Name: Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung oligomerer Protein-Komplexe des menschlichen MxA-Proteins mittels nicht-denaturierender PAGE und Western Blot aus Zelllysaten. Diese Methode erfordert keine aufwendige Proteinreinigung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (Stipendium Nr. 31003A_143834) an JP finanziert.

Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der zuvor veröffentlichten nicht-denaturierende PAGE - Protokoll 12. entweder mit Vero-Zellen überexprimieren MxA oder IFN-α-stimulierten A549-Zellen, die endogene MxA In dieser Studie wurde die oligomeren Zustand des MxA Proteins bewertet. Das Protokoll unten beschrieben können die oligomeren Zustand jedes Protein zusätzlich zu MxA zu analysieren. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich. 1. Herstellung der Zellen-Lysate für die nicht-denaturierende PAGE HINWEIS: Für die Analyse wurden die oligomeren Zustand des menschlichen MxA Proteins entweder Vero oder A549 - Zellen, 1,0 x 10 6 Zellen geerntet. Je nach Zelltyp oder der Abundanz des Proteins zu analysieren, sollte die Zellzahl eingestellt werden. Es ist auch wichtig, die Lysepuffer von Belichtung zu schützen, sobald die lichtempfindliche Iodacetamid hinzugefügt wird. <ol><li> Seed 0,3 x 10 6 A549 oder Vero - Zellen pro Well inbis 6 gut Gerichten. Halten Sie die Zellen in 2 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung (siehe Tabelle 1). Inkubiere Zellen über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Ernte der Zellen durch Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lösen durch Zugabe von 0,5 ml von 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1x Lösung für ca. 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sobald die Zellen aus der Schale lösen, 0,5 ml Wachstumsmedium hinzufügen und sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren mischen. </li><li> Übertragen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein 2-ml-Röhrchen und Pellet sie eine Tischzentrifuge mit (5000 × g, 4 ° C, 5 min). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension nach oben und unten. </li><li> Pellet-Zellen in einer Tischzentrifuge (5000 x g, 4 ° C, 5 min). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand von wi Pipettierenthout des Zellpellets lösen. </li><li> Die Zellen in 200 ul eiskaltem Lysepuffer (siehe Tabelle 1) durch Pipettieren von oben und unten und auf Eis gelegt. </li><li> Sofort schützen Lysat aus Licht, das durch die Rohre Abdeckung Zinnfolie mit und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. HINWEIS: Nach Inkubation für 30 min auf Eis, ist es nicht mehr notwendig, die Lysat aus Belichtung zu schützen, da der Schutz der freien Thiolgruppen irreversibel ist. </li><li> Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation in einer vorgekühlten Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min). </li><li> Dialyse Spalten in Dialysepuffer (Tabelle 1) in den Kühlraum bei 4 ° C für 20 min während der Zentrifugationsschritt äquilibrieren. Verwenden Sie eine Spalte mit einem Molekulargewicht abgeschnitten von 10.000. <ol><li> Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie in einen Becher mit Dialysepuffer gefüllt. Um sicherzustellen, leichtem Rühren Magnetrührer benutzen. Die Membran nicht berühren. HINWEIS: dialysist , kann Spalten aus 1,5 - ml - Röhrchen nach dem Protokoll von Fiala und Mitarbeiter 19 beschrieben erworben oder hergestellt werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Spalten aus dem Dialysepuffer und dem Schwimmer Boje. Übertragen Sie die gelöscht Lysate in die vorbereitete Dialysesäule durch Pipettieren, ohne die Membran zu berühren. Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie zurück in den Becher mit Dialysepuffer gefüllt. </li><li> Dialysiere das Lysat in einem Becher eiskaltes Dialysepuffer (Tabelle 1) für mindestens 4 Stunden (oder vorzugsweise über Nacht) bei 4 ° C enthalten , sorgfältig , während mit einem Magnetrührer gerührt wurde. Verwenden mindestens 100 ml Dialysepuffer bei einem 200 &amp; mgr; l Lysat. </li><li> Übertragen Sie die dialysiert Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Präzipitate durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min). die Dissoziation des oligomere Proteinkomplexe weiterhin mit dem Protokoll (Abschnitt 2) unmittelbar nach der Dialyse zu vermeiden. Nicht einfrierendie vorbereiteten Lysaten. </li></ol> 2. Elektrophorese HINWEIS: Die Elektrophorese wurde wie zuvor 22 mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt. In dem Protokoll unten beschrieben, wurden vorgegossenen Gelen mit einem Gradienten (4-15% Gradient) verwendet. Alternativ können die Gele im Labor hergestellt werden. Es ist sehr wichtig, jede Denaturierungsmittel auszuschließen, wie beispielsweise SDS die Dissoziation der oligomere Proteinkomplexe zu verhindern. Zeit der Elektrophorese wurde für die verschiedenen Oligomerisierungszustände des menschlichen MxA Protein optimiert. Jedoch kann es für andere Proteine ​​variieren, abhängig von der Größe des oligomeren Komplex sowie dem Bereich der Trennung, die erreicht werden soll um den Komplex zu analysieren. Daher sollte die optimale Zeit der Elektrophorese empirisch bestimmt werden. Für eine optimale Auflösung der Oligomeren der Strom nicht 25 mA nicht überschreiten sollte analysiert werden. <ol><li> Montieren Sie den nicht-denaturierende PAGE-Gel in der Gelkammer. Füllen ter innere und die äußere Kammer mit vorgekühlten Laufpuffer (Tabelle 1). </li><li> Pre-run das Gel mit vorgekühlten Laufpuffer bei 25 mA pro Gel für 15 Minuten im Kühlraum bei 4 ° C. </li><li> Mischungs 15 ul der oben hergestellten Lysaten mit 5 &amp; mgr; l 4x Probenpuffer (Tabelle 1). Die Probe nicht kochen. </li><li> Last 15 ul der Probe und eine native Proteinstandard der Wahl auf dem Gel. Führen Sie das Gel bei 25 mA für 4 Stunden im Kühlraum bei 4 ° C. HINWEIS: Bei semi-quantitativen Analysen, ein Protein Quantifizierungsprotokoll (beispielsweise ein Bradford-Test 23) kann ausgeführt werden , um Belastung von gleichen Mengen an Gesamtprotein pro Spur zu gewährleisten. </li></ol> 3. Western Blot HINWEIS: Im Folgenden wird das Protokoll eines nassen Western-Blot-System. Jede Blotting-Membran verwendet werden. Aktivieren Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membranen in 100% Methanol vor der Äquilibrierung in Blotting-buffer. Die halbtrockene Western-Blot-Technik kann alternativ verwendet werden, jedoch hat sich für große oligomere Komplexe zu optimieren. <ol><li> Zerlegen Sie das Gel und sorgfältig übertragen sie in SDS - Puffer (Tabelle 1). </li><li> Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Bereiten Sie zwei Schwämme, 4 Zellulosefilter Papierblätter und eine Blottingmembran pro Gel. Genießen sie in Blotting - Puffer (Tabelle 1). </li><li> Montieren Sie das Sandwich wie folgt (von unten nach oben): 1 Schwamm, 2 Zellulosefilter Papierbögen, Membran, Gel, 2 Zellulosefilter Papierblätter, 1 Schwamm. </li><li> Setzen Sie das Sandwich in den Blotting-Tank. Stellen Sie sicher, dass die Membran den Pluspol steht, während das Gel die Minus-Pol zugewandt ist. </li><li> Füllen Sie den Löschbehälter mit vorgekühlten Blotting-Puffer. </li><li> Blot bei 90 mA über Nacht bei 4 ° C für eine optimale Proteintransfer Ergebnisse. </li><li> Zerlegen Sie das Sandwich und visualisieren die Proteinstandard durch die Membran in Ponc Inkubationeau S-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfärben der Membran durch sorgfältig den Ponceau S mit entsalztem Wasser gewaschen, bis Sie deutlich die Banden der Proteinstandard zu sehen. </li><li> Markieren Sie die Bänder des Proteinstandard mit einem Stift. Hinweis: Rest Ponceau S mit der Immunfärbung stören können. Um dies zu vermeiden, kann die Membran durch Inkubation in 0,1 M NaOH für 1 min und anschließendes Waschen mit deionisiertem Wasser entfärbt weiter. </li><li> Blockieren die Membran mit Blockierungspuffer (siehe Tabelle 1) für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Visualisieren Protein (e) von Interesse durch Immunfärbung von Antikörpern gegen das Protein unter Verwendung von analysiert werden. HINWEIS: Die menschliche MxA Protein sichtbar gemacht wurde das Kaninchen polyklonalen Antikörper , der spezifisch für menschliches Mx1 Verwendung verdünnt 1: 1000 in Blocking - Puffer (Tabelle 1). Die Antikörperlösung wurde über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Alternativ kann der monoklonale aNTI-MxA - Antikörper (Klon 143) können verwendet werden (Daten nicht gezeigt) 24. </li></ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die in Säugetierzellen durch nicht-denaturierende PAGE, gefolgt von Western-Blot-Analyse ausgedrückt die schnelle Bestimmung des oligomeren Zustand von Proteinen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass die oligomeren Zustand eines bestimmten Proteins können ohne vorherige Proteinreinigung aus ganzen Zelllysaten bestimmt werden. Dies kann für Proteine ​​wichtig sein, die ihre Funktion in Verbindung mit Hilfsfaktoren oligomerisieren oder ausüben. Darüber hinaus si...

Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen 1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau 5. Defekte in Oligomerisierung wirken sich auf die Funktion von Proteinen und können zur Entwicklung von Krankheiten führen. Beispielsweise bildet das Enzym Phenylalaninhydroxylase eines tetrameren Komplexes. Einige Mutationen innerhalb des Proteinkomplexes können die Tetramerbildung schwächen und führen zu der Krankheit Phenylketonurie 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die menschliche MxA Protein ein Interferon (IFN) -induzierten Protein antivirale Effektor ein breites antivirale Aktivität gegen verschiedene RNA als auch DNA - Viren 7 ausübt. Es gehört zur Superfamilie der dynamin artigen großen GTPasen und hat die Fähigkeit , in vitro 8 große oligomere Strukturen zu bilden. Die Oligomerisierung wurde vorgeschlagen , 9,10 M · A vor einem schnellen Abbau zu schützen. Trotz intensiver Bemühungen von vielen Forschungsgruppen bleibt der molekulare Wirkmechanismus weitgehend ungeklärt und die Rolle des Oligomerisierungszustand von M · A für seine antivirale Funktion ist umstritten 9,11,12. In dieser Hinsicht Gao und Mitarbeitern vorgeschlagen , ein Modell , in dem M · A durch die Interaktion mit viralen Nukleoproteine in Form von großen ringartigen oligomeren Strukturen 11 seine antivirale Aktivität ausübt. Jedoch in jüngerer Zeit zeigten wir , dass MxA Dimere antivirale Aktivität aufweisen und mit dem Nukleoprotein von Influenza A Virus 12 interagieren. Basierend auf der Kristallstruktur von M · A, Gao und Mitarbeitern identifiziert mehrere Aminosäurereste in den Grenzflächenbereichen , die 11,13 für die Oligomerisierung in vitro und seine antivirale Funktion wichtig sind. Daher wird, um zu erläutern, welche oligomere Zustand MxA antivirale Aktivität ausübt, haben wir versucht, ein einfaches Protokoll zu schaffen, um schnell die oligmeric Zustand MxA Schnittstelle Mutanten in menschlichen Zellen als auch ausgedrückt bestimmen als endogene MxA nach IFN &amp; alpha; Anregung ausgedrückt. Obwohl es viele Techniken gibt, die die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu untersuchen , wie die Split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) Komplementations - Assay 14, Oberflächenplasmonresonanz 15 und Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) 16 häufig verwendet werden, bieten sie nicht Informationen über die genaue Stöchiometrie eines oligomeren Proteinkomplex. Zur Untersuchung dieser besonderen Aspekt Techniken wieMehrwinkellichtstreuung (MALS) 17 und analytische Ultrazentrifugation 18 sind sehr nützlich. Normalerweise analysiert die Proteine ​​mit Hilfe dieser Methoden sind gereinigte Proteine. Oligomerisierungsverfahren kann auch auf anderen zellulären Faktoren abhängen. Wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, ist die Analyse schwieriger. Zusätzlich sind einige Proteine schwierig in E. auszudrücken coli und zu reinigen. Daher sind diese Verfahren nicht die optimale Wahl Protein Oligomerisierung in der zellulären Umgebung zu analysieren. Zusätzlich erfordern diese Techniken teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind. Nicht-denaturierende Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE), size exclusion chromatography oder chemische Vernetzung durch herkömmliche Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE gefolgt sind nützliche Werkzeuge für die Charakterisierung der Bildung von Oligomeren aus Zelllysaten 2,19,20. Diese Methoden erfordern keine spezielle Ausrüstung und kann leicht pe seinin einem Standard-Labor rformed. Wir haben uns zunächst verschiedene chemische Vernetzungsprotokolle ausgewertet, die invariant führte zu unspezifischen Aggregation und Ausfällung von M · A. Deshalb testeten wir als nächstes nicht denaturierende PAGE-Protokolle. Als nicht-denaturierende PAGE die Verwendung von SDS ausschließt, hängt die Migration von Proteinen auf ihre Mutter Ladung. Blau-native PAGE verwendet Coomassie Brilliant Blue G250 Proteine zu laden mit einer insgesamt negativen Ladung, ähnlich wie SDS, aber nicht denaturiert das Protein 21. Leider Coomassie Brilliant Blue Präzipitate in Gegenwart hoher Salze und divalente Kationen (zB Mg 2+) , die häufig in Lysepuffer enthalten sind. In Abhängigkeit von den verwendeten Puffer, kann es schwierig sein, die Probe ohne weitere Optimierung von Schritten zu analysieren, die eine Wirkung auf dem oligomeren Proteinkomplex haben. Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Verfahren 22 , um zu bestimmen OligomerisierungMensch MxA Protein aus Zellysaten abgeleitet unter Verwendung von nicht-denaturierende PAGE.

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte, 10K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>In Dialysepuffer voräquilibrieren (wenn eine Glycerinentfernung gewünscht wird) Kann nach Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-Well,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Vorlauf im laufenden Puffer zur Anpassung des Puffersystems</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-frei</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>verwenden 1 Tablette pro 50 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4&nbsp; Flasche a 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td><stark>GIFTIG</stark> Tragen Sie Handschuhe und schützen Sie die</td></tr><tr><td>Augen NativeMark Ungefärbtes Protein Standard &nbsp; 50 & Mikro; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>Belastung 5 &Mikro; l/well</td></tr><tr><td>A549 Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Wachsen in Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Vero-Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Wachsen in Wachstumsmedium (siehe Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Anti-Mx1-Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Anti-Kaninchen-IgG, Meerrettichperoxidase gebundener ganzer Antikörper (ab Esel)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:10.000</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Jodacetamid &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>Lager&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4,5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvat life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Stift&nbsp; Streptokokken 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Schaft, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life</td><td>technologies Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, dialysiert, US-Herkunft 500 ml Gibco Los:42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Zellulose-Filterpapier</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Blotting&nbsp; Membran</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>vollständig, Mini, EDTA-frei</td><td>von Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10%ige Lösung</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glycerophospat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Migros/Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Natriumclorid (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von multi-untereinheit proteinkomplexe der menschen mxa verwendung von nicht-denaturierendes polyacrylamidgel-elektrophorese

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Die Bildung oligomerer Komplexe ist eine entscheidende Voraussetzung für die korrekte Struktur und Funktion vieler Proteine. Das Interferon-induzierte antivirale Effektorprotein MxA übt eine breite antivirale Aktivität gegen viele Viren aus. MxA ist eine Dynamin-ähnliche GTPase und hat die Fähigkeit, oligomere Strukturen höherer Ordnung zu bilden. Ob jedoch eine Oligomerisierung von MxA für seine antivirale Aktivität erforderlich ist, ist umstritten. Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von endogen oder ektopisch exprimiertem MxA in der zytoplasmatischen Fraktion humaner Zelllinien mittels nicht-denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in Kombination mit Western-Blot-Analyse. Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Auswahl der Detergenzien, um die Aggregation und/oder Ausfällung von Proteinen zu verhindern, die insbesondere mit Zellmembranen wie MxA assoziiert sind, ohne deren enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen. Ein weiterer entscheidender Aspekt des Protokolls ist der irreversible Schutz der freien Thiolgruppen von Cysteinresten durch Iodacetamid, um künstliche Wechselwirkungen des Proteins zu verhindern. Dieses Protokoll eignet sich für eine einfache Beurteilung des oligomeren Zustands von MxA und ermöglicht darüber hinaus eine direkte Korrelation der antiviralen Aktivität von MxA-Grenzflächenmutanten mit ihren jeweiligen oligomeren Zuständen.

Die Verwendung von nicht-denaturierende PAGE, analysierten wir die oligomere Zustand des menschlichen Wildtyp M · A, die dimeren Schnittstelle Mutanten M · A (R640A) und M · A (L617D) sowie die monomeren Schnittstelle Mutant M · A (M527D) aus Zelllysaten 12. Zellen wurden in einem Puffer, der 1% Octylphenoxypolyethoxyethanol lysiert (NP-40) und Iodacetamid Protein Solubilisierung und zum Schutz der freien Thiolgruppen zu gewährleisten (siehe Abbildung 1). Wie zuvor beschrieben, Salz und klein...

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des Dynamin-ähnlichen GTPase MxA-Proteins aus Lysaten menschlicher Zellen unter Verwendung einer Kombination aus nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse.

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Anzahl der Untereinheiten in homooligomeren Protein-Komplexen in Zelllysaten mittels nicht-denaturierender Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise den oligomeren Zustand von Proteinen, die an grundlegenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie weder die Reinigung der homooligomeren Protein-Komplexe noch spezielle, kostspielige Geräte erfordert.Daher kann es in den meisten Laboratorien durchgeführt werden. Dieses Experiment verwendet zwei Zelltypen: A549-Zellen, die das endogene Myxovirus-Resistenz-A-Protein (MxA) exprimieren, und Virozellen, die MxA überexprimieren.Säen Sie die A549-Zellen und Virozellen in Sechs-Well-Platten mit je zwei Milliliter Wachstumsmedium aus. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Zellkulturinkubator. Am folgenden Tag werden die Zellen geerntet.Waschen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter PBS und lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung für etwa fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sobald sich die Zellen von der Schale lösen, geben Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und mischen vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Überführen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein zwei Milliliter fassendes Reaktionsgefäß, und pelletieren Sie sie mithilfe einer Tischzentrifuge.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren, ohne den Zellpellet zu stören. Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein Milliliter eiskaltes PBS hinzufügen und die Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Pelletieren Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Pipettieren, ohne den Zellpellet zu lösen. Geben Sie 200 Mikroliter eiskaltes Lysepuffer hinzu, resuspendieren Sie die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und stellen Sie anschließend auf Eis. Schützen Sie das Lysat umgehend vor Licht, indem Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, da Iodoacetamid im Lysepuffer lichtempfindlich ist.30 Minuten auf Eis inkubieren. Die Verwendung von Iodoacetamid ist entscheidend, da Iodoacetamid die Thiolgruppe freier Cysteine irreversibel schützt, indem es eine Thioetherbindung eingeht, und so eine künstliche Proteinaggregation verhindert. Anschließend zelluläre Trümmer durch Zentrifugation in einer vorab gekühlten Tischzentrifuge entfernen.Während der Zentrifugation bereiten Sie Dialysekolonnen mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 vor. Befestigen Sie die Dialysekolonnen an einem Schwimmkörper und stellen Sie sie in einen Becher, der mit vorab gekühltem Dialysepuffer gefüllt ist, um die Kolonnen zu equilibrieren. Berühren Sie die Membran nicht.Stellen Sie einen magnetischen Rührer in einen Becher und bringen Sie den Becher in den Kühlschrank. Unter Verwendung des magnetischen Rührers zur Sicherstellung einer sanften Rührung 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius anpassen. Nach 20 Minuten entfernen Sie die Säulen vom Dialysepuffer und vom Schwimmkörper.Überführen Sie die klaren Lysate mittels Pipette in die vorbereiteten Dialysesäulen, ohne die Membran zu berühren. Befestigen Sie die Säulen an einem Schwimmkörper und stellen Sie sie zurück in das mit Dialysepuffer gefüllte Becherglas. Danach überführen Sie das Becherglas in den Kühlschrankraum.Dialysieren Sie das Lysat mindestens vier Stunden bei vier Grad Celsius unter vorsichtigem Rühren mit einem Magnetrührer, um kleine Metaboliten und Salze zu entfernen, die die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese stören könnten. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, überführen Sie jede dialysierte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie ausgefallene Präzipitate durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge.Die Elektrophorese muss unmittelbar nach der Dialyse der Lysate durchgeführt werden, um die Dissoziation der oligomeren Protein-Komplexe zu verhindern. Füllen Sie die innere und äußere Gelkammer mit vorgekühltem Laufpuffer. Führen Sie einen Vorkurs des nicht-denaturierenden Polyacrylamidgels mit vorgekühltem Laufpuffer bei 25 Milliampere pro Gel für 15 Minuten bei vier Grad Celsius durch.Mischen Sie 15 Mikroliter des hergestellten Lysats mit fünf Mikrolitern 4X-Probenpuffer. Laden Sie einen beliebigen nativen Proteinstandard und 15 Mikroliter Probe auf das Gel auf. Führen Sie das Gel vier Stunden lang bei 25 Milliampere und vier Grad Celsius durch.Wenn die nicht-denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese abgeschlossen ist, demontieren Sie das Gel und überführen es vorsichtig in SDS-Puffer. Inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie pro Gel zwei Schwämme, vier Zellulosefilterpapiere und eine Übertragungsfolie vor und tauchen Sie diese in den Übertragungspuffer ein.Bauen Sie das Sandwich von unten nach oben wie folgt auf: Eine Schwammscheibe, zwei Zellulosefilterpapiere, eine Abdruckmembran, das Gel, zwei Zellulosefilterpapiere und eine Schwammscheibe. Legen Sie das Sandwich in den Abdruckbehälter, wobei die Membran zur Plus-Elektrode und das Gel zur Minus-Elektrode zeigen muss.Füllen Sie den Blott-Tank mit vorgekühltem Blott-Puffer. Für optimale Proteinübertragungsergebnisse über Nacht bei vier Grad Celsius bei 90 Milliampere blotten. Am folgenden Tag das Sandwich auseinanderbauen.Die Membran fünf Minuten bei Raumtemperatur in Ponceau-S-Lösung inkubieren, um das Proteinstandard sichtbar zu machen. Die Membran entfärben, indem sie in entionisiertes Wasser gelegt und gewaschen wird. Nach dem Übertragen der Membran in eine Wanne die Banden des Proteinstandards mit einem Stift markieren.Blocken Sie die Membran mit Blockpuffer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden die Proteine von Interesse mittels Immunfärbung unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers, der gegen MxA gerichtet ist, wie im Textprotokoll beschrieben, sichtbar gemacht. Virozellen, die endogenes MxA fehlen, wurden mit rekombinantem Wildtyp-MxA sowie monomeren und dimeren MxA-Varianten transfiziert.Die Migration der rekombinanten MxA-Variante bei ihrem erwarteten molekularen Gewicht bestätigte deren oligomeren Zustand. Das ektopisch exprimierte Wildtyp-MxA migrierte als Tetramer. Diese rekombinanten Proteine wurden anschließend verwendet, um den oligomeren Zustand des endogenen humanen MxA-Proteins aus Interferon-alpha-stimulierten A549-Zellen zu untersuchen.Die Ergebnisse zeigten, dass die Größe von MxA in Lysaten von mit Interferon-alpha stimulierten A549-Zellen einem Tetramer entspricht. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in anderthalb Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben während des gesamten Ablaufs nicht einzufrieren und wieder aufzutauen, da dies Proteinwechselwirkungen zerstören oder Proteinaggregationen verursachen könnte.Außerdem ist es wichtig, die Proben während des Lyse-Schritts vor Licht zu schützen, wenn mit lichtempfindlichen Reagenzien wie Iodoacetamid gearbeitet wird. Nach dem nicht-denaturierenden SDS-PAGE können weitere Methoden wie die Protein-Gelextraktion, die enzymatische Aktivitätsbestimmung oder ein zweidimensionales PAGE durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie die enzymatische Aktivität und die Charakterisierung möglicher hetero-oligomerer Komplexe zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Zusammensetzung oligomerer Protein-Komplexe in Kultierzellen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zelllysate aus Zellkulturen herstellt, um oligomere Proteine mittels nicht-denaturierender PAGE-Analyse zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Iodoacetamid äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Augenschutz.

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Biochemistry

Biochemie

In diesem Video, beschreiben wir die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen (MPL) durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). In einer ersten Dimension sind dialysiert Zelllysaten durch BN-PAGE getrennt an die einzelnen MPL zu identifizieren. In einer zweiten Dimension SDS-PAGE, werden MPC von Interesse weiter unterteilt, um ihre Wähler durch Immunoblot analysieren.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

Dieses Video beschreibt multimere PAGE zur Trennung von nativen Proteinkomplexen aus Gewebehomogenaten. Die Technik ist eine Mischung aus Blue Native-PAGE- und SDS-PAGE-Techniken. Die getrennten Komplexe können charakterisiert und auf ihre Rolle bei der Zellfunktion untersucht werden.

Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Mucine sind hochmolekulare Glykokonjugate mit einer Größe von 0,2 bis 200 Megadalton (MDa). Aufgrund ihrer Größe dringen Muzine nicht in herkömmliche Polyacrylamid-Gele ein und benötigen größere Poren zur Abscheidung. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Mucin-Agarose-Gelelektrophorese zur Verfügung, um die relative Quantifizierung zu bewerten und die Polymerassemblierung zu untersuchen.

Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung von funktionellen mitochondrialen Elektronentransportkettenkomplexen (Cx) IV und deren Superkomplexe unter Verwendung der nativen Elektrophorese, um Informationen über deren Zusammenbau und Struktur zu zeigen. Das native Gel kann Immunoblotting, In-Gel-Assays und Reinigung durch Elektroelution unterworfen werden, um einzelne Komplexe weiter zu charakterisieren.

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von Größenausschlusschromatographie mit Multi-Winkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) zur absoluten Charakterisierung von Proteinen und Komplexen in Lösung. SEC-MALS bestimmt das Molekulargewicht und die Größe reiner Proteine, nativer Oligomere, Heterokomplexe und modifizierter Proteine wie Glykoproteine.

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Lernen Sie die Charakterisierung oligomerer Protein-Komplexe des menschlichen MxA-Proteins mittels nicht-denaturierender PAGE und Western Blot aus Zelllysaten. Diese Methode erfordert keine aufwendige Proteinreinigung.

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Video) | JoVE Journal

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

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