktionen.
- Die Überwachung der Biolumineszenz kann Einblicke in die zelluläre Aktivität geben.
- Menschliche Inselzellen sind für die Insulinsekretion lebenswichtig.
- Primäre Myotuben sind wichtig für die Untersuchung der Muskelphysiologie.
Ziel der Studie
- Die Beziehung zwischen zirkadianen Rhythmen und sekretorischer Aktivität zu untersuchen.
- Eine Methode zur Echtzeit-Überwachung zellulärer Funktionen zu entwickeln.
- Das Verständnis von Stoffwechselprozessen in menschlichen Zellen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Lentivirale Genübertragung für die Luciferase-Reporter-Expression.
- In-vitro-Synchronisation von Zellkulturen.
- Kontinuierliche Perifusion zur Mediumsammlung.
- Biolumineszenzmessung zur Beurteilung zirkadianer Rhythmen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Überwachung der zirkadianen Biolumineszenz in menschlichen Inselzellen.
- Nachgewiesene sekretorische Aktivität von primären Myotuben.
- Eine zuverlässige Methode zum Studium zellulärer Rhythmen etabliert.
- Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zirkadianer Biologie und zellulärer Funktion gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen neuartigen Ansatz zur Echtzeit-Überwachung zellulärer Aktivitäten.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis zirkadianer Einflüsse auf den Stoffwechsel bei.
- Potenzielle Anwendungen in der Diabetesforschung und Muskelphysiologie.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures enables direct interrogation of temporal regulation in human endocrine and muscle systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by linking molecular circadian oscillators to functional secretory outputs. Integrating these measurements at the discovery stage supports risk-adjusted advancement of metabolic and chronobiology programs across the portfolio.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by correlating clock gene activity with hormone and myokine secretion in primary human cells.
- Supports functional target validation by disrupting core clock genes and quantifying downstream secretory effects.
- Facilitates predictive confidence in pathway selection for metabolic and endocrine targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, synchronized primary cell systems for robust assay development.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts of both gene expression and secretory activity.
- Enables reproducible assessment of compound or genetic perturbation effects on circadian-regulated outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human physiology by using primary islet and muscle cells.
- Supports translational biomarker discovery by linking molecular clock disruption to functional secretion phenotypes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in metabolic and chronobiology research.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of circadian regulation in human primary cells, supporting both target validation and translational continuity.
- Discovery Biology: Allows direct testing of circadian gene function and its impact on secretory pathways.
- Screening: Provides synchronized, assay-ready primary cell models with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates time-resolved bioluminescence and secretion data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular clock perturbation to disease-relevant secretory phenotypes in human cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating circadian regulation across diverse primary cell types and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes long-term, parallel measurement workflows in primary human cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular and functional outputs in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and chronobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, primary cell culture, and bioluminescence measurement.
- Needs access to synchronized perifusion systems and sensitive hormone/myokine assays.
- Demands cross-team standardization for reproducible time-course data collection.
- Adaptation may be needed for different primary cell types or secretory endpoints.
- Long-term culture and reporter stability must be validated for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
