Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

Das übergeordnete Ziel dieses multiplex Nukleinsäure-Quantifizierungsprotokolls besteht darin, die Expression von Mikro-RNAs in Vollblut digital zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Erforschung von Verdauungsstörungen zu beantworten. Sie trägt zur Identifizierung dysregulierter molekularer Mechanismen und von Biomarker-Signaturen, wie beispielsweise Mikro-RNAs, bei.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Quantifizierung von Mikro-RNAs nicht auf einer Amplifikation beruht. Diese Technologie zählt molekulare Zielstrukturen digital und ist weitgehend automatisiert. Um die Gesamt-RNA zu reinigen, tauen Sie zuvor gesammelte und eingefrorene Vollblutproben auf und inkubieren sie zwei Stunden lang.

Verwenden Sie einen Schwenkkorbrotor, um die Röhrchen bei Raumtemperatur zehn Minuten lang mit 5.000 × g zu zentrifugieren. Anschließend entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Dekantieren oder Pipettieren in ein Abfallröhrchen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie vier Milliliter RNase-freies Wasser zum Pellet hinzu.

Setzen Sie die Kappe sicher wieder auf und wirbeln Sie, bis der Pellet optisch aufgelöst ist. Zentrifugieren Sie das Reagenzglas anschließend erneut und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie danach 350 Mikroliter BM1-Puffer zum Pellet hinzu und wirbeln Sie, bis der Pellet optisch aufgelöst ist.

Überführen Sie die Probe anschließend in ein 2-mL-Verarbeitungsgefäß zur automatisierten Gesamt-RNA-Extraktion. Führen Sie mithilfe eines handelsüblichen RNA-Extraktionskits eine automatisierte Reinigung der intrazellulären RNA, einschließlich der Mikro-RNA, aus der Vollblutprobe durch, indem Sie die im Kit enthaltenen vorbefüllten Pipettenspitzen, Zentrifugenröhrchen, Puffer und Reagenzien in das robotergestützte RNA-Extraktionssystem einsetzen. Wählen Sie im Menü zur Protokollauswahl das Protokoll „Blood miRNA PartA“ aus und starten Sie den Durchlauf.

Schließen Sie die RNA-Extraktion ab, und lagern Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll ein. Bereiten Sie Mikro-RNA-Proben vor, indem Sie zunächst 12 RNA-Proben mit RNase-freiem Wasser auf 33 Nanogramm pro Mikroliter normalisieren. Mit nukleasefreiem Wasser stellen Sie eine 1:500-Verdünnung der im Assay-Kit enthaltenen Mikro-RNA-Kontrollen her und bewahren Sie diese auf Eis auf.

Bereiten Sie als Nächstes die Annealing-Master-Mix vor, indem Sie 13 Mikroliter Annealing-Puffer, 26 Mikroliter Micro R-Tag-Reagenz und 6,5 Mikroliter MicroRNA-Kontrollen kombinieren. Geben Sie je 3,5 Mikroliter der Annealing-Master-Mix in 12 Strip-Tubes mit je 0,2 Milliliter, und fügen Sie anschließend je 3 Mikroliter der RNA-Probe hinzu. Mischen Sie durch vorsichtiges Flicken der Tubes, zentrifugieren Sie sie mit 2000 × g in einer Tischminizentrifuge und führen Sie die Tubes in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm aus.

Bereiten Sie anschließend eine Ligations-Hauptmischung vor, indem Sie drei Mikroliter Puffer für die Ligationsreaktion mit 19,5 Mikrolitern PEG kombinieren. Geben Sie danach jeweils 2,5 Mikroliter der Ligations-Hauptmischung zu jeder der Reaktionen hinzu. Nach dem Mischen und Zentrifugieren der Röhrchen stellen Sie diese für fünf Minuten zurück in den Thermocycler bei 48 Grad Celsius.

Anschießend einen Mikroliter Ligase direkt zu jeder Probe hinzufügen, während diese sich noch im Thermocycler-Block befindet, und die Röhrchen gemäß dem folgenden Programm inkubieren. Die Röhrchen vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren und dann zu jeder Probe einen Mikroliter Ligation-Cleanup-Enzym hinzufügen. Anschließend die Röhrchen im Thermocycler wie hier gezeigt inkubieren.

Nach der Inkubation 40 µL RNase-freies Wasser zu den Proben hinzufügen, bevor sie gemischt und kurz zentrifugiert werden. Um die Mikro-RNA-Hybridisierung durchzuführen, die Reporter- und Capture-Proben-Sets auf Eis auftauen und kurz zentrifugieren. 130 µL Hybridisierungspuffer zu Reporter Code Set 2 hinzufügen und mischen, um die Hybridisierungs-Master-Mischung herzustellen.

In 12 neue 0,2-Milliliter-Streifengefäße je 20 Mikroliter der Hybridisierungs-Master-Mix hinzufügen. Die gerade hergestellten microRNA-Proben bei 85 Grad Celsius fünf Minuten lang denaturieren und anschließend auf Eis abkühlen. Danach je 5 Mikroliter der microRNA-Proben zu den Streifengefäßen mit der Hybridisierungs-Master-Mix hinzufügen.

Programmieren Sie den Thermocycler auf 65 Grad Celsius bei einem temperaturberechneten Volumen von 30 Mikrolitern und stellen Sie den beheizten Deckel auf die Dauerbetrieb-Einstellung, sodass er am Ende des Programmlaufs nicht auf 4 Grad Celsius abkühlt. Geben Sie 5 Mikroliter des Capture-Probe-Sets zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich. Danach, nach kurzem Zentrifugieren, stellen Sie die Röhrchen unverzüglich in den Thermocycler bei 65 Grad Celsius.

Die Proben mindestens 12 Stunden, jedoch höchstens 30 Stunden lang inkubieren. Richten Sie die Vorbereitungsstation ein, indem Sie zuerst die Kartusche und die Platten auf Raumtemperatur erwärmen. Anschließend zentrifugieren Sie die Platten.

Öffnen Sie zur Beladung der Vorbereitungsstation die Stationstür und laden Sie die Reagenzplatten, die Kartusche, die Pipettenspitzen, die vorbereiteten Proben in 0,2-milliliter-Streifenröhrchen sowie zwei leere 0,2-milliliter-12er-Streifenröhrchen an die dafür vorgesehenen Stellen im Robotersystem. Entfernen Sie die Verschlusskappen der Streifenröhrchen und die Abdeckung der Reagenzplatte. Schließen Sie anschließend die Tür der Vorbereitungsstation und führen Sie den entsprechenden Assay über das Bedienfeld aus.

Um die Barcodes der immobilisierten und ausgerichteten dreiteiligen Komplexe sichtbar zu machen und zu zählen, nehmen Sie die Kartusche von der Vorbereitungsstation, verschließen Sie sie mit dem beiliegenden Deckel und platzieren Sie sie in einem beliebigen Steckplatz des digitalen Analysegeräts. Erstellen Sie mithilfe des Touchscreens eine Kartuschendefinitionsdatei (CDF). Stellen Sie sicher, dass jeder Probe in der CDF die entsprechende Reporter-Bibliotheksdatei zugewiesen ist.

Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, laden Sie die Datendateien vom digitalen Analysator mithilfe eines USB-Sticks oder per E-Mail herunter, bevor Sie die Daten gemäß dem zugehörigen QC- und Analyseprotokoll verarbeiten und analysieren. Das Genexpressions-Plattform-Assay-System verringert technisches Rauschen aufgrund seiner hohen Automatisierung, und die einzigartige Chemie liefert präzise Genexpressionsdaten. Die hier gezeigten technischen Replikate demonstrieren die hohe Reproduzierbarkeit bei der Quantifizierung sowohl endogener als auch viraler microRNA-Expression.

Mithilfe dieser Methode können virale und endogene humane microRNAs, deren Expression von der durch gesunde Studienteilnehmer definierten erwarteten Expression abweicht, als Zielstrukturen bei Reizdarm identifiziert werden. Die Präzision und Empfindlichkeit der Methode ermöglicht es, Störungen auch bei Zielstrukturen mit geringer Expression zu erkennen, und auch subtile Störungen können zuverlässig beobachtet werden. Diese Abbildungen zeigen einige der Störungen in zirkulierenden microRNAs bei Reizdarm und dessen Subtypen im Vergleich zu gesunden Kontrollen.

Die beiden signifikant am stärksten erhöhten Mikro-RNAs bei Probanden mit Reizdarmsyndrom werden hier dargestellt. Die Kurven in diesem Violin-Plot zeigen die Häufigkeit der Zählwerte für miR-150 an. Die vertikalen Balken repräsentieren das erste und dritte Quartil, und das rote Quadrat kennzeichnet den medianen Zählwert.

Nach dieser Vorgehensweise können gezieltere, maßgeschneiderte Analysen basierend auf derselben Technologie durchgeführt werden, um Biomarker-Signaturen in größeren Kohorten zu validieren und wesentliche RNA- und Protein-Assoziationen zu erforschen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der biomedizinischen Forschung den Weg, um schnell sowie präzise und genau diagnostische Biomarker-Panels für Krankheiten zu entwickeln.