Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese
October 28th, 2016
Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des Dynamin-ähnlichen GTPase MxA-Proteins aus Lysaten menschlicher Zellen unter Verwendung einer Kombination aus nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Anzahl der Untereinheiten in homooligomeren Proteinkomplexen in Zelllysaten mit Hilfe der nicht-denaturierenden Natriumdodecosulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. den oligomeren Status von Proteinen, die an grundlegenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine Reinigung der homooligomeren Proteinkomplexe oder spezielle, teure Geräte erfordert.
Daher kann es in den meisten Labors durchgeführt werden. In diesem Experiment werden zwei Arten von Zellen verwendet. A549-Zellen, die endogenes Myxovirus-Resistenz-A-Protein oder MxA exprimieren; und Virozellen, die MxA überexprimieren.
Die A549-Zellen und Virozellen werden in sechs Well-Schalen mit zwei Millilitern Wachstumsmedium pro Well ausgesät. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag ernten Sie die Zellen.
Waschen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter PBS und befestigen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung für etwa fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Sobald sich die Zellen von der Schale gelöst haben, fügen Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie mit einer Tischzentrifuge.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren, ohne das Küvettenpellet zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter eiskaltes PBS hinzufügen und die Zellsuspension vorsichtig auf und ab pipettieren. Pelletieren Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren, ohne das Küvettenpellet abzulösen. Fügen Sie 200 Mikroliter eiskalten Lysepuffer hinzu, resuspendieren Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren und legen Sie sie dann auf Eis. Schützen Sie das Lysat sofort vor Licht, indem Sie die Röhrchen mit Alufolie abdecken, da das Jodacetamid im Lysepuffer lichtempfindlich ist.
30 Minuten auf Eis inkubieren. Die Verwendung von Jodacetamid ist von entscheidender Bedeutung, da Jodacetamid die Thiolgruppe der freien Cysteine irreversibel schützt, indem es eine Thioetherbindung bildet und eine künstliche Proteinaggregation verhindert. Entfernen Sie anschließend Zellreste durch Zentrifugation in einer vorgekühlten Tischzentrifuge.
Während der Zentrifugation Dialysesäulen mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10.000 vorbereiten. Befestigen Sie die Dialysesäulen an einer Schwimmboje und legen Sie sie in ein mit vorgekühltem Dialysepuffer gefülltes Becherglas, um die Säulen auszugleichen. Berühren Sie nicht die Membran.
Legen Sie einen Magnetrührer in ein Becherglas und stellen Sie den Becher in den Kühlraum. Mit dem Magnetrührer für ein sanftes Rühren 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius äquilibrieren. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Säulen aus dem Dialysepuffer und der Schwimmboje.
Übertragen Sie die gereinigten Lysate in die vorbereiteten Dialysesäulen, indem Sie pipettieren, ohne die Membran zu berühren. Befestigen Sie die Säulen an einer Schwimmboje. Geben Sie sie zurück in das mit Dialysepuffer gefüllte Becherglas und stellen Sie das Becherglas dann in den Kühlraum.
Dialysieren Sie das Lysat mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius und rühren Sie dabei vorsichtig mit einem Magnetrührer um, um kleine Metaboliten und Salze zu entfernen, die die nicht denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese beeinträchtigen könnten. Wenn die Dialyse abgeschlossen ist, überführen Sie jede dialysierte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie Ausfällungen durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge.
Die Elektrophorese muss unmittelbar nach der Dialyse der Lysate durchgeführt werden, um die Dissoziation der oligomeren Proteinkomplexe zu verhindern. Füllen Sie die innere und äußere Gelkammer mit vorgekühltem Laufpuffer. Lassen Sie das nicht denaturierende Polyacrylamid-Gel mit vorgekühltem Laufpuffer bei 25 Milliampere pro Gel 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius vorlaufen.
Mischen Sie 15 Mikroliter des vorbereiteten Lysats mit fünf Mikrolitern 4X Probenpuffer. Laden Sie einen nativen Proteinstandard Ihrer Wahl und 15 Mikroliter Probe auf das Gel. Lassen Sie das Gel vier Stunden lang bei vier Grad Celsius bei 25 Milliampere laufen.
Wenn die Elektrophorese des nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gels abgeschlossen ist, zerlegen Sie das Gel und überführen Sie es vorsichtig in einen SDS-Puffer. 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Bereiten Sie zwei Schwämme, vier Zellulose-Filterpapierblätter und eine Löschfolie pro Gel vor und tränken Sie sie in Löschpuffer.
Das Sandwich wie folgt von unten nach oben zusammensetzen. Ein Schwamm, zwei Zellulose-Filterpapierblätter, eine Löschfolie, das Gel, zwei Zellulose-Filterpapierblätter und ein Schwamm. Legen Sie das Sandwich in den Blotting-Tank und achten Sie darauf, dass die Membran zum Pluspol und das Gel zum Minuspol zeigt.
Füllen Sie den Löschbehälter mit vorgekühltem Löschpuffer. Die besten Ergebnisse beim Proteintransfer erzielen Sie, wenn Sie über Nacht bei 90 Milliampere bei vier Grad Celsius abtupfen. Am nächsten Tag das Sandwich zerlegen.
Inkubieren Sie die Membran fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um den Proteinstandard zu visualisieren. Entfärben Sie die Membran, indem Sie sie in entionisiertes Wasser legen und waschen. Nachdem Sie die Membran in ein Tablett übertragen haben, markieren Sie die Banden des Proteinstandards mit einem Stift.
Blockieren Sie die Membran mit Blockierungspuffer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden die interessierenden Proteine durch Immunfärbung mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen MxA visualisiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Virozellen, denen endogenes MxA fehlte, wurden mit rekombinantem Wildtyp-MxA und monomerer und dimerer MxA-Varianz transfiziert.
Die Migration der rekombinanten MxA-Varianz bei ihrem erwarteten Molekulargewicht bestätigte ihren oligomeren Zustand. Der ektopisch exprimierte Wildtyp MxA wanderte als Tetramer. Diese rekombinanten Proteine wurden dann verwendet, um den oligomeren Zustand des endogenen humanen MxA-Proteins zu beurteilen, das aus Interferon-alpha-stimulierten A549-Zellen gewonnen wurde.
Das Ergebnis zeigte, dass die Größe von MxA in Lysaten von Interferon-alpha-stimulierten A549-Zellen einem Tetramer entspricht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in eineinhalb Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Proben während des gesamten Verfahrens nicht einzufrieren und aufzutauen, da dies Proteininteraktionen zerstören oder Proteinaggregationen verursachen könnte.
Darüber hinaus ist es bei der Arbeit mit lichtempfindlichen Reagenzien wie Iodacetamid wichtig, die Proben während des Lyseschritts vor Licht zu schützen. Nach der nicht-denaturierenden SDS-PAGE können weitere Methoden wie die Proteingel-Extraktion und die enzymatische Aktivität AsiS oder eine zweitdimensionale PAGE durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die enzymatische Aktivität und die Charakterisierung potenzieller hetero-oligomerer Komplexe zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um die Zusammensetzung oligomerer Proteinkomplexe in kultivierten Zellen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zelllysate aus Zellkulturen herstellt, um oligomere Proteine in der nicht-denaturierenden PAGE-Analyse zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Jodacetamid äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Augenschutz immer getroffen werden sollten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Dieser Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des MxA-Proteins mittels nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse. Diese Methode ist auf Zelllysate aus menschlichen Zellen anwendbar.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Proteinanalyse
- Biochemie
Hintergrund
- Das Verständnis des oligomeren Zustands von Proteinen ist in der Zellbiologie entscheidend.
- Homo-oligomere Proteinkomplexe spielen eine bedeutende Rolle in zellulären Prozessen.
- Herkömmliche Methoden erfordern oft die Proteinreinigung, was mühsam sein kann.
- Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse direkt aus Zelllysaten.
Zweck der Studie
- Um die Anzahl der Untereinheiten in homo-oligomeren Proteinkomplexen zu bestimmen.
- Um den oligomeren Status des MxA-Proteins in verschiedenen Zelltypen zu bewerten.
- Um eine einfache Methode bereitzustellen, die für die meisten Labore zugänglich ist.
Verwendete Methoden
- Nicht-denaturierende Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).
- Western-Blot-Analyse zur Proteindetektion.
- Verwendung von A549-Zellen und Virozellen für die MxA-Expressionsanalyse.
- Analyse von Zelllysaten ohne die Notwendigkeit einer Reinigung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bewertung des oligomeren Zustands von MxA aus Zelllysaten.
- Nachweis der Machbarkeit der Methode in Standard-Laborbedingungen.
- Einblicke in die Rolle des Proteins in zellulären Prozessen.
- Hervorhebung der Vorteile nicht-reinigungsbasierter Techniken.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist effektiv für die Analyse der Proteinoligomeriserung.
- Es kann in verschiedenen Forschungskontexten innerhalb der Zellbiologie eingesetzt werden.
- Diese Methode verbessert die Zugänglichkeit für Forscher, die Proteinkomplexe untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Assessing the oligomeric state of antiviral proteins like MxA directly from cell lysates enables mechanistic de-risking of target hypotheses in early discovery. This non-denaturing PAGE approach supports target validation by linking functional oligomeric forms to antiviral activity without requiring protein purification. The method provides a scalable, reproducible readout for evaluating mutant phenotypes in a disease-relevant system, informing lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating MxA oligomeric states with antiviral function.
- Operational Value: Enables functional target validation using endogenous or ectopic expression in human cell lines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing active oligomeric complexes from inactive monomers or aggregates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized lysates for downstream screening of MxA modulators or interface mutants.
- Quantitative Output: Generates resolvable oligomeric bands (monomer, dimer, tetramer) for comparative analysis across conditions.
- Reproducibility: Uses dialysis and light-protected lysis to minimize artifactual aggregation, ensuring consistent complex detection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Evaluates MxA oligomerization in interferon-stimulated A549 cells, a physiologically relevant model of antiviral response.
- Translational Continuity: Links oligomeric state to antiviral phenotype, supporting biomarker-aligned target assessment.
- Preclinical De-risking: Enables structure-function analysis of MxA mutants to guide therapeutic candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling oligomerization assessment after target engagement but before lead optimization, particularly for GTPase-mediated antiviral targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about oligomerization-dependent activity without perturbing native complexes.
- Screening: Delivers quantitative electrophoretic readouts to compare wild-type and mutant protein assemblies.
- Analytics: Provides subunit resolution via native PAGE, enabling densitometric comparison of oligomeric populations.
- Translational Research: Connects biochemical state to antiviral function in human cells, supporting target confidence.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other dynamin-like GTPases or oligomeric signaling proteins in antiviral or innate immunity pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the active oligomeric state of MxA.
- Operational Value: Employs standard lab equipment (centrifuge, gel apparatus, blotter) avoiding specialized infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating whether observed antiviral effects correlate with defined oligomeric species.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MxA-targeted strategies based on oligomerization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE, dialysis, and western blotting to preserve labile complexes.
- Needs pre-chilled buffers, magnetic stirrer, dialysis columns (10 kDa cutoff), and light-protected handling of iodoacetamide.
- Demands standardized lysis and dialysis protocols across teams to prevent variability in oligomer detection.
- Must avoid freeze-thaw cycles and protease activity to maintain complex integrity during sample prep.
- Limited to detecting stable oligomers; transient or weak interactions may require crosslinking or orthogonal validation.
