Name: Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Erfahren Sie die digitale Quantifizierung von microRNA in Vollblut ohne Amplifikation zur Erforschung von Reizdarmsyndrom. Diese hochautomatisierte Plattform ermöglicht präzise Biomarker-Identifikation.

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Die Autoren danken Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06 für die Finanzierung durch das U.S. Department of Health and Human Services, die National Institutes of Health, das National Institute of Nursing Research Research und die Division of Intramural Research, Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06, die Intramural Research Training Awards für Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Abey und Leeanne B. Sherwin für besondere Unterstützung durch den Burroughs Wellcome Fund. 
Die hierin geäußerten Meinungen und die Interpretation und Berichterstattung über diese Daten liegen in der Verantwortung des/der Autor(en) und sollten nicht als offizielle Empfehlung, Interpretation oder Politik der National Institutes of Health oder der Regierung der Vereinigten Staaten angesehen werden.

Die hier beschriebenen Untersuchungen wurde von der Institutional Review Board der National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941) zugelassen. 1. Sammeln von Vollblut Proben <ol><li> Vollblut-Proben (2,5 ml) von Studienteilnehmern über Venenpunktur in Blutentnahmeröhrchen mit einem RNA-Stabilisierungslösung (unter Berücksichtigung der langfristigen Lagerung) enthält, und speichern Sie sie bei -80 ° C bis zur RNA-Reinigung. </li></ol> 2. Die Gesamt-RNA-Reinigung <ol><li> Auftauen und die Blutröhrchen für 2 Stunden inkubieren, und sie dann Zentrifuge bei 5000 einen ausklappbaren Rotor für 10 min unter Verwendung von x g. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Gießen oder Pipettieren sie in einen Abfallrohr ab, darauf achten, daß das Pellet zu stören. </li><li> Waschen Sie das Pellet durch Zugabe von 4 ml RNase-freies Wasser, ersetzen Sie die Kappe sicher und Wirbel, bis das Pellet sichtbar gelöst ist. Zentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor bei 5.000 × g für 10 min und WiederBewegen Sie den Überstand, wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li><li> In 350 ul BM1 Puffer (mitgeliefert) zum Pellet. Vortex das Pellet bis sie sichtbar aufgelöst ist, und es in ein 2-ml-Verarbeitung Rohr für die automatisierte Gesamt-RNA-Extraktion. </li><li> Führen automatisierte Reinigung von intrazellulären RNA, einschließlich miRNA, aus dem Vollblut eines kommerziell erhältlichen RNA Extraction Kit, der auf einem Roboter-RNA-Extraktionssystem automatisiert werden kann. HINWEIS: Die automatisierte Robotersystem verwendeten wir können zwölf Proben gleichzeitig verarbeiten, und es dauert 3 Stunden für die RNA-Reinigungsprotokoll zu vervollständigen. <ol><li> Legen Sie die vorinstallierte Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Puffer und Reagenzien, die in der RNA-Reinigungskits in die Roboter-RNA-Extraktionssystem zur Verfügung gestellt. </li><li> Wählen Sie den &quot;Blood miRNA Part A&quot; Protokoll aus der Protokollauswahlmenü und den Lauf starten. HINWEIS: Siehe Ergänzende Materialien für eine Beschreibung der automatisierten Verfahren. </li><li> Sobald der Roboter zusammenmpleted Teil A des automatisierten miRNA Reinigungsprotokoll, leeren Sie den Behälter Abfall und entfernen Sie die verwendeten Kunststoffe und Reagenzienbehälter aus dem Robotersystem. </li><li> Schließen Sie die Abdeckungen auf allen Mikrozentrifugenröhrchen, die eluierte RNA und legen Sie sie in den Shaker-Adapter. Wählen &quot;Blood miRNA Part B&quot; aus der Protokoll - Auswahlmenü die Proben bei 65 o C für 5 min inkubiert. </li><li> Sobald der Roboter läuft Teil B des miRNA Reinigungsprotokoll abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort die Proben und kühlen sie auf Eis. </li></ol></li><li> Quantifizieren und das gereinigte RNA-Qualität mit einem Spektralphotometer zu bewerten. HINWEIS: Gemäß den Protokoll-Empfehlungen für die miRNA-Assay, einer Konzentration von mindestens 33 ng / &amp; mgr; l erforderlich ist, und alle Proben sollten ein 280/260-Verhältnis von 1,9 und einen minimalen 260/230 Verhältnis von 1,8 erfüllen oder übertreffen die Abwesenheit, um sicherzustellen, organische Kontamination von Bedeutung, welche die Testleistung beeinträchtigen kann (siehe 17 bis Referenz). </li><li> Lagern Sie die Proben bei -80 o C </li></ol> 3. miRNA Probenvorbereitung <ol><li> Normalisieren 12 RNA-Proben auf 33 ng / ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Bereiten Sie eine 1: 500 Verdünnung der miRNA-Kontrollen im Assay-Kit nukleasefreiem Wasser zur Verfügung gestellt. Halten Sie sich auf dem Eis. </li><li> Bereiten Sie das Glühen Master-Mix: Kombinieren Sie 13 ul Anelierungspuffer (zur Verfügung gestellt), 26 &amp; mgr; l miRtag Reagenz (zur Verfügung gestellt), und 6,5 ul der miRNA-Kontrollen (hergestellt in Schritt 3.2) mit 10- und 20-ul-Pipetten. </li><li> Unter Verwendung eines 10-ul - Pipette, fügen 3,5 ul des Glühens Mastermix und 3 &amp; mgr; l der RNA - Probe (dh 100 ng) zu jedem von zwölf 0,2-ml Streifenröhrchen. Flick zu mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g), und in den Thermocycler (94 o C für 1 min, 65 ° C für 2 Minuten und 45 ° C für 10 min; halten bei 48 ° C) . </li><li> Bereiten Sie die Ligatur Master-Mix durch die Kombination von 3 μl der Puffer Ligatur (zur Verfügung gestellt) und 19,5 &amp; mgr; l des Polyethylenglykols (PEG; bereitgestellt), um eine 20 &amp; mgr; l-Pipette. Hinzufügen, 2,5 &amp; mgr; l des Ligations Mastermix zu jedem der Streifen Rohre aus Schritt 3.4 eine 10-ul-Pipette. <ol><li> Vorsichtig mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g), und zurück zum Thermocycler bei 48 ° C für 5 min. Nach 5 min eine 10-ul - Pipette, fügen 1 ul Ligase zu jedem Röhrchen direkt in den Thermocycler und brüten sie bei 48 ° C für 3 min, 47 ° C für 3 min, 46 ° C für 3 Minuten, 45 o C für 5 min und 65 o C 10 min; bei 4 o C halten </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Schläuche aus dem Thermocycler, mischen sie sanft, drehen sie nach unten mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g) und fügen 1 ul Ligatur clean-up-Enzym (zur Verfügung gestellt). Die Röhrchen in den Thermocycler (37 o C für 1 Stunde und 70 o C für 10 min; halten bei 4 o </sbis&gt; C). Verwenden Sie ein 10-ul-Pipette. </li><li> Entfernen Sie die Rohre und eine 100-ul-Pipette, dann werden 40 ul Nuklease-freies Wasser, zu mischen und Spin-down mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g). </li></ol> 4. miRNA Hybridization <ol><li> Auftauen Reporter und Fangsonde Sets (mitgeliefert) auf Eis und Spin sie unten ein Benchtop-Mini-Mikro mit (2000 × g). </li><li> Mit einer 200-ul-Pipette, fügen Sie 130 ul Hybridisierungspuffer mit dem Reporter Codesatz Rohr (130 ul) der Hybridisierungs Master-Mix zu erstellen. Mischen und Spin-down mit einem Benchtop-Mini-Mikro (2000 × g). HINWEIS: Reporter und erfasst Sonden sind spezifisch und Standard für jede miRNA in der Platte enthalten. Benutzerdefinierte Bedienfelder und benutzer entworfen Erfassung und Sondensätze entworfen werden. </li><li> In 12 neuen Streifen Röhrchen 0,2 ml, fügen Sie 20 ul des Hybridisierungs Mastermix ein 20-ul-Pipette. </li><li> Denaturieren die miRNA Proben aus Schritt 3.7 bei 85 o C for 5 min und kühlt sie auf Eis. Werden 5 &amp; mgr; l zu jedem der Rohre von Schritt 4.3 eine 10-ul-Pipette. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler bis 65 ° C bei einer 30-ul - Volumen-berechnete Temperatur und Heizdeckel auf ewig Zeiteinstellung (programmiere es nicht am Ende des Laufes bis 4 ° C herunterzufahren). </li><li> Mit einem 10-ul - Pipette werden 5 ul der Fangsonde in jedes Röhrchen gesetzt, mischen, Spin - down mit einem Benchtop - Mini - Mikro (2000 × g) und legen Sie sofort in den Thermocycler bei 65 o C. Inkubieren für nicht weniger als 12 Stunden und nicht mehr als 30 Stunden. </li></ol> 5. Vorbereitung Station und Digital-Analyzer <ol><li> Laden Sie die Vorbereitungsstation. <ol><li> Öffnen Sie die Station Tür und laden Sie die Reagenz-Platten (im Lieferumfang enthalten), Patrone (mitgeliefert), Pipettenspitzen (mitgeliefert), vorbereiteten Proben in zwölf 0,2-ml-Streifen Rohre und zwölf leere 0,2-ml Streifenröhrchen (mitgeliefert). Entfernen Sie die Streifen Röhrchendeckel und Reagenzienplattenabdeckung. Schließen Sie die Prep-StationTür und führen Sie den entsprechenden Test aus dem Bedienfeld. HINWEIS: Post-Hybridisierung Verarbeitung ist die gleiche, unabhängig von der zu testenden Lauf. Alle Reagenzien und Plastikerzeugnisse sind vorverpackten und bedürfen keiner Vorbereitung, andere als sie auf Raumtemperatur gebracht und die reagenzenthaltenden bei 2000 · g 96-Well-Platten für 2 Minuten zum Stillstand kommen. Alle Komponenten sind in klar definierten Positionen in der Vorbereitungsstation geladen. Siehe Ergänzende Materialien für eine Beschreibung der automatisierten Verfahren. </li></ol></li><li> Visualisieren und die Barcodes der immobilisierten und orientierten tripartite Komplexe zählen. <ol><li> Nehmen Sie die Patrone aus der Vorbereitungsstation, verschließen Sie diese mit den Deckgläsern versehen, und legen Sie sie im Digital-Analysator in den Schlitz oberhalb der Kamera-Optik. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Test (miRNA-Panel-Test) und Test-Version auf dem Assay-Kit angezeigt und das Programm auszuführen. HINWEIS: Der Digital-Analysator nimmt dann Sichtfeld Bilder für jede Probenposition eint vier Anregungswellenlängen, so dass die fluoreszierenden Barcodes gelesen und decodiert werden. Spezifischen Barcodes, entsprechend einer spezifischen miRNA, werden gezählt. </li><li> Exportieren Sie die Daten-Dateien auf einem USB oder direkt mit dem Server über eine Internet-Verbindung. </li></ol></li></ol> 6. Datenverarbeitung und -analyse <ol><li> Klicken Sie auf die &quot;Rohdaten&quot; und wählen Sie &quot;Import RCC-Dateien&quot;. Wählen Sie den Ordner mit RCC-Dateien (Rohdaten-Dateien) aus dem USB. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, wählen Sie alle Felder aus, QC, und klicken Sie auf &quot;Import&quot;. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;Neue Studie&quot; Tab. Nennen und beschreiben Sie die Studie und zu speichern. </li><li> In der neuen Studie, wählen Sie die &quot;New Experiment&quot; Registerkarte und den Namen und das neue Experiment beschreiben. Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot; und wählen Sie den RLF-Ordner aus dem linken Bereich, die die entsprechenden Rohdaten-Dateien enthält, die hochgeladen wurden. Sobald sie ausgewählt wurde, klicken Sie auf &quot;Keep Selected&quot;, und klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> HinzufügenAnmerkungen, falls gewünscht und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Wählen Sie die Hintergrund-Subtraktion Methode; entweder negative Kontrolle, leere Spur Subtraktion oder eine benutzerdefinierte Subtraktion kann ausgewählt werden. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. HINWEIS: Bestimmen Sie die am besten geeigneten Ansatz Hintergrundkorrektur auf der Grundlage der technischen Parameter und biologischen Kontext der Studie. HINWEIS: Zählungen sind weniger präzise für Low-Fülle-Ziele. Für die Zwecke der Studie, die wir hier beschreiben, wurden die Daten zunächst ohne Hintergrundkorrektur verarbeitet, um QC-Parameter untersuchen und miRNA unterschiedlicher Häufigkeiten über technische Replikate Variation zählt zu untersuchen. Die Daten wurden dann wieder aufbereitet unter Verwendung eines 25-count Hintergrund Schwelle. </li><li> Wählen Sie den &quot;Top 100&quot; Normalisierung, und klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Um die Verhältnisdaten zu erhalten, wählen Sie die Verhältnisparameter und klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Fertig&quot;. </li><li> Klicken Sie auf den Namen abperiment in linken Bereich ein Dropdown-Menü zu offenbaren &quot;Raw&quot;, &quot;Normalized&quot;, &quot;gruppierte&quot;, &quot;Ratio Data&quot; und &quot;Analyse von Daten&quot; enthalten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Rohdaten&quot; und beobachten einen QC-Bericht im rechten Fensterbereich. Beobachten Sie eine Fahne neben den Proben, die nicht die Standard-QC-Parameter übergeben kann. Erstellen Sie eine neue &quot;Studie&quot;, die nicht die markierten Proben nicht enthalten und erneut zu verarbeiten, wie beschrieben, oder einfach markierten QC-Proben aus der Datenanalyse Schritt ausschließen, indem Sie &quot;Ausschließen Proben durch QC / Normalisierung Flag&quot;. <ol><li> Export &quot;Raw&quot;, &quot;Normalized&quot; oder &quot;gruppierte&quot; Datendateien in CVS oder einem anderen kompatiblen Dateiformat für die Analyse in einem anderen statistischen oder Microarray-Software. </li></ol></li><li> Wählen Sie &quot;normalisierten Daten&quot; aus dem linken Bereich und wählen Sie die Proben in der Analyse im rechten Fensterbereich einbezogen werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analyse&quot; und wählen Sie die gewünschte Analysetyp (zB &quot;Heat Map &amp; #34 ;, &quot;Violin Plot&quot;, &quot;Box-Plot&quot;, &quot;Scatter Plot&quot; oder &quot;Histogramm Plot&quot;). Wählen Sie die gewünschten Ausschlusskriterien Boxen (zB ausschließen die Ausreißer - Proben oder Gene, schließen die Proben durch QC - Flags, schließen Sie die Kontrollgene und / oder die Normalisierung Sonden aus der Datenanalyse ausgeschlossen). </li><li> Wählen Sie einzelne Proben werden aus der Analyse ausgeschlossen, wie gewünscht. </li><li> Wählen einzelner Gene ausgeschlossen werden aus oder in die Analyse einbezogen, wie gewünscht. </li><li> Wählen Sie die Parameter für die gewählte statistische oder Datenvisualisierung Manipulation und klicken Sie auf &quot;Fertig stellen&quot;. </li></ol>

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W.A.H., S.K.A., N.H.F. und R.M.P. halten ein US-Patent (Nr. PCT/US14/38638) für eine zirkulierende miRNA-Signatur des Reizdarmsyndroms, die von der hierin beschriebenen Forschung ausgeht.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Für den Assay miRNA Insbesondere ist es wichtig, nicht ungereinigt Lysate verwenden (diese können in mRNA und Protein-Assays verwendet werden), da die Reagenzien nicht für die Verwendung mit Lysaten optimiert und Probenvorbereitungsreaktionen wahrscheinlich gehemmt werden. Zusätzlich durch Verunreinigungen aus Lyse und RNA Reinigungsschritte über (zB Guanidinium - Verbindungen, Ethanol und Phenolen) können Ligation und Probenreinigung Reaktionen hemmen. Gute Qualität RNA ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit des miRNA-Assays. ein Thermocycler mit beheizbarem Deckel zu verwenden ist kritisch richtige Temperaturkontrolle, um sicherzustellen, die Leistung aller Reaktionsschritte zu optimieren. Während Schritt 3.5.1, ist es wichtig, nicht die Streifen aus dem Thermocycler zu entfernen, um die Temperatur während der Zugabe der Ligase zu halten. Das Entfernen der Streifen hinzuzufügen, um die Ligasewird beeinträchtigt die Reaktion. Wenn die Schritte der Hybridisierung durchgeführt wird, ist es entscheidend, kräftiges Schütteln, Pipettieren oder Schnippen zu vermeiden, wenn Reagenzien in den Mischrohre, da dies die Reportersonden abscheren kann. Um eine optimale Leistung und Konsistenz zu gewährleisten, ist es wichtig, in den Rohren durch leichtes Schnippen gründlich Reagenzien mischen. Immer Spin-down-Reaktionen nach dem Mischen und verwenden eine neue Pipette jedes Mal kippen ein Reagens abgegeben wird genaues Pipettieren, um sicherzustellen, und um ein versehentliches Kreuzkontamination zu vermeiden. Technische Änderungen und Fehlerbehebung Die Code-Sets können angepasst werden nur Ziele von Interesse sind. Auf diese Weise können die Kosten abgewogen werden für die Prüfung großer Probenmengen zu ermöglichen, wenn eine weitere Untersuchung oder eine Bio-Signatur zu validieren. Benutzerdefinierte Sonden können für Gene oder Ziele nicht zur Verfügung von der a - la - carte - Menü gestaltet werden. Die Empfindlichkeit für weniger reichlich Ziele oder niedriger Konzentration RNA kann seinindem für eine längere Hybridisierungszeit manipuliert und / oder durch höhere auflösenden digitalen Zählen verwendet wird. In unserer Studie haben wir die vordefinierte 800 Ziel-miRNA-Panel mit Gesamt-RNA aus Vollblut; jedoch können die Assays angepasst werden weniger miRNAs zu schließen, wenn ein gezielter Ansatz erforderlich ist. Insgesamt 24 Proben können an einem einzigen Tag hergestellt werden, in zwei Gruppen von 12 versetzt angeordnet, da zwei Kassetten bequem durch post-Hybridisierungsverarbeitung auf der Roboter-Vorbereitungsstation und abgebildet auf dem digitalen Analysator am nächsten Tag übergeben werden können. Staggered Verarbeitung der Proben in Chargen von 12 ist wichtig, um die Hybridisierungszeit zu standardisieren. Patronen , die abgebildet wurden , können gespeichert und bei 4 ° C gelagert werden erneut abgetastet werden , wenn Daten Analysen legen nahe , dass eine höhere Auflösung scan die Detektion von selteneren miRNAs verbessern. Nachweis von selteneren Moleküle auch durch Hybridisieren Proben für mehr verbessert werden kann; kann jedoch verlängert Hybridisierung Result in Übersättigung und kann nur die Ergebnisse verbessern, wenn die Ausgangs-RNA-Konzentrationen niedrig sind (wie in der extrazellulären Vesikel abgeleitete RNA). Die Plattform der Empfindlichkeit und Präzision ermöglichen relativ niedriger Abundanz miRNAs zuverlässig gezählt werden. Einschränkungen der Technik Die beschriebene Gen-Expression Assay-Plattform bietet Platz für nur 800 Ziele pro Array auf. Es ist daher nicht für ganze miRNA-Transkriptom / ganze Transkriptom-Studien geeignet. Nur bekannt, beschrieben und angegebenen Ziele können mit der Plattform erfasst werden, so ist sie nicht auf die Entdeckung neuer molekularer Spezies geeignet. Andere Verfahren, wie beispielsweise RNA-Seq oder anderen herkömmlichen Microarray Methoden eignen sich besser für ganze Transkriptom Sondierungsstudien. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden IBS wird durch eine Kombination von Symptomen gekennzeichnet, principally einschließlich Bauchschmerzen; viszerale Überempfindlichkeit; und Veränderungen der Stuhlgewohnheiten, wie häufiges Durchfall, Verstopfung oder eine Kombination aus beidem 9,10. IBS - Symptome haben keine bekannte organische Ursache, und die Patienten präsentieren nicht mit klinisch signifikanten Entzündung, histopathologischen Störungen des Magen - Darm - Gewebe oder systemische Marker 9-12. Forschung deutet darauf hin , dass die biologische Dysregulation in IBS ist subtil, subklinische und heterogen, mit gemeinsamen Themen Schwellen um Entzündungen und Immunfunktion 10. Daher mussten wir Experimentator eingeführte Variation zu steuern, und eine Plattform verwenden, die zuverlässig Erkennung subtile Störungen in der Genexpression fähig war. Die einzigartigen Eigenschaften des Assays und System standardisieren Probenverarbeitung und reduzieren Experimentator durch Automatisierung der Handhabung, die Verringerung technische Varianz hoch reproduzierbare Daten zu erzeugen. Mit diesen Funktionen können für gezielte Untersuchungen und produzieren hochpräzise und replicable Daten. Dies ermöglicht die Erkennung von subtilen Störungen und Störungen unter niedrigem Expression Ziele, die durch die Signale von reichlicher Ziele übersehen oder überschwemmt werden kann, wenn Intensitäts- oder Amplifikation basierenden Verfahren. PCR-basierte Mikroarrays und RNA-Seq Methoden sind brauchbare Alternativen zu den beschriebenen Plattform und als alternative attraktiv sein kann, wenn höhere Durchsätze erforderlich sind, oder wenn es das Ziel ist, die gesamte Transkriptom zu charakterisieren oder zu neuen Molekülen zu suchen. Allerdings Alternativen durchführen kann nicht so gut in genau und sensibel Nachweisen und Quantifizieren von seltenen Ziele und subtile Störungen. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Zirkulierende miRNA-Expression in IBS Teilnehmer zeigten eine Reihe von Störungen, die sowohl signifikant und konsistent zu sein innerhalb der Kategorien gefunden wurden. Die identifizierten miRNAs wurden mit entsprechenden pathwa assoziiertys und pathologischen Bedingungen, einschließlich einer funktionellen Schmerzzustand (miR-342-3p: chronische Blasenschmerzen) 8 und Entzündung (miR-150) 13. Das Beispiel Studie wurde auf einer explorativen Kohorten-basierte verwendet Ziele und Systeme von Interesse zu definieren. Eine gezieltere kleinere miRNA-Array wurde dann konstruiert, die pro Probe Kosten gesenkt werden und damit für viel größere Kohorten in einer kosteneffektiven Art und Weise, um Signaturen und Biomarkern analysiert werden zu validieren und zu verfeinern. Die Genexpression Plattform - Assay - System sorgt für ein Gleichgewicht zwischen der traditionellen explorativen Natur des Mikroarrays und gezieltere, hypothesengeleitete Datenerfassung weiter zu verfeinern und zu testen molekularen Signaturen und Biomarker 14-16. Das Verfahren wird verwendet werden , um molekulare und Protein Störungen in in vivo zu untersuchen und in - vitro - Modellen , bei denen die beschriebenen Ziel miRNAs sind experimentell überexprimiert oder gehemmt. Neue Tests erlauben die gleichzeitige Quantifizierung von mRNAs und proteins direkt von Zell- und Gewebe Lysaten. Darüber hinaus kann durch die Reinigung von bestimmten Fraktionen der peripheren Blut zu optimieren und Exkremente (zB Urin) und durch die Anpassung und bestimmte Testparameter zu optimieren, molekularen Profile und Signaturen mit niedrigem Molekular Konzentration Fraktionen (zB exosomalen Fraktionen) werden geprüft.

Reizdarmsyndrom (IBS) ist die häufigste ambulante Diagnose in Gastroenterology, befällt 10 bis 15% der Bevölkerung und die eine erhebliche Belastung für das Gesundheitswesen. Derzeit gibt es keine allgemein anerkannte diagnostische Biomarker für IBS (dh wird die Diagnose anhand von klinischen Symptomen und anderen organischen Störungen auszuschließen, wie GI Krebserkrankung, chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Magen - Darm (GI) Infektionen). Wenn Gen studieren Expressionsprofile gemeinsam Bedingungen mit subklinischer Histopathologie, wie IBS, hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit (Reproduzierbarkeit) benötigt werden , wie Störungen in der Genexpression Profile 1-3 oft subtil sind. miRNAs wurden als sowohl diagnostische und funktionale Ziele in IBS 4,5, identifiziert und wir sind besonders daran interessiert , bei der Beurteilung ihrer Verwendung als Biomarker der IBS-assoziierten biologischen Störungen 3,4,6,7 zirkulieren. Die klinische Verwendung von circulating Biomarkern ist von aktuellem Interesse wegen der Leichtigkeit und minimal - invasive Art der Sammlung der Quelle &#39;Biomarker (zB peripheren Blut) von Patienten. Die Genexpression Plattform-Tests, die aufgrund ihrer einzigartigen chemischen und schlanke, meist automatisierten Workflow, bieten eine Microarray-Plattform, die für die gezielte Entdeckung breit und anpassbare Abdeckung (800 Ziele in einer einzigen Reaktion) des Transkriptom zur Verfügung stellt. Sie ergeben auch eine hohe Präzision und Linearität in einem breiten Spektrum von Expressionsniveaus in der Quantifizierung von transkriptomischen Zielen. Der Test erfordert nicht die reverse Transkription von RNA, die Amplifikation resultierenden cDNA oder andere enzymatische Reaktionen. Somit werden durch das Verfahren der digitalen Zähl- reduziert mögliche Fehler durch die hohen Taktzahlen der Amplifikation von RNA-Spezies mit geringer Häufigkeit oder seltene Spleißvarianten eingeführt. Dies bedeutet, dass eine Vielzahl von Probentypen, wie gereinigtes GesamtRNA (dh mRNA + miRNA), RNA aus Formalin fixierten Paraffin eingebettetem (FFPE) Proben sowie grobe Gewebe und Zell - Lysate können mit den Assays verwendet werden. RNAs von Interesse sind, unter Verwendung eines Paars von Sonden (capture und Reportersonden) erfasst, die jeweils eine zielspezifische Sequenz enthält, die einen entsprechenden Bereich auf der Ziel-RNA erkennt. Um zu gewährleisten , ist die Detektion von kurzen RNAs (dh miRNAs), die reife miRNA - Sequenz durch Tempern eines einzigartigen Oligonukleotid - Markierung (miRtag) an das 3&#39; - Ende des Moleküls verlängert. Ein Überbrückungs Oligonukleotid, das sowohl mit einem Teil des reifen Ziel-miRNA und der miRNA-spezifische miRtag kostenlos ist, wird verwendet, Sequenzspezifität sicherzustellen. Erfassung und Reportersonden abzubinden zum 3 &#39;und 5&#39;-Ende der reifen miRNA-miRtag komplex sind. Die Einfangsonden eine Biotin-Markierung am 3&#39;-Ende aufweisen, die es ihnen ermöglichen, auf die Oberfläche einer mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträger zu befestigen, fixing der Fänger-Sonde-miRNA-miRtag-Reportersonde Komplex mit dem Schlitten. Ein elektrischer Strom wird dann verwendet, um den Komplex auf der Gleitfläche zu orientieren, so dass Fluoreszenz Barcodes durch die Reportersonde an dem Ende eines Mikroskops und ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) -Kamera zu &#39;5 durch visualisiert werden. Barcodes werden gezählt und dekodiert wird, eine Zählung der spezifischen Ziel miRNAs ergibt. Die fluoreszierende Strichcode besteht aus sechs Positionen, die durch eine von vier fluoreszierenden Farben belegt werden kann, die verwendet werden können, mehr als 4.000 Farbbarcode Kombinationen, wobei jede Codierung für eine bestimmte RNA zu konstruieren. Probenvorbereitung (dh RNA Reinigung oder Zell- / Gewebe Lysat - Zubereitung) sowie die Hybridisierung der Fänger und Reporter - Sonden werden an der Bank durchgeführt. Zwölf Proben können auf einem einzigen Schlitten gemultiplext werden. Nach der Hybridisierung über Nacht, alle weiteren Probenvorbereitung wird von einem Roboter-Vorbereitungsstation durchgeführt. Die geladenen Objektträger werden dann auf Anzeige übertragenigital Analysator für die Abbildung, Zählen, Decodierung und Datenverarbeitung. Die resultierenden Daten werden auf die beiliegende Software importiert, wo sie weiter mit einem hohen Grad an Benutzersteuerung verarbeitet. Die einzigartige Chemie, einfache Zubereitung, automatisierte Natur, einfacher Datentyp (Counts) und insgesamt optimierten Workflow des Assays ermöglichen hochpräzise Genexpression Quantifizierung, es ein nützliches Werkzeug zu machen bei der Untersuchung zirkulierender miRNA-Expressionsprofile und Signaturen in der funktionellen Bedingungen wie IBS.

<table><tbody><tr><td>nCounter Prep-Station</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>Essential</td></tr><tr><td>nCounter Digital Analyzer</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>Essential</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Kann eine geeignete gleichwertige</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>verwenden Jede</td><td>N/A</td><td>Kann eine geeignete gleichwertige</td></tr><tr><td>MiniMicroCentrifuge</td> verwenden <td>Jede</td><td>N/A</td><td>Kann verwendet werden geeignete äquivalente</td></tr><tr><td>Pipetten (1.000, 100, 20, 10 &#181; l)</td><td>Beliebig</td><td>N/A</td><td>Kann ein geeignetes gleichwertiges</td></tr><tr><td>Qiacube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td> kann <td>ein geeignetes gleichwertiges</td></tr><tr><td>PAXgene Blood miRNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>763134</td><td>verwenden Kann ein geeignetes äquivalentes</td></tr><tr><td>PAXgene Blutröhrchen</td><td>verwenden VWR</td><td>77776-026</td><td>Kann ein geeignetes äquivalentes</td></tr><tr><td>nCounter Human miRNA Assay Kit</td><td>Nanostring</td><td>150625</td><td>Essential</td> verwenden</tr><tr><td>nCounter Master Kit</td><td>Nanostring</td><td>100050</td><td>Essential</td></tr><tr><td>nSolver</td><td>Nanostring</td><td>N/A</td><td>Essential</td></tr></tbody></table>

störeinflüsse von zirkulierende mirnas in irritable bowel syndrome erkannt einen multiplexed hochdurchsatz-gene expression-plattform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Die Genexpressions Plattform Assay ermöglicht robust und hoch reproduzierbare Quantifizierung der Expression von bis zu 800 Transkripte (mRNA oder miRNAs) in einer einzigen Reaktion. Die miRNA-Test zählt Transkripte durch direktes Abbilden und miRNA-Moleküle digital zu zählen, die mit farbcodierten fluoreszierenden barcodierte Sondensätze (eine Reportersonde und eine Fangsonde) markiert sind. Barcodes sind hybridisierte direkt miRNAs zu reifen, die durch Ligieren eines einzigartigen Oligonukleotid-Markierung (miRtag) an das 3&#39;-Ende verlängert worden sind. Reverse Transkription und Amplifizierung der Transkripte sind nicht erforderlich. Reportersonden enthalten eine Sequenz von sechs Farbpositionen unter Verwendung einer Kombination von vier fluoreszierenden Farben gefüllt. Die vier Farben über sechs Positionen werden verwendet, um ein Gen-spezifischen Farb Barcode-Sequenz zu konstruieren. Post-Hybridisierung Verarbeitung an einem Roboter-Vorbereitungsstation automatisiert. Nach der Hybridisierung werden die überschüssigen Sonden weggewaschen, und die dreigliedrigen Strukturen (Capture Probe-miRNA-Reportersonde) sind an einer mit Streptavidin beschichteten Objektträger über das Biotin-markierte Einfangsonde. Imaging und Barcode-Zählung erfolgt mit einem digitalen Analysator verwenden. Die immobilisierten barcodierte miRNAs werden visualisiert und bebildert, ein Mikroskop und Kamera, und die einzigartigen Barcodes dekodiert und gezählt. Datenqualitätskontrolle (QC), Normalisierung und Auswertung werden von einem speziell entwickelten Datenverarbeitung und Analyse-Software erleichtert, dass der Test-Software begleitet. Der Test zeigt eine hohe Linearität über einen breiten Bereich des Ausdrucks, sowie eine hohe Empfindlichkeit. Proben- und Testvorbereitung beinhaltet keine enzymatische Reaktionen, die reverse Transkription oder Verstärkung; hat wenige Schritte; und ist weitgehend automatisiert, Ermittler Effekte und was zu einer hohen Konsistenz und technischen Reproduzierbarkeit zu reduzieren. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Technologie zu identifizieren zirkulierenden miRNA Störungen in Reizdarmsyndrom.

Transkriptomischen Störung in funktionellen Störungen kann subtil sein, und um zuverlässig diese subtilen Veränderungen in der Expression erkennen, muss die Quantifizierung der Genexpression genau zu sein. Die Genexpression Plattform-Assay-System reduziert den technischen Lärm durch seine hochautomatisierte Natur und die einzigartige Chemie nutzt produziert hochpräzise Genexpressionsdaten. Technische Replikate in 1 gezeigt , die eine hohe Reproduzierbarkeit in beiden endogenen (blaue Punkte) zeigen und viralen miRNA (orangefarbene Punkte; Housekeeping - Gene durch gelbe Punkte dargestellt sind) Quantifizierung Ausdruck, der möglich ist , mit dieser Methode. Mit dieser Methode, virale (Abbildung 2a) und endogene (Abbildung 2b) miRNAs , die Abweichung von den erwarteten Ausdruck zeigen, wie gesunde Studienteilnehmer definiert haben , können als Ziele von Interesse in IBS identifiziert werden. Es sollte beachtet werden, dass es unklar ist, ob die viralen miRNAsdetektiert hier ergeben sich aus viralen Genen in dem menschlichen Genom oder aus Viruslast integriert. Da der Test nur reife miRNAs mit single-nucleotide Spezifität zählt, Kreuzhybridisierung mit ähnlichen endogenen humanen miRNAs ist unwahrscheinlich. Dennoch Differential Steady-State-Konzentrationen dieser Moleküle sind von Interesse als Biomarker. Die Präzision des Verfahrens ermöglicht Störungen bei niedrigen Expressions Ziele detektiert werden, da eine genaue Erfassung dieser Transkripte werden von reichlicher Transkripte überschwemmt werden. Subtile Störungen auch zuverlässig beobachtet werden können. 3 und 4 zeigen einige dieser Störungen in zirkulierenden miRNAs in IBS und IBS-Subtypen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen , und 5 und 6 (beide 3 angepasst) zeigen sich die beiden wichtigsten unterschiedlich erhöhten miRNAs (Abbildung 5: miRNA 342-3p, Abbildung 6: miRNA 150). in IBS Teilnehmer Abbildung 6<html> ist ein Beispiel für die graphische Ausgabe der durch die zugeordnete Software erzeugten Ergebnisse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig1.jpg" /> . Abbildung 1: Normierte Grafen von zwei technische Replikate technische Replikate laufen auf zwei separaten Patronen zeigen eine hohe lineare Korrelation (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) über den Bereich der normierten (normiert auf die Top - 100 - ausgedrückt miRNAs) miRNA zählt (log2 zählt auf die x- und y-Achse). Das Streudiagramm umfasst Daten für endogenen humanen miRNAs in blau (654 miRNAs), endogenen viralen miRNAs in Orange (80 miRNAs) und Housekeeping-Gene in gelb (8-Gene). Endogene viralen miRNAs waren in früheren Versionen des Tests zur Verfügung (Version 1.4 wurde hier verwendet wird), sind aber nicht mehr auf dem Standardtest einbezogen, obwohl sie als individuelle Ergänzungen zur Verfügung stehen./54693fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Normalized Grafen von Viren- und endogenes humanes miRNAs in IBS-Verstopfung (IBS - C) im Vergleich zu gesunden Kontrollen Störeinflüsse in (a) virale (orange) und (b) endogenen humanen miRNAs (blau) sind offensichtlich in diesem Beispiel, wo miRNA Zählungen (log2 transformiert) von IBS-C Teilnehmer (y-Achse) sind gegen die regressiert miRNA Zählungen (log2 transformiert) von gesunden Kontrollen (x-Achse). Die Mehrheit der miRNAs Express sehr ähnlich in beiden Populationen, aber einige vor allem aus der Korrelation abweichen. Diese Abweichungen sind offensichtlich sowohl bei seltenen und reichlich ausgedrückt Ziele. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig2large.jpg" target="_blank">Bitte</a>hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig3.jpg" /> Abbildung 3:. MiRNAs sind deutlich und Einheitlich Differentiell exprimierte in IBS Im Vergleich zu gesunden Kontrollen Differentiell exprimierte miRNAs in IBS enthüllt die lineare Diskriminanzanalyse Effektgröße Methode, die innerhalb der Kategorien Tests der statistischen Signifikanz mit Kontrollen für Konsistenz kombiniert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig4.jpg" /> Abbildung 4:. MiRNAs sind deutlich und Einheitlich Differentiell exprimierte in IBS - Formationsglieder Im Vergleich zu gesunden Kontrollen miRNAs waren differentially ausgedrückt in IBS-Subtypen (-D: Durchfall, -C: Verstopfung). im Vergleich zu gesunden Kontrollen die lineare Diskriminanzanalyse Effektgröße Methode, die innerhalb der Kategorien Tests der statistischen Signifikanz mit Kontrollen für Konsistenz kombiniert <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig4large.jpg" target="_blank">um eine größere zu sehen Version dieser Figur.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Differentielle Expression von miRNA-342-3p Chronische Bauchschmerzen unbekannter Ursache ist ein Hauptsymptom der IBS. Der Box-Plot zeigt, dass miR-342-3p (normalisierte Zählungen auf der y-Achse), ein miRNA mit chronischer Blasenschmerzen unbekannter Ätiologie verbunden sind, gefunden wurde, zu gesunden Kontrollen verglichen in allen IBS-Subtypen bei höheren Zählungen im Umlauf anwesend zu sein. Die Stäbe der nicht-Ausreißer Bereich darstellen, die Boxes die Inter-Quartil-Bereich und das blaue Quadrat der Median Zahl. Geändert von 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig6.jpg" /> Abbildung 6: unterschiedliche Expression von miRNA-150 A Violine Plot zeigt , dass IBS Teilnehmer signifikant hatten höhere miR-150 zählt im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (log2 umgewandelt Zählungen auf der y-Achse) im Umlauf.. Die Kurven , die die Frequenz der Zählungen in der Kategorie zeigen, stellen die vertikalen Balken des 1. und 3. Quartile und das rote Viereck zeigt die mittlere Zählung. Geändert von 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir beschreiben die Verwendung einer Multiplex-Hochdurchsatz-Genexpressionsplattform, die die Genexpression durch Barcoding und Zählen von Molekülen in biologischen Substraten quantifiziert, ohne dass eine Amplifikation erforderlich ist. Wir nutzten die Plattform, um die Expression von microRNA (miRNA) im Vollblut bei Probanden mit und ohne Reizdarmsyndrom zu quantifizieren.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Das übergeordnete Ziel dieses multiplex Nukleinsäure-Quantifizierungsprotokolls besteht darin, die Expression von Mikro-RNAs in Vollblut digital zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Erforschung von Verdauungsstörungen zu beantworten. Sie trägt zur Identifizierung dysregulierter molekularer Mechanismen und von Biomarker-Signaturen, wie beispielsweise Mikro-RNAs, bei. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Quantifizierung von Mikro-RNAs nicht auf einer Amplifikation beruht. Diese Technologie zählt molekulare Zielstrukturen digital und ist weitgehend automatisiert. Um die Gesamt-RNA zu reinigen, tauen Sie zuvor gesammelte und eingefrorene Vollblutproben auf und inkubieren sie zwei Stunden lang.Verwenden Sie einen Schwenkkorbrotor, um die Röhrchen bei Raumtemperatur zehn Minuten lang mit 5.000 × g zu zentrifugieren. Anschließend entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Dekantieren oder Pipettieren in ein Abfallröhrchen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie vier Milliliter RNase-freies Wasser zum Pellet hinzu.Setzen Sie die Kappe sicher wieder auf und wirbeln Sie, bis der Pellet optisch aufgelöst ist. Zentrifugieren Sie das Reagenzglas anschließend erneut und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie danach 350 Mikroliter BM1-Puffer zum Pellet hinzu und wirbeln Sie, bis der Pellet optisch aufgelöst ist.Überführen Sie die Probe anschließend in ein 2-mL-Verarbeitungsgefäß zur automatisierten Gesamt-RNA-Extraktion. Führen Sie mithilfe eines handelsüblichen RNA-Extraktionskits eine automatisierte Reinigung der intrazellulären RNA, einschließlich der Mikro-RNA, aus der Vollblutprobe durch, indem Sie die im Kit enthaltenen vorbefüllten Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Puffer und Reagenzien in das robotergestützte RNA-Extraktionssystem einsetzen. Wählen Sie im Menü zur Protokollauswahl das Protokoll „Blood miRNA PartA“ aus und starten Sie den Durchlauf.Schließen Sie die RNA-Extraktion ab, und lagern Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll ein. Bereiten Sie Mikro-RNA-Proben vor, indem Sie zunächst 12 RNA-Proben mit RNase-freiem Wasser auf 33 Nanogramm pro Mikroliter normalisieren. Mit nukleasefreiem Wasser stellen Sie eine 1:500-Verdünnung der im Assay-Kit enthaltenen Mikro-RNA-Kontrollen her und bewahren Sie diese auf Eis auf.Bereiten Sie als Nächstes die Annealing-Master-Mix vor, indem Sie 13&nbsp;Mikroliter Annealing-Puffer, 26&nbsp;Mikroliter Micro R-Tag-Reagenz und 6,5&nbsp;Mikroliter MicroRNA-Kontrollen kombinieren. Geben Sie je 3,5&nbsp;Mikroliter der Annealing-Master-Mix in 12&nbsp;Strip-Tubes mit je 0,2&nbsp;Milliliter, und fügen Sie anschließend je 3&nbsp;Mikroliter der RNA-Probe hinzu. Mischen Sie durch vorsichtiges Flicken der Tubes, zentrifugieren Sie sie mit 2000&nbsp;×&nbsp;g in einer Tischminizentrifuge und führen Sie die Tubes in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm aus.Bereiten Sie anschließend eine Ligations-Hauptmischung vor, indem Sie drei Mikroliter Puffer für die Ligationsreaktion mit 19,5 Mikrolitern PEG kombinieren. Geben Sie danach jeweils 2,5 Mikroliter der Ligations-Hauptmischung zu jeder der Reaktionen hinzu. Nach dem Mischen und Zentrifugieren der Röhrchen stellen Sie diese für fünf Minuten zurück in den Thermocycler bei 48 Grad Celsius.Anschießend einen Mikroliter Ligase direkt zu jeder Probe hinzufügen, während diese sich noch im Thermocycler-Block befindet, und die Röhrchen gemäß dem folgenden Programm inkubieren. Die Röhrchen vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren und dann zu jeder Probe einen Mikroliter Ligation-Cleanup-Enzym hinzufügen. Anschließend die Röhrchen im Thermocycler wie hier gezeigt inkubieren.Nach der Inkubation 40 µL RNase-freies Wasser zu den Proben hinzufügen, bevor sie gemischt und kurz zentrifugiert werden. Um die Mikro-RNA-Hybridisierung durchzuführen, die Reporter- und Capture-Proben-Sets auf Eis auftauen und kurz zentrifugieren. 130 µL Hybridisierungspuffer zu Reporter Code Set 2 hinzufügen und mischen, um die Hybridisierungs-Master-Mischung herzustellen.In 12 neue 0,2-Milliliter-Streifengefäße je 20 Mikroliter der Hybridisierungs-Master-Mix hinzufügen. Die gerade hergestellten microRNA-Proben bei 85 Grad Celsius fünf Minuten lang denaturieren und anschließend auf Eis abkühlen. Danach je 5 Mikroliter der microRNA-Proben zu den Streifengefäßen mit der Hybridisierungs-Master-Mix hinzufügen.Programmieren Sie den Thermocycler auf 65 Grad Celsius bei einem temperaturberechneten Volumen von 30 Mikrolitern und stellen Sie den beheizten Deckel auf die Dauerbetrieb-Einstellung, sodass er am Ende des Programmlaufs nicht auf 4 Grad Celsius abkühlt. Geben Sie 5 Mikroliter des Capture-Probe-Sets zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich. Danach, nach kurzem Zentrifugieren, stellen Sie die Röhrchen unverzüglich in den Thermocycler bei 65 Grad Celsius.Die Proben mindestens 12 Stunden, jedoch höchstens 30 Stunden lang inkubieren. Richten Sie die Vorbereitungsstation ein, indem Sie zuerst die Kartusche und die Platten auf Raumtemperatur erwärmen. Anschließend zentrifugieren Sie die Platten.Öffnen Sie zur Beladung der Vorbereitungsstation die Stationstür und laden Sie die Reagenzplatten, die Kartusche, die Pipettenspitzen, die vorbereiteten Proben in 0,2-milliliter-Streifenröhrchen sowie zwei leere 0,2-milliliter-12er-Streifenröhrchen an die dafür vorgesehenen Stellen im Robotersystem. Entfernen Sie die Verschlusskappen der Streifenröhrchen und die Abdeckung der Reagenzplatte. Schließen Sie anschließend die Tür der Vorbereitungsstation und führen Sie den entsprechenden Assay über das Bedienfeld aus.Um die Barcodes der immobilisierten und ausgerichteten dreiteiligen Komplexe sichtbar zu machen und zu zählen, nehmen Sie die Kartusche von der Vorbereitungsstation, verschließen Sie sie mit dem beiliegenden Deckel und platzieren Sie sie in einem beliebigen Steckplatz des digitalen Analysegeräts. Erstellen Sie mithilfe des Touchscreens eine Kartuschendefinitionsdatei (CDF). Stellen Sie sicher, dass jeder Probe in der CDF die entsprechende Reporter-Bibliotheksdatei zugewiesen ist.Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, laden Sie die Datendateien vom digitalen Analysator mithilfe eines USB-Sticks oder per E-Mail herunter, bevor Sie die Daten gemäß dem zugehörigen QC- und Analyseprotokoll verarbeiten und analysieren. Das Genexpressions-Plattform-Assay-System verringert technisches Rauschen aufgrund seiner hohen Automatisierung, und die einzigartige Chemie liefert präzise Genexpressionsdaten. Die hier gezeigten technischen Replikate demonstrieren die hohe Reproduzierbarkeit bei der Quantifizierung sowohl endogener als auch viraler microRNA-Expression.Mithilfe dieser Methode können virale und endogene humane microRNAs, deren Expression von der durch gesunde Studienteilnehmer definierten erwarteten Expression abweicht, als Zielstrukturen bei Reizdarm identifiziert werden. Die Präzision und Empfindlichkeit der Methode ermöglicht es, Störungen auch bei Zielstrukturen mit geringer Expression zu erkennen, und auch subtile Störungen können zuverlässig beobachtet werden. Diese Abbildungen zeigen einige der Störungen in zirkulierenden microRNAs bei Reizdarm und dessen Subtypen im Vergleich zu gesunden Kontrollen.Die beiden signifikant am stärksten erhöhten Mikro-RNAs bei Probanden mit Reizdarmsyndrom werden hier dargestellt. Die Kurven in diesem Violin-Plot zeigen die Häufigkeit der Zählwerte für miR-150 an. Die vertikalen Balken repräsentieren das erste und dritte Quartil, und das rote Quadrat kennzeichnet den medianen Zählwert.Nach dieser Vorgehensweise können gezieltere, maßgeschneiderte Analysen basierend auf derselben Technologie durchgeführt werden, um Biomarker-Signaturen in größeren Kohorten zu validieren und wesentliche RNA- und Protein-Assoziationen zu erforschen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der biomedizinischen Forschung den Weg, um schnell sowie präzise und genau diagnostische Biomarker-Panels für Krankheiten zu entwickeln.

perturbations-circulating-mirnas-irritable-bowel-syndrome-detected

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Erfahren Sie die digitale Quantifizierung von microRNA in Vollblut ohne Amplifikation zur Erforschung von Reizdarmsyndrom. Diese hochautomatisierte Plattform ermöglicht präzise Biomarker-Identifikation.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform (Video) | JoVE Journal

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

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