Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform
30. November 2016
Wir beschreiben die Verwendung einer Multiplex-Hochdurchsatz-Genexpressionsplattform, die die Genexpression durch Barcoding und Zählen von Molekülen in biologischen Substraten quantifiziert, ohne dass eine Amplifikation erforderlich ist. Wir nutzten die Plattform, um die Expression von microRNA (miRNA) im Vollblut bei Probanden mit und ohne Reizdarmsyndrom zu quantifizieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Multiplex-Nukleinsäure-Quantifizierungsprotokolls ist die digitale Quantifizierung der microRNA-Expression im Vollblut. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Erforschung von Verdauungsstörungen zu beantworten. Es hilft bei der Identifizierung von fehlregulierten molekularen Mechanismen und Biomarker-Signaturen, wie z. B. microRNAs.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die microRNA-Quantifizierung nicht auf die Amplifikation angewiesen ist. Diese Technologie zählt molekulare Ziele digital und ist weitgehend automatisiert. Um die Gesamt-RNA zu reinigen, tauen Sie zuvor gesammelte und eingefrorene Vollblutproben auf und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang.
Verwenden Sie einen schwingenden Schaufelrotor, um die Röhrchen bei 5.000 g bei Raumtemperatur zehn Minuten lang zu zentrifugieren. Entfernen Sie dann die Überstände, indem Sie sie vorsichtig in ein Abfallröhrchen gießen oder pipettieren, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Geben Sie vier Milliliter RNase-freies Wasser in das Pellet.
Setzen Sie die Kappe wieder sicher auf und wirbeln Sie sie ein, bis sich das Pellet sichtbar aufgelöst hat. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen erneut und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie anschließend 350 Mikroliter BM1-Puffer zum Pellet und wirbeln Sie, bis sich das Pellet sichtbar aufgelöst hat.
Übertragen Sie dann die Probe in ein zwei Milliliter fassendes Verarbeitungsröhrchen für die automatisierte Gesamt-RNA-Extraktion. Führen Sie mit einem kommerziell erhältlichen RNA-Extraktionskit eine automatisierte Aufreinigung von intrazellulärer RNA, einschließlich microRNA aus der Vollblutprobe, durch, indem Sie vorgeladene Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Puffer und Reagenzien, die im RNA-Aufreinigungskit bereitgestellt werden, in das robotische RNA-Extraktionssystem laden. Wählen Sie im Protokollauswahlmenü das Protokoll Blood miRNA PartA aus und starten Sie den Lauf.
Schließen Sie die RNA-Extraktion ab und lagern Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll. Bereiten Sie microRNA-Proben vor, indem Sie zunächst RNase-freies Wasser verwenden, um 12 RNA-Proben auf 33 Nanogramm pro Mikroliter zu normalisieren. Bereiten Sie mit nukleasefreiem Wasser eine Verdünnung von 1:500 der im Assay-Kit enthaltenen microRNA-Kontrollen vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
Bereiten Sie als Nächstes den Annealing-Mastermix vor, indem Sie 13 Mikroliter Annealing-Puffer, 26 Mikroliter Micro-R-Tag-Reagenz und 6,5 Mikroliter microRNA-Kontrollen kombinieren. Zu jedem der 12 0,2-Milliliter-Streifenröhrchen werden 3,5 Mikroliter des Annealing-Mastermixes und dann 3 Mikroliter der RNA-Probe hinzugefügt. Schnippen Sie die Röhrchen zum Mischen, schleudern Sie sie mit einer Mini-Mikrozentrifuge auf dem Tischgerät mit dem 2000-fachen g herunter und lassen Sie die Röhrchen mit dem folgenden Programm in einem Thermocycler laufen.
Bereiten Sie als Nächstes einen Ligations-Mastermix vor, indem Sie drei Mikroliter des Ligationspuffers und 19,5 Mikroliter PEG kombinieren. Geben Sie dann 2,5 Mikroliter des Ligations-Mastermixes zu jeder der Reaktionen. Nachdem Sie die Röhrchen gemischt und geschleudert haben, geben Sie sie fünf Minuten lang bei 48 Grad Celsius in den Thermocycler zurück.
Geben Sie dann einen Mikroliter Ligase direkt zu jeder Probe, während sie sich noch im Thermocycler-Block befindet, und inkubieren Sie die Röhrchen mit dem folgenden Programm. Mischen und schleudern Sie die Röhrchen vorsichtig hinunter und fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter Ligationsreinigungsenzym hinzu. Inkubieren Sie dann die Röhrchen im Thermocycler, wie hier gezeigt.
Geben Sie nach der Inkubation 40 Mikroliter RNase-freies Wasser zu den Proben, bevor Sie sie mischen und schleudern. Um eine microRNA-Hybridisierung durchzuführen, tauen Sie die auf Eis bereitgestellten Reporter- und Fangsondensätze auf und schleudern Sie sie nach unten. Fügen Sie dem Reporter-Codesatz 2 130 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie, um den Hybridisierungs-Mastermix zu erstellen.
In 12 neue 0,2-Milliliter-Streifenröhrchen geben Sie 20 Mikroliter des Hybridisierungs-Mastermixes. Denaturieren Sie die gerade bei 85 Grad Celsius hergestellten microRNA-Proben fünf Minuten lang und kühlen Sie sie auf Eis ab. Geben Sie dann 5 Mikroliter der microRNA-Proben in jedes der Streifenröhrchen, die den Hybridisierungs-Mastermix enthalten.
Programmieren Sie den Thermocycler auf 65 Grad Celsius bei einer volumenberechneten Temperatur von 30 Mikrolitern und den beheizten Deckel auf die Einstellung Forever Time, damit er am Ende des Laufs nicht auf 4 Grad Celsius heruntergefahren wird. Geben Sie 5 Mikroliter des Auffangsondensatzes in jedes Röhrchen und mischen Sie. Legen Sie die Röhrchen nach dem Schleudern sofort bei 65 Grad Celsius in den Thermocycler.
Inkubieren Sie die Proben mindestens 12 Stunden lang und nicht länger als 30 Stunden. Richten Sie die Vorbereitungsstation ein, indem Sie zuerst die Kartusche und die Platten auf Raumtemperatur erwärmen. Dann die Platten herunterdrehen.
Um die Vorbereitungsstation zu beladen, öffnen Sie die Stationstür und legen Sie die Reagenzplatten, die Kartusche, die Pipettenspitzen, die vorbereiteten Proben in 0,2-Milliliter-Streifenröhrchen und zwei leere 0,2-Milliliter-Streifenröhrchen mit 12 Röhrchen an die entsprechenden Stellen im Roboter. Entfernen Sie die Kappen des Streifenröhrchens und die Abdeckung der Reagenzplatten. Schließen Sie dann die Tür der Vorbereitungsstation und führen Sie den entsprechenden Assay über das Bedienfeld aus.
Um die Barcodes der immobilisierten und ausgerichteten dreigliedrigen Komplexe zu visualisieren und zu zählen, nehmen Sie die Kartusche aus der Vorbereitungsstation, verwenden Sie die mitgelieferte Abdeckung, um sie zu verschließen, und legen Sie sie in den digitalen Analysator in einen freien Steckplatz. Verwenden Sie den Touchscreen, um eine Cartridge-Definitionsdatei (CDF) zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass jeder Probe in der CDF die entsprechende Reporterbibliotheksdatei zugewiesen ist.
Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, laden Sie die Datendateien vom digitalen Analysator über ein USB-Laufwerk oder per E-Mail herunter, bevor Sie die Daten gemäß dem zugehörigen QC- und Analyseprotokoll verarbeiten und analysieren. Das Assay-System der Genexpressionsplattform reduziert durch seine hochautomatisierte Natur das technische Rauschen, und die einzigartige Chemie, die es verwendet, erzeugt hochpräzise Genexpressionsdaten. Die hier gezeigten technischen Replikate zeigen die hohe Reproduzierbarkeit sowohl bei der endogenen als auch bei der viralen Quantifizierung der microRNA-Expression, die möglich ist.
Mit dieser Methode können viral kodierte und endogene humane microRNAs, die eine Abweichung von der erwarteten Expression aufweisen, wie sie von gesunden Studienteilnehmern definiert wurde, als Ziele von Interesse für das Reizdarmsyndrom identifiziert werden. Die Präzision und Empfindlichkeit der Methode ermöglicht es, Störungen zwischen niedrig exprimierten Zielen zu detektieren und auch subtile Störungen zuverlässig zu beobachten. Diese Zahlen zeigen einige der Störungen in zirkulierenden microRNAs bei IBS und IBS-Subtypen im Vergleich zu gesunden Kontrollen.
Die beiden signifikantesten differentiell erhöhten microRNAs bei IBS-Teilnehmern werden hier vorgestellt. Die Kurven in diesem Violindiagramm zeigen die Häufigkeit der Zählungen für miR-150. Die vertikalen Balken stellen das erste und dritte Quartil dar, und das rote Quadrat zeigt die mittlere Anzahl an.
Nach diesem Verfahren können gezieltere benutzerdefinierte Assays auf der Grundlage derselben Technologie durchgeführt werden, um Biomarker-Signaturen in größeren Kohorten zu validieren und die essentiellen RNA- und Proteinassoziationen zu erforschen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung, um schnell, präzise und genau diagnostische Biomarker-Panels für Krankheiten zu entwickeln.
Überblick
Dieser Artikel stellt eine multiplexierte Hochdurchsatz-Genexpressionsplattform vor, die entwickelt wurde, um die MikroRNA-Expression in Vollblutproben zu quantifizieren. Die Methode ermöglicht eine genaue Messung ohne Amplifikation, was sie für die Untersuchung von Erkrankungen wie dem Reizdarmsyndrom geeignet macht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Genexpressionsanalyse
- MikroRNA-Quantifizierung
- Forschung zu Verdauungsstörungen
Hintergrund
- MikroRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Das Verständnis ihrer Expression kann Einblicke in verschiedene Krankheiten geben.
- Aktuelle Methoden verlassen sich oft auf Amplifikation, was Variabilität einführen kann.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Einschränkungen mit einem neuartigen Ansatz zu überwinden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur digitalen Quantifizierung von MikroRNA im Blut.
- Identifizierung dysregulierter molekularer Mechanismen beim Reizdarmsyndrom.
- Etablierung von Biomarker-Signaturen für Verdauungsstörungen.
Verwendete Methoden
- Automatisierte RNA-Extraktion aus Vollblutproben.
- Vorbereitung von MikroRNA-Proben unter Verwendung spezifischer Reagenzien.
- Hybridisierungs- und Ligationsverfahren zur MikroRNA-Erkennung.
- Digitale Analyse von Genexpressionsdaten mit einer spezialisierten Plattform.
Hauptergebnisse
- Die Methode zeigte eine hohe Präzision bei der Quantifizierung der MikroRNA-Spiegel.
- Technische Replikate zeigten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
- Es wurden MikroRNAs identifiziert, die von gesunden Expressionsprofilen abweichen.
- Subtile Störungen in Zielen mit niedriger Expression wurden zuverlässig nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Die Multiplex-Plattform bietet ein robustes Werkzeug zur Untersuchung von MikroRNA im Blut.
- Sie kann zur Verständigung der molekularen Grundlagen von Verdauungsstörungen beitragen.
- Dieser Ansatz könnte zur Entdeckung neuer Biomarker für das Reizdarmsyndrom führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
