Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Anzahl der Untereinheiten in homooligomeren Protein-Komplexen in Zelllysaten mittels nicht-denaturierender Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise den oligomeren Zustand von Proteinen, die an grundlegenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie weder die Reinigung der homooligomeren Protein-Komplexe noch spezielle, kostspielige Geräte erfordert.

Daher kann es in den meisten Laboratorien durchgeführt werden. Dieses Experiment verwendet zwei Zelltypen: A549-Zellen, die das endogene Myxovirus-Resistenz-A-Protein (MxA) exprimieren, und Virozellen, die MxA überexprimieren.

Säen Sie die A549-Zellen und Virozellen in Sechs-Well-Platten mit je zwei Milliliter Wachstumsmedium aus. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Zellkulturinkubator. Am folgenden Tag werden die Zellen geerntet.

Waschen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter PBS und lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung für etwa fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sobald sich die Zellen von der Schale lösen, geben Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und mischen vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Überführen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein zwei Milliliter fassendes Reaktionsgefäß, und pelletieren Sie sie mithilfe einer Tischzentrifuge.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren, ohne den Zellpellet zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein Milliliter eiskaltes PBS hinzufügen und die Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Pelletieren Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren, ohne den Zellpellet zu lösen. Geben Sie 200 Mikroliter eiskaltes Lysepuffer hinzu, resuspendieren Sie die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und stellen Sie anschließend auf Eis. Schützen Sie das Lysat umgehend vor Licht, indem Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, da Iodoacetamid im Lysepuffer lichtempfindlich ist.

30 Minuten auf Eis inkubieren. Die Verwendung von Iodoacetamid ist entscheidend, da Iodoacetamid die Thiolgruppe freier Cysteine irreversibel schützt, indem es eine Thioetherbindung eingeht, und so eine künstliche Proteinaggregation verhindert. Anschließend zelluläre Trümmer durch Zentrifugation in einer vorab gekühlten Tischzentrifuge entfernen.

Während der Zentrifugation bereiten Sie Dialysekolonnen mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 vor. Befestigen Sie die Dialysekolonnen an einem Schwimmkörper und stellen Sie sie in einen Becher, der mit vorab gekühltem Dialysepuffer gefüllt ist, um die Kolonnen zu equilibrieren. Berühren Sie die Membran nicht.

Stellen Sie einen magnetischen Rührer in einen Becher und bringen Sie den Becher in den Kühlschrank. Unter Verwendung des magnetischen Rührers zur Sicherstellung einer sanften Rührung 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius anpassen. Nach 20 Minuten entfernen Sie die Säulen vom Dialysepuffer und vom Schwimmkörper.

Überführen Sie die klaren Lysate mittels Pipette in die vorbereiteten Dialysesäulen, ohne die Membran zu berühren. Befestigen Sie die Säulen an einem Schwimmkörper und stellen Sie sie zurück in das mit Dialysepuffer gefüllte Becherglas. Danach überführen Sie das Becherglas in den Kühlschrankraum.

Dialysieren Sie das Lysat mindestens vier Stunden bei vier Grad Celsius unter vorsichtigem Rühren mit einem Magnetrührer, um kleine Metaboliten und Salze zu entfernen, die die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese stören könnten. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, überführen Sie jede dialysierte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie ausgefallene Präzipitate durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge.

Die Elektrophorese muss unmittelbar nach der Dialyse der Lysate durchgeführt werden, um die Dissoziation der oligomeren Protein-Komplexe zu verhindern. Füllen Sie die innere und äußere Gelkammer mit vorgekühltem Laufpuffer. Führen Sie einen Vorkurs des nicht-denaturierenden Polyacrylamidgels mit vorgekühltem Laufpuffer bei 25 Milliampere pro Gel für 15 Minuten bei vier Grad Celsius durch.

Mischen Sie 15 Mikroliter des hergestellten Lysats mit fünf Mikrolitern 4X-Probenpuffer. Laden Sie einen beliebigen nativen Proteinstandard und 15 Mikroliter Probe auf das Gel auf. Führen Sie das Gel vier Stunden lang bei 25 Milliampere und vier Grad Celsius durch.

Wenn die nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese abgeschlossen ist, demontieren Sie das Gel und überführen es vorsichtig in SDS-Puffer. Inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie pro Gel zwei Schwämme, vier Zellulosefilterpapiere und eine Übertragungsfolie vor und tauchen Sie diese in den Übertragungspuffer ein.

Bauen Sie das Sandwich von unten nach oben wie folgt auf: Eine Schwammscheibe, zwei Zellulosefilterpapiere, eine Abdruckmembran, das Gel, zwei Zellulosefilterpapiere und eine Schwammscheibe. Legen Sie das Sandwich in den Abdruckbehälter, wobei die Membran zur Plus-Elektrode und das Gel zur Minus-Elektrode zeigen muss.

Füllen Sie den Blott-Tank mit vorgekühltem Blott-Puffer. Für optimale Proteinübertragungsergebnisse über Nacht bei vier Grad Celsius bei 90 Milliampere blotten. Am folgenden Tag das Sandwich auseinanderbauen.

Die Membran fünf Minuten bei Raumtemperatur in Ponceau-S-Lösung inkubieren, um das Proteinstandard sichtbar zu machen. Die Membran entfärben, indem sie in entionisiertes Wasser gelegt und gewaschen wird. Nach dem Übertragen der Membran in eine Wanne die Banden des Proteinstandards mit einem Stift markieren.

Blocken Sie die Membran mit Blockpuffer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden die Proteine von Interesse mittels Immunfärbung unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers, der gegen MxA gerichtet ist, wie im Textprotokoll beschrieben, sichtbar gemacht. Virozellen, die endogenes MxA fehlen, wurden mit rekombinantem Wildtyp-MxA sowie monomeren und dimeren MxA-Varianten transfiziert.

Die Migration der rekombinanten MxA-Variante bei ihrem erwarteten molekularen Gewicht bestätigte deren oligomeren Zustand. Das ektopisch exprimierte Wildtyp-MxA migrierte als Tetramer. Diese rekombinanten Proteine wurden anschließend verwendet, um den oligomeren Zustand des endogenen humanen MxA-Proteins aus Interferon-alpha-stimulierten A549-Zellen zu untersuchen.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Größe von MxA in Lysaten von mit Interferon-alpha stimulierten A549-Zellen einem Tetramer entspricht. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in anderthalb Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben während des gesamten Ablaufs nicht einzufrieren und wieder aufzutauen, da dies Proteinwechselwirkungen zerstören oder Proteinaggregationen verursachen könnte.

Außerdem ist es wichtig, die Proben während des Lyse-Schritts vor Licht zu schützen, wenn mit lichtempfindlichen Reagenzien wie Iodoacetamid gearbeitet wird. Nach dem nicht-denaturierenden SDS-PAGE können weitere Methoden wie die Protein-Gelextraktion, die enzymatische Aktivitätsbestimmung oder ein zweidimensionales PAGE durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie die enzymatische Aktivität und die Charakterisierung möglicher hetero-oligomerer Komplexe zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Zusammensetzung oligomerer Protein-Komplexe in Kultierzellen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zelllysate aus Zellkulturen herstellt, um oligomere Proteine mittels nicht-denaturierender PAGE-Analyse zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Iodoacetamid äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Augenschutz.