Name: Generieren De Novo Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Generierung de novo antigenspezifischer T-Zell-Rezeptoren durch retrovirale Transduktion zentrischer Hemiketten. Diese Methode vereinfacht die TCR-Isolation für die Immuntherapie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den NIH-Zuschuss R01 CA148673 (NH); den Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); Die Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Graduiertenstipendium der Canadian Institutes of Health Research Canada (TG); Postgraduiertenstipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (TG); Provinz Ontario (TG, MA); und Guglietti Fellowship Award (TO). HLA- und CD1d-Monomere wurden freundlicherweise von der NIH-Tetramer-Core-Anlage zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereiten Retrovirale Encoding TCR Hemichain of Interest Construct <ol><li> Linearisieren pMX Vektor, der das Einführen eines TCR-Gens in anschließenden Schritten zu ermöglichen. Digest die Plasmid - DNA mit EcoRI und NotI - Restriktionsenzymen bei 37 ° C für 3 Stunden (Tabelle 1) 8. </li><li> Führen Sie die Elektrophorese der verdauten Plasmid auf 1,2% Agarose-Gel. Excise Bande von etwa 4500 Basenpaaren (bp) und elute in 30 ul sterilem Wasser mit handelsüblichen -Gelextraktions Kits 9. </li><li> Design 5 &#39;und 3&#39; - Primer für die TCR - Gen von Interesse , die auch 15-20 bps überlappende die EcoRI- und NotI - Verdauungsstelle von pMX Vektor codieren bzw. 8. </li><li> Amplify TCR-Gen mit Primern. Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.000 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Klon TCR-Gens in verdauten Vektor durch jedes lineares Fragment mit im Handel erhältlichen Plasmid-KombinationMontage Mastermix Reagenz und für 1 Stunde bei 50ºC inkubiert wurde. HINWEIS: Siehe Protokoll des Herstellers für relativen Volumina der einzelnen Komponenten. Dieses Montageverfahren wird auf der Technik basieren ursprünglich beschrieben von Gibson et al. 10. </li><li> (Optional) Tag TCR - Gens mit der verkürzten Form des menschlichen Nervenwachstumsfaktor - Rezeptor transduzierten Zellen zu markieren (ΔNGFR, Aminosäuren 1-277) 11 getrennt durch Furinspaltungsstelle, Serin-Glycin - Linker und 2A - Sequenzen 12,13. Design-Primer-codierenden Sequenzen, die Fragmentenden überlappen und montieren Plasmid als 1,3-1,5 in Schritten beschrieben. ANMERKUNG: Diese Sequenzen können 11-13 in Referenzen. </li><li> Trans chemisch kompetente E. coli mit montiertem Plasmid folgenden Herstellerprotokoll 14. Seed transformierten Bakterien auf Agar-Platten (20 mg / ml LB-Medium (LB), 15 mg / ml Agar und 1 &amp; mgr; g / ml Ampicillin) und inkubiere bei 37 ° C für 18 Stunden. </li&gt; <li> Kultur ein einzelnes Bakterium Kolonie in 50 ml LB-Medium (20 mg / ml LB und 1 &amp; mgr; g / ml Ampicillin) für 16 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro min. </li><li> Reinige Plasmide folgende Protokoll des Herstellers im Handel erhältlichen Midiprep Kits. Verdünnte Plasmid-Konzentration von etwa 1 ug / ul. ANMERKUNG: Das Plasmid Reinigungsprotokoll basiert auf dem alkalischen Extraktionsverfahren 15. </li></ol> 2. Generieren Stabile Verpackungszelllinie HINWEIS: Sowohl 293GPG und PG13-Zellen anhaften. Kulturzellen in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) supplementiert und 50 ug / ml Gentamicin. Kultur 293GPG Zellen mit 1 &amp; mgr; g / ml Tetracyclin vor der Transfektion. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten. <ol><li> Transfizieren 293GPG Verpackungszellen 16 kultiviert in T75 - Kolben mit dem hemichain-codierenden Vektor in Schritt 1.9 erhalten, using kommerziell erhältliche Transfektionsreagenz folgende Protokoll des Herstellers 1 7. HINWEIS: transfizieren 293GPG Zellen bei 50-60% Konfluenz. </li><li> Absaugen Medium für 293GPG Zellen und 10 ml frisch nach der Transfektion DMEM Medium 1 Tag hinzu. </li><li> Ernte produziert transient Virus aus transfizierten 293GPG Zellen 2 Tage nach Schritt 2.2 durch Kulturmedium übertragen durch 0,45 um-Filter an die Spritze und Vergehen. HINWEIS: Virus kann sofort oder für eine spätere Verwendung bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Kultur 1 x 10 5 PG13 - Zellen in T25 - Kolben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Nach einem Tag absaugen Kulturmedium und 1,5 ml von 293GPG abgeleitetes Virus aus Schritt 2.3 und 1,5 ml DMEM-Medium, zusammen mit 8 ug / ml Polybren. </li><li> Ändern Sie das Medium wie in Schritt 2.4 einmal pro Tag beschrieben für 4 Tage, stabile PG13 Verpackungszelllinie Retrovirus kodiert, das TCR hemichain von Interesse zu etablieren. </li><li> Absaugen Medium und ersetzenmit frischem DMEM-Medium für PG13-Zelllinien 24 Stunden nach der letzten Infektion für die weitere Kultur. HINWEIS: Einfrieren oder Subkultur Zellen, indem sie mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung gelöst wird. </li><li> Zu Virus von transduzierten PG13 Zelllinien, Kultur 2 x 10 6 Zellen in T75 - Kolben mit 10 ml DMEM - Medium und des Ernte Virus produzieren , wie in Schritt 2.3 beschrieben 3 Tage nach dem Aussäen der Zellen. HINWEIS: Virus ist am besten sofort verwendet, kann aber für bis zu zwei Monate bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol> 3. Aktivierung und Transduktion von humanen T-Zellen HINWEIS: Menschliche Proben werden in Übereinstimmung mit den institutionellen Ethikkommission genehmigten Protokollen erhalten und verwendet. Kultur primären humanen Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% Humanserum anstelle von FCS und 50 ug / ml Gentamicin. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten. <ol><li> Isolieren menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch DichtegradientenzentrifugationGradiententrennung 18 nach Herstellerprotokoll. </li><li> Aktivieren T-Zellen-Proliferation, die für retrovirale Infektion zu induzieren. Kultur 2 x 10 7 frischen oder aufgetauten PBMCs pro Well in 6-Well - Platte, in 5 ml RPMI - Medium mit 100 IU / ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) und 50 ng / ml Anti-CD3 monoklonaler Antikörper (Klon OKT3). </li><li> Drei Tage nach der Stimulation, sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und 0,5-1 x 10 6 T - Zellen pro Well in 24-Well - Platte resuspendiert Samen in 1 ml PG13 Virus von Schritt 2.7, und 1 ml RPMI - Medium , supplementiert mit 200 IU / ml rhIL-2. Zentrifugenplatte bei 1.000 xg und 32 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach 24 Stunden sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml PG13 Virus von Schritt 2.7, und 1 ml RPMI-Medium, supplementiert mit 200 IU / ml rhIL-2. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 6 InfectIonen. HINWEIS: Die Anzahl der Infektionen sollte von Verpackungszelllinie produziert je nach Titer des Virus optimiert werden. Falls erforderlich, durch Hindurch T-Zellen 20-30% der Zellen pro Tag zu entfernen Wucherung zu verhindern. </li><li> 24 Stunden nach der letzten Infektion, sammeln T-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in RPMI-Medium mit 100 IU / ml rhIL-2 für eine weitere Kultur. </li><li> 2-3 Tage nach dem Schritt 3.5, stain T-Zellen mit HLA-Multimer bei 4 ° C für 30 min, dann anti-human CD3 und Co-Rezeptor-monoklonalen Antikörpern (mAbs) bei 4 ° C für 15 min. Analysieren mittels Durchflusszytometrie. Verwenden irrelevant Multimer und / oder nicht - transduzierten Zellen als negative Kontrollen (Abbildung 1 - 3) 19. </li><li> Wenn die eingeführte centric hemichain eine TCR &amp; agr; Kette ist, V &amp; beta; Nutzung der De - novo - Multimer - positiven Zellen analysieren im Handel erhältlichen V &amp; beta;-spezifischer Antikörper - Panel mittels Durchflusszytometrie 20 verwendet wird . </li></ol> 4. Klonierung De Novo TCR Counter-hemichains <ol><li> Sortieren Sie die De - novo - Multimer positiven Population in Schritt 3.6 durch strömungsgestützte Zellsortierung. </li><li> Isolieren von RNA aus sortierten T - Zellen unter Verwendung der Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 21,2 2. HINWEIS: Die RNA kann bei -80 ° C gelagert werden, sollte aber cDNA verwendet werden, so schnell wie möglich zu erzeugen. </li><li> Synthetisieren cDNA - Bibliothek aus RNA extrahiert unter Verwendung von im Handel erhältlichen reversen Transkriptase-PCR - Kits folgenden Protokoll des Herstellers 23,24. </li><li> TCR &amp; bgr; Gegenketten Wenn das Klonen, Design V &amp; beta; Gen und TCR &amp; bgr; konstante Region spezifische Primer, wie 3.7 bestimmt in Schritt, und klonen voller Länge TCR &amp; bgr; Gene als 1,3-1,9 in Schritten beschrieben. Siehe Schritt 4.5, wenn Gegenkette TCR &amp; agr;, sonst weiterhin 5,1 Schritt. </li><li> Im Handel erhältliche V &amp; alpha;-spezifische Antikörper begrenzt sind, so Verwendung V &amp; alpha; Gen kann nichtwerden durch Durchflusszytometrie bestimmt. Clone TCR &amp; agr; Gegenketten über 5&#39;-schnelle Amplifikation von cDNA - Enden (RACE) 25, unter Verwendung von im Handel erhältlichen 5 &#39;RACE - Kits 6. <ol><li> Synthesize 5&#39;-RACE-kompatibel cDNA aus RNA in Schritt extrahiert 4.2 Protokoll des folgenden Herstellers. </li><li> Führen 1. Runde PCR , wie in Tabelle 2 beschrieben. </li><li> Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.100 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Führen 2. PCR - Runde , wie in Tabelle 3 beschrieben, unter Verwendung von 1. Runde PCR - Produkt als Vorlage. HINWEIS: Die Primersequenzen unter Tabelle 3 gezeigt für die Klonierung in EcoRI und NotI verdaut wurden entworfen pMX Vektor. </li><li> Durchführung der Elektrophorese des PCR-Produkts und eluieren Bande von etwa 1.000 bps, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Clone TCR &amp; agr; Gene in EcoRI und NotI verdaut pMX Vektor und purify Plasmiden wie in den Schritten 1,5-1,9 beschrieben. </li></ol></li></ol> 5. Reconstituting Novel Antigen-spezifische TCR-Klone HINWEIS: Culture Jurkat-Zellen 76 und nachfolgende Zelllinien in RPMI-Medium, ergänzt mit 10% FCS und 50 ug / ml Gentamicin. Inkubiere Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 zwischen allen Schritten. <ol><li> Transduzieren Jurkat 76 Zellen 26 (oder gleichwertig TCR - / - menschliche Linie T - Zellen) mit centric TCR hemichain 293GPG Virus in Schritt 2.3 hergestellt werden. 76 Jurkat, seed 5 x 10 4 Zellen pro Well in 24-Well - Platte mit 1 ml Virus und 1 ml RPMI Medium. Zentrifugenplatte bei 1.000 xg und 32 ° C für 1 Stunde. </li><li> 24 Stunden nach der Infektion, sammeln hemichain transduzierten Jurkat-76-Zellen durch Pipettieren und Zentrifuge bei 350 × g für 4 min. Überstand verwerfen und resuspendieren in frischem RPMI-Medium für die weitere Kultur. </li><li> Reinige transduzierten Zellen, wenn die hemichain molekular ist 2-3 Tage nach dem Schritt 5.2 durch Fleck markierting mit Fluorophor anti-NGFR mAb , gefolgt von Flow-unterstützte oder Magnet unterstützt Zellsortierung (optional) 27 konjugiert. </li><li> 293GPG Virus kodiert, eine TCR-Zähler-Kette aus den Schritten geklont 4.4 oder 4.5 folgende Schritte 2.1 bis 2.3, produzieren. </li><li> Um voll und ganz den TCR Rekonstitution transduzieren stabil T-Zell-Linie, die die zentrierte TCR hemichain in Schritten erzeugt exprimierenden 5,1-5,3 unter Verwendung von Virus aus Schritt 5.4. Führen Transduktion als 5.1-5.2 in Schritten beschrieben. </li><li> Reinige CD3 + Transfektanten unter Verwendung von Anti-CD3 Magnet-gestützte Zellsortierung Protokoll folgenden Hersteller, 2-3 Tage nach dem Schritt 5.5 27. </li><li> Um Antigenspezifität zu validieren, die Transfektanten Fleck klonotypischen TZR, bestehend aus der zentrierten TCR hemichain gepaart mit verschiedenen Gegen Ketten exprimieren, mit anti-CD3 und / oder Co-Rezeptor-mAb und HLA-Multimer, 3-5 Tage nach der CD3 Reinigung. Analysieren Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 4 - 5) 19. </li></ol>

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<li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TCR+targeting+the+HLA-A%2A0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li>
</ol>

Das University Health Network hat ein Patent im Zusammenhang mit dieser Methodik angemeldet, auf dem N.H., M.N. und T.O. als Erfinder genannt werden. Die anderen Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die erste Voraussetzung für eine erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens ist das Erreichen ausreichender Transduktionseffizienz von primären T-Zellen mit dem hemichain von Interesse. Nach unserer Erfahrung ist die Kombination der Verwendung von PG13 als Verpackungszelllinie und pMX als retroviraler Vektor Ergebnisse in stabile und effiziente Expression des eingeführten Gens in humanen primären T-Zellen. PG13 Verpackungszellen können Einzelzelle für hochtitrige Verpackungszellen auszuwählen geklont sein Transduktionseff...

T-Zell-Rezeptoren (TCRs) sind heterodimere adaptive Immunrezeptoren von T-Lymphozyten exprimiert wird, die aus einer TCR &amp; agr; und TCR &amp; bgr; Kette. Sie werden über somatische Umordnung von V (D) J-Gensegmenten erzeugt, die praktisch unbegrenzte Konfigurationen von HLA / Peptid-Komplexe eine sehr vielfältige Repertoires der Lage zu erkennen, erzeugt. Klinisch entwickelt T - Zellen klonotypischen TCRs spezifisch für tumorassoziierte Antigene zu exprimieren zeigten Wirksamkeit bei einer Vielzahl von Krebsarten 1. Allerdings fehlt für das Antigen von Interesse ausreichende Affinität viele TZR für diesen Zweck geklont, die ihre therapeutische Anwendung begrenzen. Hier beschreiben wir eine Methode, um diese Einschränkung für bestehende TZR zu überwinden, indem Kette Zentriert nutzen. Es wurde berichtet, dass ein TCR hemichain 2 eine dominantere Rolle bei der Erkennung des Zielantigens spielen könnte, hier genannt centricity. Kristallstrukturanalysen haben gezeigt, dass eine zentrierte gezeigthemichain eines TCR könnte für die Mehrheit des Fußabdrucks Konto auf dem MHC / Peptid - Komplex 3,4. Mit diesem Konzept haben wir bereits gezeigt , dass die SIG35α TCR &amp; agr; mit einem vielfältigen Repertoire von TCR &amp; bgr; Ketten paaren und zu pflegen Reaktivität gegen das MART1 27-35 Peptid präsentiert von HLA-A2 5. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem TAK1 TCR erhalten, wobei die zentrische TCR &amp; bgr; hemichain mit verschiedenen TCR &amp; agr; Ketten gekoppelt und gehalten Reaktivität für das WT1 235-243 Peptid durch HLA-A24 präsentiert 6. Sowohl MART1 und WT1 sind tumorassoziierte Antigene. Kettenzentriertheit wurde auch 7 durch Paarung die invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCR &amp; agr; Kette von menschlichem iNKT TZR mit verschiedenen Vβ11 TCR &amp; bgr; Ketten zu studieren Antigenerkennung von CD1d beschränkten invariant natürliche Killerzellen (iNKT) TZR, angewendet. In allen Fällen konnten wir eine De - novo - Repertoire von TZR durch trans zu erzeugenGabe die zentrierte TCR hemichain zu peripheren T-Zellen Blut, wo die eingeführte hemichain mit dem endogenen TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; Gegenketten gepaart. Im Wesentlichen dient die zentrische hemichain als Köder, die verwendet werden können, die entsprechenden Gegen Ketten zu identifizieren, die, wenn sie miteinander gepaart TCRs bilden, die die Antigenspezifität von Interesse aufrechtzuerhalten, noch in Affinitäts variiert. Von diesen neuen Repertoires konnten wir klonotypischen TZR mit verbesserter Wechselwirkungsstärke gegen das Zielantigen zu isolieren, im Vergleich zu bereits bestehenden TZR. Deshalb glauben wir, diese Methode wird die Pipeline zu identifizieren optimale TZR für die klinische Anwendung zu beschleunigen.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG-Zellen</td><td>Erzeugt von Ory et al. (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column DNA-Gel-Extraktionskit</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0,45 mm Poren-SFCA-Membran</td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Anti-Human-CD271 (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td></td><td>345104-Klon ME20.4</td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Anti-Human-CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>für die mehrteilige DNA-Assemblierung</td></tr><tr><td>HLA-A2-Pentamer</td><td>Proimmune</td><td>hängt von antigenem Peptid</td><td>ab HLA-A2/MART1-Multimer, das hier verwendet wird, wurde von Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d-Monomeren</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td> <td>gekauftMultimerisierung von Monomeren gemäß dem von NIH bereitgestellten Protokoll Tetramer Core Facility</td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>humane CD3-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 Zellen</td><td>Erzeugt von Heemskerk et al. (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Kompetent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>für den EcoRI- und NotI-Aufschluss</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>zur Plasmidaufreinigung</td></tr><tr><td>PC5-konjugiertes anti-humanes CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>Klon B9.11</td></tr><tr><td>PG13-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; High-Fidelity-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX retroviraler Vektor</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin (rekombinantes humanes Interleukin-2)</td><td>Novartis</td><td>by Rx</td><td>kann nur gleichwertiges Produkt von Sigma-Aldrich erworben werden</td></tr><tr><td>Aufgereinigter anti-humaner CD3-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>Klon OKT3, der für die T-Zell-Stimulation verwendet</td></tr><tr><td>wird RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>zur Multimerisierung von Monomeren aus der NIH-Tetramer-Core-Anlage</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5'/3'&nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Erststrang-Synthesesystem</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>für die cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, Stülpspitze</td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>zur Transfektion von 293GPG-Zellen</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

generieren<em&gt; de novo</em&gt; antigen-spezifische zellrezeptoren humanen t von retrovirale transduktion von centric hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T-Zell-Rezeptoren (TCR) verwendet klinisch die Spezifität von T-Zellen zu lenken Tumoren als eine viel versprechende Modalität der Immuntherapie zu zielen. Daher ist die Klonierung TCRs spezifisch für verschiedene Tumor-assoziierte Antigene war das Ziel vieler Studien. eine wirksame T-Zell-Antwort hervorzurufen, muss das TCR das Zielantigen mit optimaler Affinität erkennen. Es wurde jedoch Klonierung solche TCRs eine Herausforderung und viele verfügbare TCRs besitzen suboptimalen Affinität für das zugehöriges Antigen. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum Klonieren von de novo hoher Affinität antigen-spezifischen TCRs vorhandene TCRs durch hemichain centricity ausnutzt. Es ist bekannt, dass für einige TCRs jedes TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; hemichain nicht in gleicher Weise für die Antigenerkennung beitragen, und die dominante hemichain als zentrische hemichain bezeichnet. Wir haben, dass von der ursprünglichen Gegenkette unterscheiden durch Paarung der centric hemichain mit Gegen Ketten gezeigt, wir sind in der Lage, das Antigen s zu haltenpecificity, während die Wechselwirkungsstärke für das zugehöriges Antigen zu modulieren. Somit kann das therapeutische Potential einer gegebenen TCR durch Optimierung der Kopplung zwischen den zentrisch und Zähler hemichains verbessert werden.

Ohne vorherige Kenntnis davon hemichain ist Kette zentrierten sollte die TCR &amp; agr; und TCR &amp; bgr; Kette getrennt kloniert und auf peripheren Blut - T - Zellen transduziert werden, die im Fall von HLA-A24 / WT1 reaktiven TAK1 TCR (Bild 1) durchgeführt wurde. Transduktion von TAK1β ergab eine deutlich höhere Frequenz von Antigen-spezifischen T-Zellen. Im Gegensatz dazu , Transduktion eines nicht-zentrierten hemichain würde de novo Multimer positiven T - Z...

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, de-novo-T-Zell-Rezeptoren oder TCRs zu erzeugen, die ein spezifisches Antigen der Wahl erkennen. Diese Methode kann dabei helfen, optimale T-Zell-Rezeptoren im Bereich der genetisch modifizierten Immuntherapie zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nur eine einzelne alpha- oder beta-Halbkette isoliert werden muss, um neue, antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren zu generieren. Nach der Elution des TCR das Gen durch Klonierung des PCR-Produkts mittels Kombination jedes linearen Fragments mit einem im Handel verfügbaren Assemblierungs-Master-Mix-Reagenz klonieren und das Gemisch eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation chemisch kompetente E. coli mit dem assemblierten Plasmid gemäß Herstellervorschrift transformieren und die transformierten Bakterien auf Agarplatten ausstreichen, die 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Am nächsten Tag eine einzelne bakterielle Kolonie in 50 Milliliter Lysogenie-Brühe überführen und 16 Stunden in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute kultivieren.Dann unter Verwendung ei

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Aktivierte murine CD8+ T-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA enthalten, die für einen antigenspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodieren, werden dann eingeführt, und die Platte wird zentrifugiert, um die Transduktion zu erleichtern.

Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen...

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR).  Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Erfahren Sie die Generierung de novo antigenspezifischer T-Zell-Rezeptoren durch retrovirale Transduktion zentrischer Hemiketten. Diese Methode vereinfacht die TCR-Isolation für die Immuntherapie.

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