Name: Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Lernen Sie die retrovirale Transduktion primärer muriner T-Helferzellen zur Untersuchung regulatorischer Signalwege bei der Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von MicroRNA-Funktionen in der Immunbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/H018573/1) und einen Zuschuss von BD Biosciences unterstützt.

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Den Autoren steht kein widersprüchliches Interesse an der Veröffentlichung dieser Arbeit entgegen.

Retrovirale vermittelte Überexpression von Genen ist eine leistungsfähige Methode, Funktion in T-Helferzellen zu analysieren, wie ihre Entwicklung und Funktion oft durch die Expression von Schlüsselregulatoren bestimmt wird. Allerdings ist vorsichtige Interpretation der Ergebnisse erforderlich, da die Expressionsniveaus deutlich über denen des endogenen Gens viele Artefakte einführen können. Daher sollte diese Technik mit anderen kombiniert werden, um die Relevanz der Funktion zu überprüfen. Zum Beispiel Überexpression sollte durch eine reduzierte Expression unter Verwendung von siRNAs oder Gen-Knockout falls vorhanden, ergänzt werden. Mit miRNAs, ergänzt wir die Überexpression Experimente mit denen der Blockierung von Viren verwendet , die künstliche miRNA Targeting Websites überexprimiert , die als kompetitive Inhibitoren für eine miRNA 15 gehandelt hat. Retrovirale transduzierten Zellen können auch in biochemischen Assays denen RNA und Protein-Analyse verwendet werden. Jedoch ist eine große Einschränkung dieser Experimente Effizienz der Transduktion resulting in einer gemischten Population von transduzierten und untransduzierten Zellen. Daher werden diese Assays wahrscheinlich erfordern der GFP + -Population Sortieren. Schließlich wird in vitro Differenzierungsassays sollten mit in vivo Experimenten kombiniert werden, und ein Weg , dies erreicht werden kann , ist durch die adoptiv transduzierten T - Zellen in Mäuse übertragen und nach ihrer Differenzierung und ihre Wirkung auf die Immunantwort. Eine der wichtigsten Beschränkungen dieses Systems ist die Größe des RNA-Genoms, die in das retrovirale Kapsid verpackt werden kann. Nach unserer Erfahrung ist die maximale Einsatzgröße für MIG retroviralen System, das gute Virusproduktion gibt, ist 3-3,5 kb. Daher können größere Gene mit diesem System nicht analysiert werden, da sie schlechte Virustiter geben. Jedoch sind die meisten Gene kleiner als diese Größe so dass dieses System für eine große Vielzahl von Gen-Studien nützlich ist. Mit retrovirale Transduktion, mehrere Alternativen, die in dieser Protocols verwendet. Viele Forscher haben Verpackungszelllinien verwendet, die die retroviralen Gene stabil exprimieren (zum Beispiel 16 Referenz). Allerdings haben wir die höchsten Titer unter Verwendung von Standard-HEK 293T-Zellen mit Co-Transfektion des PCL- Eco Helfervirus-Vektor erhalten. Isolation von naiven T-Helferzellen können auch durch die Zelle erreicht werden Sortier anstelle der magnetischen Kügelchen und Zellseparationssäule Protokoll, aber dies erfordert Zugang zu einem Zellsortierer, und die Kosten für die Sortierzeit sind in der Regel höher als die Wulst Reagenzien. Schließlich gibt es Variationen Aktivierungsbedingungen verwendet, um Helfer-T-Zellen in den verschiedenen Untergruppen zu unterscheiden. Zum Beispiel TCR Stimulation der Zellen zu lange vor der Einwirkung von Treg induzierenden Bedingungen können ihre Induktion 16 hemmen. Dies kann ein Problem sein, weil retroviralen Expressions erfordert durch Stimulation von Zellen induzierten Zellteilung. Trotzdem haben wir eine effiziente Treg Induktion dieses Protokoll mit O / N activ gefundenation vor der retrovirale Transduktion. Innerhalb dieser Protokolle, erfordert eine erfolgreiche Anwendung mehrere Faktoren zurückzuführen. Hohe Titer-Retrovirus Präparate benötigen effiziente Transfektion der HEK 293T-Zellen so qualitativ hochwertige DNA und präzise vorbereitet 2x HBS sind wichtig. Darüber hinaus muss die Zelldichte der HEK 293T-Zellen etwa 50% am Punkt der Transfektion zu sein, weil eine gute Expression der transfizierten DNA erfordert, dass die Zellen aktiv wachsen, und dies verhindert werden, wenn die Zellen zu spärlich oder dicht sind. Zellen, die bei der optimalen Dichte während der Transfektion sollten Einmündung an einem gewissen Punkt während der Virussammlung Schritte erreichen, aber sie werden auch weiterhin mit hohem Titer Virusstämme den ganzen Weg bis zum letzten Kollektion produziert. Effiziente Differenzierung der T - Helferzellen erfordert eine gute Zellqualität gewährleisten , so dass isolierte Zellen auf die Reinheit sind in 1 dargestellt ist . In ähnlicher Weise ist die Qualität der Zellen hängt von der Mäuse from, die sie isoliert wurden. Für diese Studien haben wir 6-8 Wochen alte C57BL / 6-Mäusen verwendet. Ältere Mäuse haben weniger naive Zellen und andere Stämme in ihrer Differenzierung unterscheiden. Beispielsweise BALB / c - Mäuse sind anfälliger für Th2 - Antworten als C57BL / 6 - Mäusen 17 so wie oben erwähnt, C57BL / 6 - T - Zellen kann schwierig sein , eine Th2 - Antwort zu induzieren. Zusätzlich kann jeder der Differenzierungsbedingungen können leicht von Labor zu Labor variieren und die Wirkung von Gen-Überexpression kann in nur suboptimale Bedingungen offensichtlich werden so Cytokin-Konzentrationen in den verschiedenen Polarisationszustände müssen titriert werden. Schließlich Wirkungen des überexprimierten Gens oder die Polarisationsbedingungen auf die Zellproliferation können die Transduktionseffizienz beeinflussen so Meßeffekte des Gens von Interesse erfordern kann das Timing und die Konzentration der polarisierenden Reagenzien zu optimieren. Die Optimierung all dieser Faktoren sollten mit diesem System zu informativen Ergebnissen führen.

Die Immunantwort muss stark reguliert werden, um Infektionen zu eliminieren, aber Angriffe auf das Eigengewebe zu verhindern, die zu Autoimmunität führen. Helfer-T-Zellen spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Immunantwort, und es wurden große Anstrengungen unternommen, um ihre Entwicklung und Funktion zu verstehen (dargestellt in mehreren neueren Übersichtsarbeiten 1-3). Es bleiben jedoch viele Fragen offen, und es wurden viele Ansätze verwendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen steuern. Diese reichten von der Verwendung von In-vitro-Zellkultursystemen bis hin zu ganzen Tieren. Zellkultursysteme, insbesondere solche, die Zelllinien verwenden, bieten den Vorteil einer einfachen Handhabung und der Möglichkeit, große Mengen an Material für anspruchsvolle biochemische Analysen zu erzeugen. Sie leiden jedoch unter ihrer eingeschränkten Fähigkeit, die tatsächlichen Bedingungen einer Immunantwort zu reproduzieren. Im Gegensatz dazu bieten Ganztierversuche den Vorteil der Relevanz, können aber neben ihren hohen Kosten und ethischen Implikationen auch unter Schwierigkeiten bei der Manipulation und der Fähigkeit zur Durchführung präziser Kontrollen leiden. Nichtsdestotrotz erfordert die überwiegende Mehrheit der heutigen Studien an T-Helferzellen immer noch die Verwendung von Ganztierversuchen mit primären T-Zellen, da die Zelllinien nicht in der Lage sind, die genauen Schritte, die im gesamten Tier ablaufen, zu duplizieren. Daher ist es wichtig, kostengünstige Ansätze zu verwenden, die sehr informativ sind. 
Genetik ist ein mächtiges Werkzeug, um die Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen zu untersuchen, doch traditionelle Methoden mit Gen-Knockouts oder Transgenen sind zeitaufwändig und teuer, so dass sie oft außerhalb der Reichweite kleiner Labore liegen. Die retrovirale Transduktion bietet jedoch einen leistungsfähigen, schnellen und kostengünstigen genetischen Ansatz, um die Mechanismen spezifischer Genprodukte zu untersuchen. Daher wird es häufig in Arbeiten verwendet, die die Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen untersuchen. 
Wir haben ein Verfahren zur retroviralen Transduktion von T-Helferzellen optimiert. Es verwendet den retroviralen Expressionsvektor pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein), bei dem das interessierende Gen kloniert und dadurch aus dem Retrovirus Long Terminal Repeat (LTR) exprimiert werden kann 4. Darüber hinaus befindet sich hinter dem eingefügten Gen von Interesse eine interne Ribosomeneintrittssequenz (IRES), gefolgt von dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Gen, so dass transduzierte Zellen leicht anhand ihrer GFP-Expression verfolgt werden können. Der Vektor wurde ursprünglich von den Vektoren des Mausstammzellvirus (MSCV) abgeleitet, die Mutationen an den Repressor-Bindungsstellen in den LTRs enthalten, die sie resistent gegen Silencing machen und somit in vielen Zelltypen, einschließlich T-Helferzellen, eine hohe Expression aufweisen 5,6. Die Produktion von Retroviren mit hohem Titer erfordert ein einfaches transientes Transfektionsprotokoll von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) mit 293T-Zellen mit dem MIG-Vektor und einem Helfervirusvektor, der die retroviralen GAG-, Pol- und Env-Gene exprimiert. Zu diesem Zweck eignet sich der pCL-Eco-Helfervirusvektor 7 gut bei der Produktion von inkompetenten Retroviren mit hoher Titerreplikation. 
Hier werden diese Protokolle für die retrovirale Produktion und Transduktion von primären murinen T-Zellen beschrieben, zusätzlich zu einigen unserer Ergebnisse, die diesen Ansatz verwenden, um die miRNA-Regulation der Genexpression zu untersuchen, die die Differenzierung von T-Helferzellen steuert. miRNAs sind kleine RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren, indem sie auf homologe Sequenzen in proteinkodierenden Boten-RNAs abzielen und die Translation und Induktion unterdrücken Instabilität der Nachricht 8,9. miRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation in der Entwicklung. Sie sind in den frühesten Stadien der Entwicklung unerlässlich, da Embryonen, die keine miRNAs produzieren können, in einem sehr frühen Stadium sterben 10. Darüber hinaus sind miRNAs später in der Entwicklung vieler Gewebe wichtig. Es wird angenommen, dass sie durch die Feinabstimmung der Expression von Genen funktionieren, die für Entwicklungsprogramme erforderlich sind 1. In T-Helferzellen spielen miRNAs mehrere Rollen und werden für die Entwicklung regulatorischer T-Zellen (Treg) benötigt 11-14. Wir nutzten die retrovirale Transduktion, um die Mechanismen der miRNA-Regulation der Treg-Differenzierung zu entschlüsseln 15. Durch solche Studien wurden wichtige einzelne miRNAs durch retrovirale Überexpression bestimmt. Anschließend wurden relevante Gene identifiziert, die von diesen miRNAs reguliert werden, um die molekularen Signalwege zu verstehen, die von miRNAs bei der Differenzierung von T-Helferzellen reguliert werden.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Lösung</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG Vektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco Vektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen Maus CD4 Zellkit&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Perlen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Zelltrennsäulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS Zelltrennsäulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenyliert MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>Klon 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Biotenyliert MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>Klon MEL-14</td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Klon 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Klon 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>Klon 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>Klon XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>KlonJES6-5H4</td></tr><tr><td>Rekombinant IL-12 p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant TGF-beta</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IL-6</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>Paraformaldehyd ist giftig, seien Sie also bei der Handhabung angemessen vorsichtig.</td></tr><tr><td>Foxp3 Färbepuffer-Set</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>Klon GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>Klon 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; Klon HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; PC61.5&nbsp; klonen</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>Klon MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>Klon IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>Klon XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>Klon 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE oder APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>Klon RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>Klon TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC oder PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>FJK-16s klonen</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose/Glucose</td><td></td><td>Sigma G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, freie Säure</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Dinatrium-EDTA</td><td>Sigma</td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirale transduktion von t-helferzellen als genetischer ansatz zur untersuchung mechanismen der kontrolle ihrer differenzierung und funktion

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helfer Die Entwicklung und Funktion von T-Zellen muss streng reguliert werden, um eine angemessene Immunantwort zu induzieren, die spezifische Krankheitserreger eliminiert und gleichzeitig Autoimmunität verhindert. Viele Ansätze mit verschiedenen Modellorganismen wurden verwendet, um die Mechanismen zu verstehen, die die Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen steuern. Studien mit Mausmodellen haben sich jedoch aufgrund der Verfügbarkeit genetischer, zellulärer und biochemischer Systeme als sehr informativ erwiesen. Ein genetischer Ansatz bei Mäusen, der von vielen Laboren verwendet wird, ist die retrovirale Transduktion von primären T-Helferzellen. Dies ist aufgrund seiner relativen Leichtigkeit ein leistungsstarker Ansatz, der für fast jedes Labor mit grundlegenden Fähigkeiten in Molekularbiologie und Immunologie zugänglich ist. Daher können mehrere Gene in Wildtyp- oder Mutantenformen leicht auf ihre Funktion in T-Helferzellen getestet werden, um ihre Bedeutung und Wirkmechanismen zu verstehen. Wir haben diesen Ansatz optimiert und beschreiben hier die Protokolle für die Produktion von Retroviren mit hohem Titer, die Isolierung primärer muriner Helfer-T-Zellen und deren Transduktion durch Retroviren und die Differenzierung zu den verschiedenen Helferuntergruppen. Schließlich wird die Verwendung dieses Ansatzes durch die Aufdeckung von Mechanismen beschrieben, die von microRNAs (miRNAs) genutzt werden, um Signalwege zu regulieren, die die Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen steuern.

Der Erfolg dieses experimentelle System erfordert sehr reine Populationen von T-Zellen und hoher Titer-Retrovirus-Präparate. Repräsentative Ergebnisse sind als Beispiele für erfolgreiche Experimente hier gezeigt. Abbildung 1 zeigt die typische Reinheit von prä- und post ausgewählten Populationen in jeder Phase der naiven T - Helferzellisolierungsprotokoll, Fig . 2 und 3 veranschaulichen die Analyse von Retrovirus - Produktion durch die GFP - Expression in den transfizierten HEK 293T - Zellen (Abbildung 2) und transduzierten T - Zellen (Abbildung 3). Transfektionseffizienzen der HEK 293T - Zellen können erheblich variieren mit verschiedenen retroviralen Konstrukten, aber dies häufig korreliert nicht mit der Ebene der Produktion Retrovirus mit der Anzahl der GFP + T - Zellen beobachtet. Auch kann die Anzahl der GFP + T - Zellen hängt von der Polarisationsbedingungen variieren. Weiterhin ist die mean Expression von GFP und das insertierte Gen kann in Abhängigkeit von der Anzahl der Kopien Virus integriert, die Wirkung der Integrationsstelle auf die Transkription und post-transkriptionalen Regulationsmechanismen variieren, um die viralen Transkripts zu beeinflussen. Schließlich Abbildung 4 zeigt einige typische Ergebnisse , die wir mit Helfer - T - Zell - Differenzierung beobachtet , wenn die miRNAs miR-15b / 16 überexprimiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einige der Variabilität, die innerhalb eines einzelnen Experiments so wahr Effekte begründet werden muss durch eine statistische Analyse von mehreren Wiederholungsversuchen mit verschiedenen Präparaten von T-Helferzellen auftreten kann. In diesen Experimenten können Th2-Antworten schwierig sein, in der C57BL / 6-Linie hier verwendet, um zu beobachten, weil sie zu Th1-Reaktionen neigen. Ebenso kann IL-9-Färbung schwierig sein, über dem Hintergrund zu erfassen. Daher ist es zwingend notwendig, Isotypkontrollen zu tun und einen angemessenen Ausgleich einzurichten, um eine korrekte ga gewährleistenting der Zytokin-Expression. In unseren Ergebnissen haben wir , dass miR-15b / 16 verbessert iTreg Induktions 15 durch Hemmung des mTOR - Signalweg durch Unterdrückung der Expression der Komponenten Rictor und mTOR gefunden. miR-15b / 16 kann manchmal beeinflussen Th0, Th1 und Th17 Differenzierung in einzelnen Experimenten, aber es gibt keine signifikante Wirkung, wenn in mehreren Wiederholungsversuchen untersucht. Im Gegensatz miR-15b / 16 Überexpression nicht unterdrückt deutlich Th9 Differenzierung (siehe Referenz 18). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Abbildung 1. Typische Reinheit von Helfer - T - Zellen in jeder Phase der Isolation. Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der angegebenen Antigene werden von dem Gate von lebenden Zellen in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Side Scatter (SSC) Plots bezeichnet gezeigt. (A) vor und nach der CD4 - negative Selektion. Expressionsprofile von CD4,CD8a und MHCII gezeigt. Diese veranschaulichen die Anreicherung von Helfer-T-Zellen und den Verlust der zytotoxischen T-Zellen und MHC-Klasse II exprimierende Zellen. Eine gute Reinigung sollte in ~ 90% CD4 + T - Zellen in diesem Stadium führen. (B) CD25 Auswahl. Auf der linken Seite sind die Expressionsprofile von CD4, CD8a und MHCII, und auf der rechten Seite sind die CD4 und CD25-Expressionsprofile vor und nach der Auswahl. An dieser Stelle&gt; 95% der CD25 negativ selektierten Zellen sollten CD4 + CD25 sein -. (C) CD62L Auswahl. CD4, CD8a und MHCII Expressionsprofile sind auf der linken Seite gezeigt. Auf der rechten Seite werden die Expressionsprofile für CD62L und CD44 für Pre- und Post-CD62L ausgewählten Zellen zusammen mit CD4 und CD62L Expressionsprofil von Post ausgewählten Zellen gezeigt. Nach CD62L Auswahl praktisch alle Speicherzellen (CD44 +) entfernt , um eine hoch angereicherte Population von naiven T - Helferzellen zu verlassen , die 10-15% Effektor - Zellen (CD62L low) enthält. Für alleFACS-Profile, Einstellungen und äquivalente Skalen für einen bestimmten Parameter wurden während gehalten. Die Zahlen stellen den Prozentsatz an Zellen in einer Gated Bevölkerung. Der leichte Rückgang der Größe der Zellen nach der ersten Wahl ist vermutlich durch mechanische Beanspruchung während des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Retrovirus-transfizierten HEK 293T - Zellen. Die GFP - Expression in HEK 293T - Zellen gezeigt , die entweder untransfizierten waren oder transfiziert und nach der Entnahme von viralen Kulturüberständen analysiert. GFP-Analyse wurde an lebenden Zellen aus dem Tor auf der FSC und SSC Plot in der ersten Platte erfolgen. Die Zahlen stellen den Prozentsatz der GFP + Zellen innerhalb der Gated Region. Typische transfection Effizienzen liegen zwischen 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Abbildung 3. Analyse von Retrovirus transduzierten T - Helferzellen. GFP - Expression wird für drei Tage in retroviral transduzierten Helfer - T - Zellen nach Differenzierung in Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 und Treg Polarisationsbedingungen gezeigt. Die Analyse wurde gated auf Live- und aktivierten Zellen in der FSC / SSC-Panel angezeigt. Transduktionseffizienzen kann zwischen 10-75% in Abhängigkeit von dem Konstrukt und den Polarisationsbedingungen variieren. Ebenso kann die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP - Expression variieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 4. Wirkung von miR-15b / 16 Überexpression auf T - Zell - Differenzierung Helfer in verschiedenen Polarisationszustände. Repräsentative Zytokinprofile sind auf der GFP + Population von Zellen aus Abbildung 3 dargestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabelle 1:. Puffer in diesen Protokollen verwendet <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">diese Tabelle als Excel</a> - <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Tabelle zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> HelferT-Zell-Polarisationszustände </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> rekombinante IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> rekombinantes IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 10 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-6 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-2 </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Helper T - Zell - Untergruppe Polarisationszustände.

Viele experimentelle Systeme wurden die Mechanismen regulieren T-Zell-Entwicklung und Funktion in einer Immunantwort zu verstehen, verwendet. Hier ist ein genetischer Ansatz retrovirale Transduktion unter Verwendung beschrieben, die wirtschaftlich ist, Zeit effizient, und vor allem sehr informativ bei der Identifizierung von Regulationswege.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, primäre murine Helfer-T-Zellen zu isolieren und sie mit retroviralen Expressionskonstrukten für ein Gen von Interesse zu transduzieren. Zahlreiche experimentelle Systeme wurden verwendet, um die Mechanismen zu verstehen, die die Entwicklung und Funktion von T-Zellen während einer Immunantwort regulieren. Hier beschreiben wir einen genetischen Ansatz unter Verwendung der retroviralen Transduktion, der kostengünstig, zeiteffizient und äußerst aussagekräftig bei der Identifizierung regulatorischer Signalwege ist.Wir haben diese Technik verwendet, um die Funktion von Mikro-RNAs zu analysieren, die wichtige Regulatoren der Genexpression sind. Mithilfe der retroviralen Transduktion konnten wir die Funktion einzelner Mikro-RNAs und die Differenzierung von Helfer-T-Zellen untersuchen. Mein Mitarbeiter, Oliver Garden, wird die Isolierung primärer T-Zellen demonstrieren, und ich werde die retrovirale Transduktion demonstrieren.24 Stunden vor der Transfektion eine konfluente Zellkultur im Verhältnis 1:10 auf eine 10 cm-Platte aufteilen, sodass die Zellen am nächsten Tag etwa zu 50 % konfluent sind. Ungefähr eine Stunde vor der Transfektion das Medium von den Zellen entfernen und vorsichtig 9 Milliliter frisches HEK293-T-Medium hinzufügen, um ein Abheben der Zellen von der Platte zu verhindern. In einem sechs Milliliter fassenden Rundbodenbehälter oder einem 15-Milliliter-Konischgefäß fünf Mikrogramm retrovirale DNA, fünf Mikrogramm Hilfs-virus-DNA und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 420 Mikrolitern hinzufügen.Danach 80 Mikroliter 2,5-molares Calciumchlorid hinzufügen, um das Endvolumen auf 500 Mikroliter aufzufüllen. Anschließend langsam 500 Mikroliter 2x HBS tropfenweise unter leichtem Wirbeln zur DNA-Mischung hinzufügen, sodass die Lösung kontinuierlich vermischt wird und sich Calciumphosphat in gleichmäßig großen Kristallen ausfällt. Danach die Calciumphosphat-DNA-Mischung in eine Zellkulturwerkbank überführen.Fügen Sie die Mischung langsam unter ständigem, vorsichtigem Schwenken der Platte zu den Zellen hinzu, bevor Sie die Zellen wieder in den Inkubator stellen. Um das Virus am nächsten Tag zu sammeln, entfernen Sie das Medium und versorgen Sie die Zellen mit 10 Milliliter frischem HEK293-T-Medium, wobei darauf geachtet werden muss, die Zellen nicht von der Platte zu lösen. Am Abend versorgen Sie die Zellen mit 3,5 Milliliter frischem HEK293-T-Medium und inkubieren die Zellen 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius.Nach ungef&auml;hr 12 Stunden sammeln Sie das Medium und versetzen die Zellen erneut mit 3,5 Millilitern frischem HEK293-T-Medium. Wiederholen Sie die Mediumsammlung zwei weitere Male in Abst&auml;nden von jeweils etwa 12 Stunden, sodass insgesamt etwa 10 Milliliter Virusstamm gesammelt werden. F&uuml;gen Sie in diesem Verfahren Milz und Lymphknoten dem Zellsieb hinzu und zermahlen Sie sie mit dem Ende eines 5-Milliliter-Spritzenst&ouml;ßels.Anschließend spülen Sie sie mit ein bis zwei Milliliter R10-Medium aus. Überführen Sie dann die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas und stellen Sie das Volumen mit R10 auf 14 Milliliter ein. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Anschließend den Überstand mit einer sauberen Bewegung abgießen, um die Zellpalette nicht zu stören. Danach zwei Milliliter kalte Erythrozytenlysepufferlösung zu den Zellen geben. Mischen und die Zellen dann 3,5 Minuten unter leichtem Mischen auf Eis stellen.Anschließend 12 Milliliter R10-Medium hinzufügen und unverzüglich bei vier Grad Celsius 5 Minuten lang mit 600 × g zentrifugieren. Die Waschschritte noch zweimal mit R10-Medium durchführen, um jeglichen Rest an Erythrozytenlysepuffer aus den Zellen zu entfernen, und so den Tod von Lymphozyten vermeiden. In diesem Schritt je 8 bis 10 × 10⁷ Zellen pro kegelförmigem Reagenzglas abpipettieren und bei vier Grad Celsius 5 Minuten lang mit 600 × g zentrifugieren.Geben Sie den Überstand mit einer sauberen Bewegung ab, um den Zellpellet nicht zu stören. Wiederlösen Sie die Zellen in 100 Mikroliter hitzeinaktiviertem FBS. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Antikörpermix zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius unter sanfter Mischung auf einem Rollapparat.Danach die Kügelchen im Fläschchen durch Vortexen für mehr als 30 Sekunden erneut suspendieren. Anschließend die Kügelchen in ein 15-Milliliter-Kegelrohr überführen und 2 Milliliter R10-Medium pro Milliliter Kügelchen hinzufügen. Das Rohr für eine Minute in das Magnetfeld stellen.Danach die Überstände verwerfen und die Kügelchen in vier Milliliter R10-Medium resuspendieren. Am Ende der Antikörperinkubation die Zellen waschen, indem 10 Milliliter R10-Medium pro Röhrchen zugegeben werden, und bei 600 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand mit einer sauberen Bewegung abgießen, um die Zellpalette nicht zu stören, und anschließend die Zellen in 1 Milliliter R10-Medium resuspendieren.Im Anschluss 2 Milliliter der gewaschenen Kügelchen zu dem Röhrchen mit den antikörperbehandelten Zellen geben und 30 Minuten bei vier Grad Celsius unter sanfter Mischung auf einem Rollapparat inkubieren. Dann die Zell-Kügelchen-Mischung durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren fünfmal resuspendieren, bevor das Röhrchen zwei Minuten lang in den Kügelchenmagneten gestellt wird. Das Überstand enthaltende negativ selektierte Zellen in ein neues Röhrchen überführen und die negative Selektion ein weiteres Mal wiederholen.Zentrifugieren Sie in diesem Verfahren CD4-positive T-Zellen bei 600 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie sie in 150 bis 200 Mikroliter R10-Medium pro zehn hoch acht Zellen. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter der Stammlösung biotinylierter CD25-Monoklonalantikörper zu den Zellen und inkubieren Sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit sanftem Mischen auf einem Rollapparat. Danach waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter Zellseparationspufffer hinzufügen, und zentrifugieren Sie bei 600 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie anschließend so viel Überstand wie möglich und resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von etwa 90 Mikroliter pro 10 hoch 7 Zellen. Fügen Sie danach 20 Mikroliter Streptavidin-Perlen pro 10 hoch 7 Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch leichtes Antippen. Inkubieren Sie anschließend 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Während der Inkubation der Zellen die MS-Säulen vorbereiten. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zugabe von 10 Milliliter Zellseparationspufffer waschen und bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang mit 600 × g zentrifugieren. Die Zellen in 500 Mikroliter Zellseparationspufffer pro 108 Zellen resuspendieren.Anschließend 500 Mikroliter Zellsuspension auf die Säule auftragen und den Durchlauf sammeln. Den Durchlauf erneut über die Säule geben und den Durchlauf erneut sammeln. Danach die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern Zellseparationspuffer spülen und jeden Durchlauf zu den gesammelten CD25-negativen Zellen hinzufügen.Führen Sie die Waschung, die Bindung an Streptavidin-Kügelchen und die Vorbereitung der Zellseparationssäule wie zuvor beschrieben durch, verwenden Sie jedoch diesmal die LS-Säule. Entsorgen Sie in diesem Fall den Durchlauf und spülen Sie die Zellen mit dem beiliegenden Kolbenstößel von der Säule ab. Während der Isolierung der naiven T-Zellen beschichten Sie eine 24-Loch-Gewebekulturplatte mit in DPBS verdünnten Antikörpern gegen CD3 und CD28 und inkubieren diese zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar vor der Kultivierung der Zellen die Platte mit jeweils 250&nbsp;Mikrolitern DPBS pro Mulde waschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Anschließend DPBS entfernen und über Nacht 1&nbsp;Milliliter naive CD4-positive T-Zellen in R10-Medium hinzufügen. Am folgenden Tag die Zellen bei 30&nbsp;Grad Celsius 10&nbsp;Minuten lang mit 900&nbsp;×&nbsp;g zentrifugieren.Sammlen Sie anschließend das Medium und geben Sie 1 Milliliter Virus-Kulturüberstand zu, der gemäß dem Protokoll zur Virusproduktion hergestellt wurde. Fügen Sie danach 1 Mikroliter Polybrene (8 Milligramm pro Milliliter) und 10 Mikroliter HEPES (1 Mol pro Liter) hinzu, um die Virusaufnahme zu unterstützen, bevor die Zellen bei 900 × g für 90 Minuten bei 30 Grad Celsius zentrifugiert werden. Um die Differenzierung der Zellen einzuleiten, entfernen Sie vorsichtig den Virus-Kulturüberstand und geben 1 Milliliter des zuvor gesammelten Mediums hinzu, da dieses IL2 und andere Wachstumsfaktoren für T-Zellen enthält.Fügen Sie dann die in Tabelle 2 des begleitenden Manuskripts angegebenen Reagenzien hinzu und kultivieren Sie die Zellen drei bis vier Tage lang, um die Differenzierung in spezifische Subpopulationen zu induzieren. Diese Abbildung zeigt die typische Reinheit der vor und nach der Selektion erhaltenen Zellpopulationen in jeder Phase des Protokolls zur Isolierung naiver Helfer-T-Zellen. Die Expressionsprofile von CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L und CD44 veranschaulichen den Verlust von MHC-Klasse-II-Zellen sowie von zytotoxischen, regulatorischen und Gedächtnis-T-Zellen.Dies führt zu einer Population, die zu mehr als 95 % CD4-positive T-Zellen enthält, wobei ungefähr 85 % bis 90 % naiv sind und die verbleibenden 10 % bis 15 % Effektorzellen darstellen. In dieser Abbildung wird die GFP-Expression in HEC293-T-Zellen gezeigt, die entweder nicht transfiziert oder transfiziert waren, und nach der Sammlung von viralen Kulturüberständen analysiert wurden. Die GFP-Analyse erfolgte an lebenden Zellen aus dem Gate im FSE- und SSE-Plot.Typische Transfektionswirksamkeiten liegen zwischen 30 % und 90 %. Hier wird die GFP-Expression in retroviral transduzierten Helfer-T-Zellen nach Differenzierung unter Th0-, Th1-, Th2-, Th9-, Th17- und Treg-Polarisationsbedingungen über drei Tage gezeigt. Die Transduktionswirksamkeiten variieren zwischen 10 % und 75 %, abhängig vom Konstrukt und den Polarisationsbedingungen. Hier sind die repräsentativen Zytokinprofile zur Differenzierung von Helfer-T-Zellen unter verschiedenen Polarisationsbedingungen dargestellt.Wenn man diese Techniken einmal beherrscht, können sie eine leistungsstarke Methode zur Analyse der Genfunktion sowie der Entwicklung und Funktion von T-Helferzellen darstellen. Beachten Sie jedoch, dass aussagekräftige Ergebnisse von der Qualität der Zellen und Reagenzien abhängen. Daher ist es wichtig, die Transduktionsprotokolle sowie die Isolierung und Differenzierung von T-Helferzellen zu optimieren.

retroviral-transduction-helper-t-cells-as-genetic-approach-to-study

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Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

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