Name: Unter Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure, als Werkzeug Ethylen-Antwort in Bakterien zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Lernen Sie eine sichere Methode zur Untersuchung bakterieller Ethylen-Antworten mit 2-Chlorethylphosphonsäure. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von Pflanze-Mikrobe-Interaktionen ohne gefährliche Gase.

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Die Autoren danken Dr. Dario Bonetta für die Bereitstellung von Arabidopsis thaliana-Samen und für die technische Unterstützung in Bezug auf den Triple-Response-Assay, sowie Simone Quaranta für die Hilfe bei FT-IR. Diese Arbeit wurde durch ein Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) an JLS, ein Ontario Graduate Scholarship (OGS) für RVA und ein Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) für AJV unterstützt.

1. Chemikalien <ol><li> Eine Lösung aus 500 mM CEPA (144.49 g / mol) und eine Lösung von sowohl aus 500 mM NaCl (58,44 g / mol) und 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in angesäuert (pH 2.5) von ultrareinem Wasser oder 0,1 N HCl. Mischen mit einem Vortex, bis die Lösungen klar sind. </li><li> Abwechselnd verdünnen (10x), die 500 mM Lösungen in dem gleichen Lösungsmittel 5 mM und 50 mM Bestände zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von 1-Aminocyclopropancarbonsäure (ACC; 101,1 g / mol) in ultrareinem Wasser. </li><li> Filter-sterilisieren Stammlösungen und speichern Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Filter-sterilisieren Cellulase. Store Aliquots bei 4 ° C. </li></ol> 2. Überprüfen der Ethylenproduktion von 2-Chlorethylphosphonsäure Zersetzung: Triple Antwort Assay <ol><li> Oberflächen sterilisieren Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia Seeds Mit der Vapor-Phase - Methode: ACHTUNG: Der folgende Schritt erzeugt toxic Chlorgas. Führen Saatgut Sterilisation in einem Abzug. <ol><li> Besorgen Sie sich einen verschließbaren Behälter tief genug, um einen 250-ml-Glasbecher für Saatgut Sterilisation aufzunehmen und es in einer Abzugshaube. </li><li> In A. thaliana Samen zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie den Schlauch in einem Rack. Legen Sie das Rack mit dem offenen Rohr in den verschließbaren Behälter enthält. Hinweis: Füllen Sie nicht einzelne Rohre über halb voll Chlorgas zu erlauben, die unteren Samen eindringen. </li><li> Legen Sie ein 250-ml-Becher 100 ml handelsübliche Bleiche in dem verschließbaren Behälter enthält. Vorsichtig 3 ml konzentrierter HCl zu dem Bleichmittel und sofort den Behälter mit dem Deckel zu versiegeln. ACHTUNG: Bleach und HCl reagieren und giftige Chlorgas zu erzeugen, die die Samen an die Oberfläche zu sterilisieren wirkt. </li><li> Inkubieren der Samen in Gegenwart von Chlorgas für 4 Stunden in den Abzugsschrank. Hinweis: Längere Sterilisationszeiten wird die Keimung Effizienz reduzieren. </li><li> Nach der Sterilisation ermöglichen, die chlorine Gas für mindestens 1 Stunde in der Abzugshaube zu entlüften dann das Reaktionsgefäß verschließen. Lassen Sie das Bleichmittel und HCl-Gemisch in der Abzugsschrank für mindestens 24 Stunden vor dem Wegwerfen. Hinweis: Die sterilisierten Samen kann bei Raumtemperatur zur sofortigen Verwendung gelagert werden. </li><li> Halten Samen bei 4 ° C für die langfristige Lagerung. Bringen Sie Samen auf Raumtemperatur vor dem Reaktionsgefäß zu öffnen Kondensation zu vermeiden. Shop Samen im Dunkeln. </li></ol></li><li> Bereiten Agar-Platten in 4-Sektor Petrischalen (90 x 15 mm): <ol><li> Bereiten 110 ml Wachstumsmedium für A. thaliana Keimlinge: 1x Murashige und Skoog (MS) Basismedium 15 (4,33 g / l) mit 1% (w / v) Sucrose und 0,8% (w / v) Agar. Stellen Sie die MS-Medium auf pH 6 mit NaOH. </li><li> Herstellung von 100 ml der Bakterienwachstumsmedium für CEPA Zersetzung: Schramm und Hestrin (SH) -Medium , enthaltend 1,5 16% (w / v) Agar. Stellen Sie den SH-Medium auf pH 7 mit NaOH. </li><li> Sterilisieren Medien durch Autoklavieren und temper in einem 55 ° C Wasserbad. </li><li> Sobald die MS-Agar temperiert hat, dann werden 40 ml in einen sterilen Kolben. Um die positive Kontrolle Wachstumsmedium für A. Vorbereitung thaliana Keimlinge, ergänzen die 40 ml Aliquot von MS - Agar mit 40 &amp; mgr; l 10 mM ACC zu einer Endkonzentration von 10 uM ACC zu erhalten. </li><li> 5 ml Medium zu den entsprechenden Quadranten der sectored Petrischalen (1) und damit der Agar verfestigt. Bereiten Sie alle Platten in dreifacher Ausfertigung. Hinweis: CEPA ist nicht auf das Wachstumsmedium zugegeben, bis später in dem Protokoll. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Abb . 1: Aufbau von Agarplatten für die Dreifachantwort Assay mit CEPA verwendet eine schematische veranschaulicht die Quadranten spezifisch für die negative Kontrolle (A), Positivkontrolle (B) und Versuchsplatten (C). Diese Zahl hat sich von Augimeri und Bügel 9 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana Samen zur Sicherung Synchrone Keimung: <ol><li> In etwa fünfzig A. thaliana Samen auf jeden Quadranten enthält , MS oder MS + ACC - Agar. Stellen Sie sicher, Samen werden gleichmäßig zu erleichtern Sämling Entnahme und Analyse verteilt. </li><li> Inkubieren Platten Samen im Dunkeln bei 4 enthält ° C für 3-4 Tage. </li></ol></li><li> Zerlege CEPA auf das Bakterienwachstum Medium (SH) und Triple Response-Test durchführen: <ol><li> Nach Schichtung, setzen die Samen Fluoreszenzlicht für 2 Std. </li><li> Verbreiten 10 ul der 500 mM Stammlösung CEPA auf den Quadranten der experimentellen Platten mit SH - Agar (pH 7; Figur 1) , um eine endgültige Konzentration zu erhalten CEPAvon 1 mM. </li><li> Verschließen Sie die Platten mit Laborfolie und mit Folie abdecken einer dunklen Umgebung für die Samen zu schaffen. </li><li> Keimen Samen nach unten Platten im Dunkeln bei 23 ° C für 3 Tage mit der Agarseite Inkubieren. Hinweis: Die Platten gestapelt werden können, aber negative Kontrollen sollten auf dem Boden platziert werden, da Ethylen leichter als Luft ist. </li></ol></li><li> Analysieren Triple-Response-Assay Daten: <ol><li> Mit flamm sterilisierten Pinzette entfernen einzelne Sämlinge von einer Platte zu jeder Behandlung und Sicht unter einem Präpariermikroskop oder digitale USB-Mikroskop entspricht. Achten Sie darauf, den Boden der Sämlinge ausgerichtet sind und zu fotografieren. </li><li> Entfernen 30 Sämlinge aus jedem Quadranten (60 Setzlinge pro biologische Replikation und 180 Setzlinge pro Behandlung). Richten Sie auf einer Oberfläche mit einem schwarzen Hintergrund und ein Foto mit einem Lineal. </li><li> Messen Sie die Hypokotyls Länge (mm) von Wiederholungs Sämlinge mit ImageJ Software 17. Stellen Sie die Waage durch Klicken und Ziehen Sie die * gerade *Werkzeug mit einer Länge von 10 mm zu wählen. Wählen Sie &quot;Scale&quot; unter dem &quot;Analyze&quot; Registerkarte und stellen Sie den bekannten Abstand bis 10. Die Verwendung von * Segmented * Werkzeug, klicken Sie auf und ziehen, um wählen Sie die Länge des Hypokotyl und drücken Sie M Distanz zu messen. Vergleichen Sie die Mittel der biologischen Replikaten unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit einem Mehrfachvergleichstest des Tukey. Unterschiede werden als signifikant angesehen , wenn p &lt;0,05. </li></ol></li></ol> 3. Analyse der pH-Wert im gesamten Bakterienwachstum <ol><li> Wachsen und Quantify Komagataeibacter xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung: <ol><li> Impfen eine einzige Kolonie von K. xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Inkubieren Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h). </li><li> Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler 0,85% (w / v) NaCl Lösung, waschen Sie die Zellen zweimal und Zellpellet. Halten Sie Zellen auf Eis. </li><li> Quantifizieren Zellen eine Petroff-Hausser-Zählkammer verwendet wird. </li></ol></li><li> Impfen Kulturen zur Analyse von pH-Wert: <ol><li> Zugabe von 150 ml SH-Brühe (pH 7), supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase bis zwölf 500 ml-Kolben mit Foliendeckeln. Impfen Flaschen mit K. xylinus Starterkulturen in einer Konzentration von 10 5 Zellen / ml. Mit den drei Starterkulturen, bereiten drei biologische Wiederholungen pro Behandlung. </li><li> Supplement Kulturen mit 300 &amp; mgr; l der 5, 50 oder 500 mM CEPA-Stammlösungen zu erhalten endgültige CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM, respectively. Ergänzung zu den unbehandelten Kontrollkulturen mit 300 &amp; mgr; l des verwendeten Lösungsmittels CEPA aufzulösen. </li><li> Verschließen Sie die Flaschen durch dicht Taping der Foliendeckel auf den Kolben und Inkubation Kulturen für 14 Tage bei 30 ° C unter Rühren bei 150 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Jeden Tag aseptically entfernen 5-ml-Proben aus jedem Kolben und Pellet-Zellen durch Zentrifugation (2000 × g, 4 ° C, 10 min). Übertragen Überstand in ein sauberes Röhrchen und messen den pH-Wert jeder biologische Replikation unter Verwendung eines pH-Meters. </li><li> Analysieren Sie die Zeitverlaufsdaten durch den mittleren pH-Wert der biologischen Replikaten der grafischen Darstellung. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kultur pH-Wert unter 3,5 nicht absinkt; eine Kultur pH-Wert von 5 deutlich reduziert Ethylen Freisetzung von CEPA und einem pH-Wert unter 3,5 hemmt vollständig Ethylen-Release. </li><li> Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively. </li></ol> 4. Koloniemorphologie <ol><li> Wachsen K. xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung: <ol><li> Impfen eine einzige Kolonie von K. xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Incubate Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h). </li><li> Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler Kochsalzlösung, Waschen der Zellen und das Zellpellet zu resuspendieren. Halten Sie Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Vorbereitung 24 Agarplatten, enthaltend 25 ml SH (pH 7) -Medium mit 1,5% (w / v) Agar. </li><li> Sobald der Agar sich verfestigt hat, verteilt 50 ul der 5, 50 und 500 mM CEPA Stammlösungen auf dem Agar endgültigen CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM jeweils zu erhalten. Richten Sie unbehandelt und Lösungsmittel-Kontrollplatten, die keine Änderung bestehen und Verbreitung von 50 &amp; mgr; l des Lösungsmittels verwendet, um die Testverbindungen zu lösen. </li><li> Streak Platten für isolierte Kolonien mit einer Schleife voll (~ 5 &amp; mgr; l) von K. xylinus Starterkultur und versiegeln sie mit Paraffinfilm. Impfen alle Platten in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Platten für 5 Tage bei 30 ° C. </li><li> Photograph Kolonien bei 20-facher Vergrößerung eine digitale USB-Mikroskop und qualitativ Koloniemorphologie und Zellstoffproduktion auf festem Medium zu bewerten. Hinweis: Cellulose wird als trübe Substanz entlang des Randes der Kolonie. </li><li> Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively. </li></ol> 5. Pellicle Assays <ol><li> Wachsen und Quantify K. xylinus Starterkulturen in dreifacher Ausführung: <ol><li> In dreifacher Ausführung, eine einzige Kolonie von K. impfen xylinus in 5 ml SH - Medium (pH 5) , supplementiert mit 0,2% (v / v) sterilfiltriert Cellulase. Inkubieren Kulturen bei 30 ° C unter Rühren bei 150 rpm bis zu einer OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 h). </li><li> Erntestarterkulturen durch Zentrifugation (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). Mit 5 ml steriler Kochsalzlösung, Waschen ter Zellen zweimal und Zellpellet. Halten Sie Zellen auf Eis. </li><li> Quantifizieren Zellen eine Petroff-Hausser-Zählkammer verwendet wird. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Mastermixe 24-Well-Platten zu inokulieren: <ol><li> Ergänzung 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 ul der 5, 50 und 500 mM Bestände CEPA endgültige CEPA Konzentrationen von 0,01, 0,1, und 1,0 mM zu erhalten, respectively. Ergänzen weitere 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 &amp; mgr; l des verwendeten Lösungsmittels CEPA aufzulösen. Vortex mischen. </li><li> Teilen Sie die jeweils 60 ml CEPA-haltiges Medium in vier 14-ml-Aliquoten. Beimpfen von drei der 14 ml - Aliquots mit biologischen Replikate von Starterkultur bei einer Konzentration von 10 5 Zellen / ml. Halten Sie Röhrchen mit Zellen auf Eis Cellulose-Produktion zu verhindern. Hinweis: Die verbleibenden 14 ml aliquoten wird für sterile Kontrollvertiefungen verwendet werden. </li></ol></li><li> Impfen 24-Well-Platten: <ol><li> Testen Sie jede Behandlung in einer eigenen Platte mit drei Reihen von biologischen Replikaten undeine Reihe von sterilen Kontrollen (Abbildung 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Fig . 2: Ablaufdiagramm des Protokolls für Pellicle - Assay und die Analyse verwendet , veranschaulicht Vektor CEPA-ergänztem pH 7 SH - Medium (60 ml) wird drei getrennten biologischen replicate Inokulationen und einen sterilen Kontrolle (14 ml jeweils) aliquotiert. Diese Kulturen werden dann in Aliquots aufgeteilt in sechs technische Replikate (2 ml) in eine 24-Well-Platte und dann mit Paraffinfilm versiegelt. Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen bei 30 ° C, Häutchen werden geerntet und gekennzeichnet durch Nassgewicht zu bestimmen, Dicke, Trockengewicht und Kristallinität durch FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Mit dem 14 ml Master-Mix, 2 ml in each von sechs Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte. Füllen Sie für die drei biologischen Replikaten und Sterilkontrolle (Abbildung 2). Wiederholen Sie für jede Behandlung. </li><li> Dichtungsplatten mit Paraffinfilm und inkubieren statisch für 7 Tage bei 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Ernte und Pellicle Wet Gewicht, Dicke, Trockengewicht (Cellulose - Ausbeute) und Kristallinität (Abbildung 2) messen: <ol><li> Drücken Sie eine Seite des Häutchen die gegnerische Häutchen Kante zu heben und zu entfernen einzelne Häutchen mit einer Pinzette. Während Griff halten, legen Sie sie auf frisches Papiertuch für 3 Sekunden überschüssige Medium zu entfernen, bevor mit einem Gewicht von ihren nassen Gewichte zu bestimmen. </li><li> Richten Sie Häutchen neben einem Lineal und Foto von der Seite eine hochauflösende Digitalkamera. </li><li> Mit ImageJ Software 17 messen Häutchen Dicke auf der linken Schulter, rechte Schulter und der Mitte jedes Häutchen. Durchschnittlich alle technischen Replikate für jede biologische RepliCate. </li><li> Individuell übertragen Sie die Häutchen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Behandlung Häutchen mit 12 ml 0,1 N NaOH bei 80 ° C für 20 min Zellen zu lysieren. </li><li> Entfernen Sie die NaOH und neutralisieren Häutchen von unter Rühren mit ultrareinem Wasser für 24 Stunden zu waschen. Wechseln Sie das Wasser alle 6 Stunden. Anmerkung: Pellikel sollte nach Beendigung des Waschschritt weiß sein. </li><li> Ort Häutchen auf Silizium Matten und trocken bei 50 ° C für 48 Stunden bis zur Gewichtskonstanz. Nach dem Trocknen von Matten entfernen und Häutchen Gewichte im analytischen Maßstab messen, um bakterielle Cellulose-Ausbeute zu bestimmen. </li><li> Analysieren Pellicle Kristallinität unter Verwendung Fourier-Transformations - Infrarotspektroskopie (FT-IR) unter Verwendung von 32 Scans und einer Auflösung von 4 cm -1 im Bereich von 4000 bis 650 cm -1. Berechnen Sie den Kristallinitätsindex, CI (IR), unter Verwendung von A 1437 / A 895; das Absorptionsverhältnis des &quot;kristallinen Band&quot; und &quot;amorphen Band&quot; , wie zuvor beschrieben 18. </li></ol&gt; </li><li> Um zu steuern , für Chlor und Phosphatspiegel, führen ein identisches Experiment unter Verwendung von 0,01, 0,1, und 1,0 mM des NaCl-NaH 2 PO 4 -Lösung unter Verwendung der 5, 50 und 500 mM Bestände, respectively. </li><li> Analysieren Pellicle Daten: <ol><li> Berechnen Häutchen Hydratation durch den Unterschied zwischen Häutchen Nassgewicht und Trockengewicht zu bestimmen. </li><li> Der Mittelwert der Werte aller technischen Replikate für die statistische Analyse einen einzelnen Wert für jede biologische Replikation zu erhalten. Vergleichen Sie die Behandlung ein one-way ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichstest. Die Unterschiede sind signifikant , wenn p &lt;0,05. </li><li> Normalisieren Daten als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen und plotten die mittels biologischer Replikaten. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren die in - situ - Herstellung von Ethylen aus CEPA für die Untersuchung von bakteriellen Ethylenantwort des Modellorganismus, K. xylinus. Dieses Verfahren ist sehr geeignet als Ethylen können durch Ergänzung beliebigen wässrigen Medium hergestellt werden, die einen pH - Wert größer als 3,5 10,11 mit CEPA negiert die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezielle Laborausrüstung hat. Dieses Verfahren ist auf die Untersuchung der Wirkungen ...

Das Olefin Ethylen (C 2 H 4) wurde zum ersten Mal im Jahre 1901 als Pflanzenhormon entdeckt , wenn es beobachtet wurde , dass Erbsenkeimlinge, in einem Labor gezüchtet , die Kohlegaslampen verwendet, eine abnorme Morphologie zeigten , in denen Stiele (Hypokotylen) waren kürzer, dicker und beugte sich seitwärts im Vergleich zu normalen Erbsenkeimlinge; ein Phänotyp genannt später die dreifache Reaktion 1,2. Nachfolgende Studien zeigten , dass Ethylen ist ein wichtiger Phytohormone , die zahlreiche Entwicklungsprozesse wie Wachstum, Stressreaktion, Fruchtreife und Seneszenz 3. Arabidopsis thaliana, einem Modellorganismus für Pflanzenbiologie Forschung, ist gut untersucht in Bezug auf seine Reaktion auf Ethylen reguliert. Mehrere Ethylen - Antwort - Mutanten sind durch Ausnutzen der dreifache Reaktion Phänotyp beobachtet in dunkel gewachsenen A. isoliert thaliana Keimlinge in Gegenwart von Ethylen 1,4,5. Die Biosynthesevorstufe für die Ethylenproduktion in Pflanzen ist 1-aminocyclopropane Carbonsäure (ACC) 6 und häufig während der dreifachen Reaktion Assay verwendet wird endogenen Ethylenproduktion , die auf den dreifachen Reaktion Phänotyp 1,4,5 führt zu erhöhen. Obwohl die Ethylen-Antwort in Pflanzen weit untersucht wird, wird die Wirkung der exogenen Ethylen auf Bakterien in beträchtlichem Ausmaß mit Pflanzen trotz der engen Verbindung von Bakterien under. Eine Studie berichtet , daß bestimmte Stämme von Pseudomonas überleben 7 Ethylen als alleinige Quelle für Kohlenstoff und Energie. Jedoch haben nur zwei Studien gezeigt, dass Bakterien an Ethylen reagieren. Die erste Studie zeigte , dass Stämme von Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida und P. syringae waren chemotaktische zu Ethylen unter Verwendung eines Agarose - Plug - Assay , in dem geschmolzene Agarose mit einem Chemotaxis - Puffer wurde mit reinem Ethylengas ins Gleichgewicht gebracht 8. Aber unseres Wissens gab es keine furth gewesener Berichte reines Ethylengas unter Verwendung bakterieller Ethylenantwort zu charakterisieren, wahrscheinlich aufgrund der schwer von Gasen im Labor ohne spezialisierte Ausrüstung Handhabung. Der zweite Bericht der bakteriellen Ethylen - Antwort gezeigt , dass Ethylen xylinus 9 bakterielle Cellulose - Produktion und beeinflusst die Genexpression in der Frucht-assoziierten Bakterium, Komagataeibacter (früher Gluconacetobacter) erhöht. In diesem Fall wurde der Ethylen freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) verwendete Ethylen in situ innerhalb der Bakterienwachstumsmedium zu erzeugen, wodurch die Notwendigkeit für reines Ethylengas oder spezialisierte Ausrüstung umgeht. CEPA produziert Ethylen bei einer 1: 1 - Molverhältnis oberhalb von pH 3,5 10,11 durch eine basenkatalysierte, Reaktion erster Ordnung 12 bis 14. Der Abbau von CEPA positiv mit pH und Temperatur 13,14 und Ergebnisse bei der Herstellung von Ethyl korreliertenene, Chlorid und Phosphat. CEPA bietet Forscher interessiert sich für bakterielle Reaktionen auf Ethylen mit einer günstigen Alternative zu gasförmigem Ethylen zu studieren. Das übergeordnete Ziel der folgenden Protokolle ist es, ein einfaches und effizientes Verfahren zur Verfügung zu stellen bakterielle Ethylenantwort zu untersuchen und umfasst Validierung von physiologisch relevanten Niveaus der Ethylenproduktion von CEPA Zersetzung in Bakterienwachstumsmedium, Analyse der Kultur pH sicherzustellen CEPA Zersetzung nicht beeinträchtigt wird während Bakterienwachstum, und die Beurteilung der Wirkung von Ethylen auf bakterielle Morphologie und Phänotyp. Wir zeigen diese Protokolle K. mit xylinus, jedoch können diese Protokolle angepasst werden Ethylenantwort in anderen Bakterien zu untersuchen , indem die geeigneten Wachstumsmedium und Phänotyp - Analysen.

<table><tbody><tr><td>1-Aminocyclopropancarbonsäure (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetischer Vorläufer von Ethylen in Pflanzen</td></tr><tr><td>4-Sektoren-Petrischale</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Zum Testen der dreifachen</td></tr><tr><td>Reaktion Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Zum Verfestigen von Medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR Kamera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>Für Bilder von Pellikeln</td></tr><tr><td>Cellulase aus Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Wässrige Lösung</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Für SH-Medium</td></tr><tr><td>Kommerzielles Bleichmittel</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleichmittel für die Saatgutsterilisation</td></tr><tr><td>Konzentriertes HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Salzsäure zur pH-Einstellung</td></tr><tr><td>Digitales USB-Mikroskop</td><td>Steckbar</td><td>N/A</td><td>Für Bilder von Bienenvölkern</td></tr><tr><td>Ethephon (&ge; 96%; 2-Chlorethylphosphonsäure)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylenfreisetzende Verbindung</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Für SH-Medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bakterielle Cellulose produzierende Alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Murashige und Skoog (MS) basal mittel&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Natriumphosphat, zweibasisches Heptahydrat für SH-Medium</td></tr><tr><td></td><td>NaCl BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Natriumchlorid für Kochsalzlösung und Kontrolllösung</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Natriumphosphat, monobasisches Monohydrat zur Herstellung von Kontrolllösung</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Natriumhydroxid zur pH-Einstellung</td></tr><tr><td>Paraffinfilm</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Zum Verschließen von Platten und Kolben</td></tr><tr><td>Pepton (bakteriologisch)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Für SH Medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser Zählkammer</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Zählkammer für bakterielle Zellen</td></tr><tr><td>Polyethersulfon-Sterilisationsfilter 0,2 & Mikro; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Zur Sterilisation von Cellulase</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Saccharose für MS-Medium</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Für SH-Medium</td></tr></tbody></table>

unter verwendung der ethylen-freisetzenden verbindung, 2-chlorethylphosphonsäure, als werkzeug ethylen-antwort in bakterien zu studieren

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Ethylen (C2H4) ist ein gasförmiges Phytohormon, das an zahlreichen Aspekten der Pflanzenentwicklung beteiligt ist und eine dominierende Rolle bei der Seneszenz und Fruchtreife spielt. Exogenes Ethylen, das während der frühen Pflanzenentwicklung angewendet wird, löst den Triple-Response-Phänotyp aus; ein kürzeres und dickeres Hypokotyl mit einem übertriebenen apikalen Haken. Trotz der engen Beziehung zwischen Pflanzen und Bakterien wurde die Wirkung von exogenem Ethylen auf Bakterien weitgehend übersehen. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es schwierig ist, gasförmiges Ethylen im Labor ohne spezielle Geräte zu kontrollieren. 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) ist eine Verbindung, die sich in einem molaren Verhältnis von 1:1:1:1 in Ethylen, Chlor und Phosphat zersetzt, wenn sie in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 3,5 oder höher gelöst wird. Hier beschreiben wir die Verwendung von CEPA zur Herstellung von in situ Ethylen zur Untersuchung der Ethylenantwort in Bakterien unter Verwendung des fruchtassoziierten, zelluloseproduzierenden Bakteriums Komagataeibacter xylinus als Modellorganismus. Die hierin beschriebenen Protokolle umfassen sowohl die Verifizierung der Ethylenproduktion aus CEPA über den Arabidopsis thaliana Triple-Response-Assay als auch die Auswirkungen von exogenem Ethylen auf die Zelluloseproduktion von K. xylinus, die Pellikeleigenschaften und die koloniale Morphologie. Diese Protokolle können angepasst werden, um die Wirkung von Ethylen auf andere Mikroben unter Verwendung geeigneter Wachstumsmedien und Phänotypanalysen zu untersuchen. Die Verwendung von CEPA bietet Forschern eine einfache und effiziente Alternative zu reinem Ethylengas für die routinemäßige Bestimmung der bakteriellen Ethylenreaktion.

C - Eine schematische Plattenaufbau zur Verifikation von Ethylen Befreiung von CEPA in SH - Medium (pH 7) durch den Dreifachantwort Assay wird in 1A gezeigt. Ein Flussdiagramm , das die Pellicle - Protokoll veranschaulicht , ist in Figur 2 Dark-grown A. gezeigten thaliana Keimlinge weisen die Dreifachantwort Phänotyp (kürzer und dicker Hypocotyl mit einer übertriebenen apikalen hook) in Gegenwart von ACC und in Gegenwar...

Die hierin beschriebenen Protokolle erleichtern die bequeme Untersuchung bakterieller Ethylenreaktionen durch die Verwendung von 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA). Ethylen wird in situ durch die Zersetzung von CEPA in einem wässrigen bakteriellen Wachstumsmedium hergestellt, wodurch der Bedarf an reinem Ethylengas umgangen wird.

Unter Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure, als Werkzeug Ethylen-Antwort in Bakterien zu studieren

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und sichere Methode zur Untersuchung der bakteriellen Reaktion auf Ethylen bereitzustellen. Diese Methode wird zentrale Fragen zu Pflanze-Mikrobe-Interaktionen beantworten, beispielsweise welche Rolle Ethylen bei der bakteriellen Adhäsion und Kolonisation von Pflanzen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist und sie deutlich sicherer ist als das Arbeiten mit gasförmigem Ethylen im Labor. Obwohl diese Methode Einblicke darüber geben kann, wie die Produktion bakterieller Cellulose durch Ethylen beeinflusst wird, kann sie auch auf andere pflanzenassoziierte Mikroorganismen angewendet werden, um in vitro zu untersuchen, wie ethylenvermittelte Prozesse an der Besiedlung von Pflanzen beteiligt sind. Bereiten Sie zur Vorbereitung 100 Milliliter Wachstumsmedium für die Arabidopsis-Keimlinge und 100 Milliliter bakterielles Wachstumsmedium für den CEPA-Abbau vor. Sobald das Arabidopsis-Medium abgekühlt ist, entnehmen Sie 40 Milliliter in einen sterilen Kolben und ergänzen die Portion mit 40 Mikrolitern einer 10-Millimolar-ACC-Lösung.Beladen Sie nun die Plattenquadranten mit je fünf Millilitern Medium und lassen Sie das Agar erstarrten. Gegenüberliegende Quadranten aller Platten enthalten jeweils Bakterienwachstumsmedium und Arabidopsis-Medium. Verwenden Sie drei verschiedene Medium-Konfigurationen.Die CEPA-Behandlung erfolgt später im Protokoll. Bereiten Sie jede Plattenkonfiguration im Dreifachansatz vor. Sobald das Agar abgekühlt ist, verteilen Sie etwa 50 Samen gleichmäßig auf jedes Viertel des Arabidopsis-Mediums. Anschließend die Platten drei bis vier Tage lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Später, nach der Inkubation der Samen, diesen zwei Stunden lang Fluoreszenzlicht aussetzen. Danach 10 Mikroliter einer 500 Millimolar CEPA-Stammlösung auf das bakterielle Agar einer Plattenanordnung auftragen.Die endgültige CEPA-Konzentration im Agar beträgt ein Millimolar. Versiegeln Sie nun alle Platten mit Laborfolie und wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein. Anschließend stellen Sie die Platten für drei Tage bei 23 Grad Celsius im Dunkeln mit der Agarseite nach unten zur Keimung der Samen. Nachdem die Samen gekeimt sind, verwenden Sie mit der Flamme sterilisierte Pinzetten, um die Keimlinge entsprechend jeder Behandlung zu entfernen. Wählen Sie 30 Keimlinge aus jedem Quadranten, insgesamt 180 pro Behandlung. Bilden Sie die Keimlinge unter einem Stereomikroskop oder mit einer hochauflösenden Digitalkamera vor schwarzem Hintergrund neben einem Maßstab zur Größenbestimmung ab.Messen Sie anschließend die Hypokotyllänge mit der ImageJ-Software. Verwenden Sie das gerade Linien-Werkzeug, um 10 Millimeter zu messen, und wählen Sie im Reiter „Analyze“ die Option „Set Scale“, um den Maßstab festzulegen. Anschließend messen Sie mithilfe des Werkzeugs „Segmented Line“ unter dem „Straight Line“-Werkzeug jeden Hypokotyl und drücken Sie „M“, um deren Längen zu berechnen.Der Pellicle-Test ist ein Standardanalyseverfahren zur Untersuchung der bakteriellen Celluloseproduktion. pH- und morphologische Analysen sind im Sex-Protokoll beschrieben. Bereiten Sie dazu Zellen aus Starterkulturen im Dreifachansatz auf und quantifizieren Sie die Zellen mit einer Petroff-Hauser-Zählkammer.Danach bereiten Sie vier mittlere Master-Mischungen mit unterschiedlichen CEPA-Konzentrationen vor. Für jede Master-Mischung pipettieren Sie 60 Milliliter pH-7-SH-Medium um und geben 120 Mikroliter entweder null, fünf, 50 oder 500 Millimolar CEPA-Stammlösung hinzu, um endgültige CEPA-Konzentrationen von null, 0,1, 0,1 oder 1,0 Millimolar zu erhalten. Mischen Sie diese Medien durch Schwenken der Kolben.Es wird ein Mediensatz für jede der Triplikate sowie ein vierter Satz als steriler Kontrolle benötigt. Teilen Sie daher jede 60-Milliliter-Medienzubereitung in vier 14-Milliliter-Aliquote auf. Kühlen Sie die 14-Milliliter-Aliquote anschließend vor, bevor sie mit den jeweiligen Startkulturen inoculiert werden, um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.Halten Sie alle beimpften Röhrchen auf Eis, um die Zelluloseproduktion zu verhindern. Verwenden Sie die restlichen 14 Milliliter Eluate für sterile Kontrollbrunnen. Laden Sie nun aus jedem 14-Milliliter-Master-Mix jeweils 2-Milliliter-Portionen in sechs Brunnen einer sterilen 24-Loch-Platte, insgesamt vier beladene Platten pro analysierter Starterkultur.Versiegeln Sie die Platten vorsichtig mit Parafilm und inkubieren Sie sie sieben Tage lang statisch bei 30 Grad Celsius. Inkubieren Sie währenddessen parallel eine 25-Milliliter-Flüssigkultur, um periodisch die Säure des Mediums zu messen. Wenn die Säure unter einen pH-Wert von fünf fällt, hemmt das Wachstum des Organismus die Zersetzung von CEPA zu Ethylen und ist daher mit diesem Test unvereinbar.Eine Woche später werden das feuchte Gewicht, die Dicke, das Trockengewicht und die Kristallinität des Pellicles erfasst. Um ein Pellicle aus der Platte zu entnehmen, drücken Sie eine Seite des Pellicles nach unten, um die gegenüberliegende Kante anzuheben, und heben Sie es mit einer Pinzette auf. Halten Sie es weiterhin mit der Pinzette fest und legen Sie es für drei Sekunden auf ein frisches Papiertuch, um überschüssiges Medium zu entfernen.Danach jede Pellicula wiegen und dies als Feuchtgewicht erfassen. Anschließend die Pelliculae entlang eines Lineals ausrichten und mit einer hochauflösenden Digitalkamera von der Seite fotografieren. Analysieren Sie diese Fotos hinsichtlich der Dicken der Pelliculae.Als Nächstes überführen Sie die Pellicles einzeln in die Vertiefungen einer Sechslochplatte. Behandeln Sie sie 20 Minuten lang mit 12 Milliliter 0,1 normaler Natronlauge bei 80 Grad Celsius, um die Zellen aufzulösen. Entfernen Sie anschließend die Natronlauge und neutralisieren Sie die behandelten Pellicles, indem Sie sie gründlich 24 Stunden lang unter Schütteln mit je 12 Milliliter ultrareinem Wasser in einer Sechslochplatte waschen.Während dieser Inkubation das Wasser alle sechs Stunden wechseln. Am Ende der Inkubation sollten die Pellicles weiß sein. Anschließend die Pellicles auf Silikonmatten geben und 48 Stunden bei 50 Grad Celsius trocknen, um sie für die Trockengewichtsbestimmung vorzubereiten.Die Kristallinität der Pellicles kann mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie analysiert werden. Im Dunkeln gezogene Sämlinge von Arabidopsis thaliana zeigten das Triple-Response-Phänotyp mit einem kurzen, verdickten Hypokotyl und einer überbetonten apikalen Krümmung in Gegenwart von ACC sowie in Gegenwart von Ethylen, das durch die Zersetzung von CEPA auf SH-Medium gebildet wurde, nicht jedoch unter unbehandelten Bedingungen. Deutlich war die Hypokotyllänge der behandelten Samen signifikant geringer als die der unbehandelten Kontrollen.Daher wurde Ethylen aus CEPA im SH-Medium in physiologisch relevanter Konzentration freigesetzt. Alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen verringerten signifikant das Feuchtwicht der Pellicle, beeinflussten jedoch die Pellicle-Dicke nicht, und alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen erhöhten signifikant das Trockenwicht der Pellicle. Außerdem wurde die Hydratation der Pellicle durch alle Konzentrationen von CEPA-abgeleitetem Ethylen vermindert.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den pH-Wert des Wachstumsmediums zu messen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert nicht unter fünf fällt, da sonst die Abbaureaktion von CEPA zu Ethylen gehemmt wird. Beachten Sie, dass pulverförmiges CEPA äußerst gefährlich für die Schleimhäute ist. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist stets die gebotene Vorsicht zu beachten.Mithilfe dieser Technik können Forscher, die an Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Bakterien interessiert sind, ethylenvermittelte Reaktionen sicher in vitro untersuchen. Dies wird dazu beitragen, aufzuklären, wie pflanzliche Signale die Besiedlung und Adhäsion von Bakterien steuern. Derzeit ist dieser Forschungsbereich noch wenig erforscht.

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Forschung

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Biochemistry

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