Unter Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure, als Werkzeug Ethylen-Antwort in Bakterien zu studieren
10. November 2016
Die hierin beschriebenen Protokolle erleichtern die bequeme Untersuchung bakterieller Ethylenreaktionen durch die Verwendung von 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA). Ethylen wird in situ durch die Zersetzung von CEPA in einem wässrigen bakteriellen Wachstumsmedium hergestellt, wodurch der Bedarf an reinem Ethylengas umgangen wird.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und sichere Methode zur Untersuchung der bakteriellen Reaktion auf Ethylen bereitzustellen. Diese Methode wird zentrale Fragen zu Pflanze-Mikrobe-Interaktionen beantworten, beispielsweise welche Rolle Ethylen bei der bakteriellen Adhäsion und Kolonisation von Pflanzen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist und sie deutlich sicherer ist als das Arbeiten mit gasförmigem Ethylen im Labor.
Obwohl diese Methode Einblicke darüber geben kann, wie die Produktion bakterieller Cellulose durch Ethylen beeinflusst wird, kann sie auch auf andere pflanzenassoziierte Mikroorganismen angewendet werden, um in vitro zu untersuchen, wie ethylenvermittelte Prozesse an der Besiedlung von Pflanzen beteiligt sind. Bereiten Sie zur Vorbereitung 100 Milliliter Wachstumsmedium für die Arabidopsis-Keimlinge und 100 Milliliter bakterielles Wachstumsmedium für den CEPA-Abbau vor. Sobald das Arabidopsis-Medium abgekühlt ist, entnehmen Sie 40 Milliliter in einen sterilen Kolben und ergänzen die Portion mit 40 Mikrolitern einer 10-Millimolar-ACC-Lösung.
Beladen Sie nun die Plattenquadranten mit je fünf Millilitern Medium und lassen Sie das Agar erstarrten. Gegenüberliegende Quadranten aller Platten enthalten jeweils Bakterienwachstumsmedium und Arabidopsis-Medium. Verwenden Sie drei verschiedene Medium-Konfigurationen.
Die CEPA-Behandlung erfolgt später im Protokoll. Bereiten Sie jede Plattenkonfiguration im Dreifachansatz vor. Sobald das Agar abgekühlt ist, verteilen Sie etwa 50 Samen gleichmäßig auf jedes Viertel des Arabidopsis-Mediums.
Anschließend die Platten drei bis vier Tage lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Später, nach der Inkubation der Samen, diesen zwei Stunden lang Fluoreszenzlicht aussetzen. Danach 10 Mikroliter einer 500 Millimolar CEPA-Stammlösung auf das bakterielle Agar einer Plattenanordnung auftragen.
Die endgültige CEPA-Konzentration im Agar beträgt ein Millimolar. Versiegeln Sie nun alle Platten mit Laborfolie und wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein. Anschließend stellen Sie die Platten für drei Tage bei 23 Grad Celsius im Dunkeln mit der Agarseite nach unten zur Keimung der Samen.
Nachdem die Samen gekeimt sind, verwenden Sie mit der Flamme sterilisierte Pinzetten, um die Keimlinge entsprechend jeder Behandlung zu entfernen. Wählen Sie 30 Keimlinge aus jedem Quadranten, insgesamt 180 pro Behandlung. Bilden Sie die Keimlinge unter einem Stereomikroskop oder mit einer hochauflösenden Digitalkamera vor schwarzem Hintergrund neben einem Maßstab zur Größenbestimmung ab.
Messen Sie anschließend die Hypokotyllänge mit der ImageJ-Software. Verwenden Sie das gerade Linien-Werkzeug, um 10 Millimeter zu messen, und wählen Sie im Reiter „Analyze“ die Option „Set Scale“, um den Maßstab festzulegen. Anschließend messen Sie mithilfe des Werkzeugs „Segmented Line“ unter dem „Straight Line“-Werkzeug jeden Hypokotyl und drücken Sie „M“, um deren Längen zu berechnen.
Der Pellicle-Test ist ein Standardanalyseverfahren zur Untersuchung der bakteriellen Celluloseproduktion. pH- und morphologische Analysen sind im Sex-Protokoll beschrieben. Bereiten Sie dazu Zellen aus Starterkulturen im Dreifachansatz auf und quantifizieren Sie die Zellen mit einer Petroff-Hauser-Zählkammer.
Danach bereiten Sie vier mittlere Master-Mischungen mit unterschiedlichen CEPA-Konzentrationen vor. Für jede Master-Mischung pipettieren Sie 60 Milliliter pH-7-SH-Medium um und geben 120 Mikroliter entweder null, fünf, 50 oder 500 Millimolar CEPA-Stammlösung hinzu, um endgültige CEPA-Konzentrationen von null, 0,1, 0,1 oder 1,0 Millimolar zu erhalten. Mischen Sie diese Medien durch Schwenken der Kolben.
Es wird ein Mediensatz für jede der Triplikate sowie ein vierter Satz als steriler Kontrolle benötigt. Teilen Sie daher jede 60-Milliliter-Medienzubereitung in vier 14-Milliliter-Aliquote auf. Kühlen Sie die 14-Milliliter-Aliquote anschließend vor, bevor sie mit den jeweiligen Startkulturen inoculiert werden, um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Halten Sie alle beimpften Röhrchen auf Eis, um die Zelluloseproduktion zu verhindern. Verwenden Sie die restlichen 14 Milliliter Eluate für sterile Kontrollbrunnen. Laden Sie nun aus jedem 14-Milliliter-Master-Mix jeweils 2-Milliliter-Portionen in sechs Brunnen einer sterilen 24-Loch-Platte, insgesamt vier beladene Platten pro analysierter Starterkultur.
Versiegeln Sie die Platten vorsichtig mit Parafilm und inkubieren Sie sie sieben Tage lang statisch bei 30 Grad Celsius. Inkubieren Sie währenddessen parallel eine 25-Milliliter-Flüssigkultur, um periodisch die Säure des Mediums zu messen. Wenn die Säure unter einen pH-Wert von fünf fällt, hemmt das Wachstum des Organismus die Zersetzung von CEPA zu Ethylen und ist daher mit diesem Test unvereinbar.
Eine Woche später werden das feuchte Gewicht, die Dicke, das Trockengewicht und die Kristallinität des Pellicles erfasst. Um ein Pellicle aus der Platte zu entnehmen, drücken Sie eine Seite des Pellicles nach unten, um die gegenüberliegende Kante anzuheben, und heben Sie es mit einer Pinzette auf. Halten Sie es weiterhin mit der Pinzette fest und legen Sie es für drei Sekunden auf ein frisches Papiertuch, um überschüssiges Medium zu entfernen.
Danach jede Pellicula wiegen und dies als Feuchtgewicht erfassen. Anschließend die Pelliculae entlang eines Lineals ausrichten und mit einer hochauflösenden Digitalkamera von der Seite fotografieren. Analysieren Sie diese Fotos hinsichtlich der Dicken der Pelliculae.
Als Nächstes überführen Sie die Pellicles einzeln in die Vertiefungen einer Sechslochplatte. Behandeln Sie sie 20 Minuten lang mit 12 Milliliter 0,1 normaler Natronlauge bei 80 Grad Celsius, um die Zellen aufzulösen. Entfernen Sie anschließend die Natronlauge und neutralisieren Sie die behandelten Pellicles, indem Sie sie gründlich 24 Stunden lang unter Schütteln mit je 12 Milliliter ultrareinem Wasser in einer Sechslochplatte waschen.
Während dieser Inkubation das Wasser alle sechs Stunden wechseln. Am Ende der Inkubation sollten die Pellicles weiß sein. Anschließend die Pellicles auf Silikonmatten geben und 48 Stunden bei 50 Grad Celsius trocknen, um sie für die Trockengewichtsbestimmung vorzubereiten.
Die Kristallinität der Pellicles kann mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie analysiert werden. Im Dunkeln gezogene Sämlinge von Arabidopsis thaliana zeigten das Triple-Response-Phänotyp mit einem kurzen, verdickten Hypokotyl und einer überbetonten apikalen Krümmung in Gegenwart von ACC sowie in Gegenwart von Ethylen, das durch die Zersetzung von CEPA auf SH-Medium gebildet wurde, nicht jedoch unter unbehandelten Bedingungen. Deutlich war die Hypokotyllänge der behandelten Samen signifikant geringer als die der unbehandelten Kontrollen.
Daher wurde Ethylen aus CEPA im SH-Medium in physiologisch relevanter Konzentration freigesetzt. Alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen verringerten signifikant das Feuchtwicht der Pellicle, beeinflussten jedoch die Pellicle-Dicke nicht, und alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen erhöhten signifikant das Trockenwicht der Pellicle. Außerdem wurde die Hydratation der Pellicle durch alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen vermindert.
Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den pH-Wert des Wachstumsmediums zu messen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert nicht unter fünf fällt, da sonst die Abbaureaktion von CEPA zu Ethylen gehemmt wird. Beachten Sie, dass pulverförmiges CEPA äußerst gefährlich für die Schleimhäute ist. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist stets die gebotene Vorsicht zu beachten.
Mithilfe dieser Technik können Forscher, die an Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Bakterien interessiert sind, ethylenvermittelte Reaktionen sicher in vitro untersuchen. Dies wird dazu beitragen, aufzuklären, wie pflanzliche Signale die Besiedlung und Adhäsion von Bakterien steuern. Derzeit ist dieser Forschungsbereich noch wenig erforscht.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung bakterieller Reaktionen auf Ethylen unter Verwendung von 2-Chloräthylphosphonsäure (CEPA) vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht die in-situ-Produktion von Ethylen auf sichere und praktische Weise und vermeidet die Notwendigkeit, mit gasförmigem Ethylen umzugehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Pflanzen-Mikroben-Interaktionen
- Ethylen-Signalübertragung
Hintergrund
- Ethylen ist ein entscheidender Pflanzenhormon, der an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt ist.
- Die bakterielle Adhäsion und Besiedlung von Pflanzen wird durch Ethylen beeinflusst.
- Traditionelle Methoden zur Untersuchung von Ethylen erfordern den Umgang mit gefährlichen Gasen.
- Diese Methode vereinfacht die Untersuchung der Wirkung von Ethylen auf Bakterien.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines sicheren Protokolls zur Untersuchung bakterieller Reaktionen auf Ethylen.
- Untersuchung der Rolle von Ethylen bei der bakteriellen Adhäsion und Kolonisation.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Wirkung von Ethylen auf die bakterielle Celluloseproduktion.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Nährmedien für Arabidopsis-Keimlinge und bakterielle Kulturen.
- Zugabe von 10 Millimolar ACC zum Nährmedium.
- Verwendung von CEPA zur Ethylenproduktion in bakteriellen Studien.
- In-vitro-Analyse pflanzenassoziierter Mikroorganismen.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die effektive Untersuchung der Rolle von Ethylen beim bakteriellen Verhalten.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis von Pflanzenbesiedlungsprozessen beitragen.
- Zeigt die Sicherheit und Einfachheit des Protokolls im Vergleich zu herkömmlichen Methoden auf.
- Anwendbar auf verschiedene pflanzenassoziierte Mikroorganismen jenseits der ursprünglichen Studie.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug für Forscher dar, die pflanzliche Interaktionen mit Mikroben untersuchen.
- Es erhöht die Sicherheit in Laborumgebungen, da der Bedarf an gasförmigem Ethylen entfällt.
- Zukünftige Studien können die Erkenntnisse zu den Auswirkungen von Ethylen auf Bakterien erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der ethylenvermittelten bakteriellen Reaktionen liefert mechanistische Einblicke in pflanzenmikrobielle Interaktionen, die für die agrarische Biotechnologie und das Mikrobiom-Engineering relevant sind. Diese Methode ermöglicht die sichere und skalierbare Untersuchung der Effekte gasförmiger Signalstoffe auf mikrobielle Phänotypen, ohne dass eine spezialisierte Infrastruktur zur Gasbehandlung erforderlich ist. Sie unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen in Entdeckungsplattformen, die auf wirtsassoziierten mikrobiellen Funktionen ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Ethylen als Signalmolekül bei bakteriellen Adhäsions- und Kolonisationsphänotypen.
- Operativer Wert: Verwendet CEPA, um physiologisch relevante Ethylenkonzentrationen in vitro zu erzeugen, und vermeidet so die Handhabung gefährlicher Gase.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum Einfluss von Pflanzenhormonen auf die Bildung mikrobieller Biofilme und die Oberflächenanheftung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Quantifiziert die Auswirkungen von Ethylen auf die Celluloseproduktion, die Pellicel-Morphologie und die Hydratationszustände als messbare Größen.
- Operativer Wert: Standardisiert die CEPA-Dosierung über verschiedene Konzentrationen hinweg (0–1 mM), um Dosis-Wirkungs-Beziehungen in mikrobiellen Assays zu etablieren.
- Skalierbarkeitswert: Kompatibel mit Mehrlochplattenformaten für das Hochdurchsatz-Screening ethylenresistenter Stämme.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Wert: Verbindet die Ethylen-Signalübertragung mit biofilmbasierten Merkmalen, die für die dauerhafte Besiedlung von Pflanzen und die mikrobielle Persistenz relevant sind.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob beobachtete Phänotypen auf Ethylen-Signalübertragung oder sekundäre pH- oder Toxizitätseffekte durch Mediumüberwachung zurückzuführen sind.
- Modellkontinuität: Verwendet Komagataeibacter xylinus als handhabbares System, das auf andere pflanzenassoziierte Mikroben in Entdeckungsworkflows übertragbar ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode eignet sich für frühe Entdeckungsphasen, in denen mikrobielle Reaktionen auf vom Wirt stammende Signale zur Zielvalidierung und Aufklärung von Signalwegen bewertet werden.
- Entdeckungsbiochemie: Untersucht die Rolle von Ethylen bei der Modulation der mikrobiellen Adhäsion, Biofilmbildung und kolonialen Morphologie anhand phänotypischer Messgrößen.
- Screening: Ermöglicht eine reproduzierbare, quantitative Beurteilung der Zelluloseproduktion und der Eigenschaften von Pellicles unter kontrollierter Ethylenexposition.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte wie Nass- und Trockengewicht, Dicke und Kristallinität für einen datengestützten Stammvergleich.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Ethyleneantwort mit möglichen Funktionen bei der Besiedlung von Pflanzen und Anwendungen in der Mikrobiom-Engineering.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine portable, reagenzienbasierte Ethylenquelle bereit, die in verschiedenen mikrobiellen Systemen und Wachstumsbedingungen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Mehrdeutigkeit bei der Zuschreibung phänotypischer Veränderungen auf Ethylen-Signalwege in Modellen der Wirt-Mikrobe-Interaktion.
- Operativer Wert: Macht Gasflaschen, Durchflusssysteme oder spezialisierte Kammern überflüssig und senkt damit die Sicherheitsanforderungen sowie die Komplexität des Aufbaus.
- Strategischer Wert: Verbessert die Zuversicht bei Ja/Nein-Entscheidungen, indem ethylen-spezifische Effekte von störenden Variablen in mikrobiellen Assays isoliert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung mikrobieller Zielstrukturen basierend auf deren Reaktion auf vom Wirt stammende hormonelle Signale.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert mikrobiologische Fachkenntnisse in steriler Technik, Kulturhandhabung und Durchführung phänotypischer Assays.
- Ist auf pH-stabile wässrige Bedingungen (pH ≥3,5) angewiesen, um eine zuverlässige Zersetzung von CEPA zu Ethylen sicherzustellen.
- Erfordert die Überwachung des Medium-pH-Werts, um eine Hemmung der Ethylenfreisetzung bei pH-Werten unter 5,0 während der Inkubation zu verhindern.
- Erfordert eine Anpassung der Wachstumsmedien und Phänotyp-Assays, wenn die Methode auf nicht zelluloseproduzierende mikrobielle Modelle ausgeweitet wird.
- Beinhaltet den sicheren Umgang mit pulverförmigem CEPA aufgrund seiner Gefährdung der Schleimhäute, was den Einsatz persönlicher Schutzausrüstung und von Eindämmungsmaßnahmen notwendig macht.
