Ein Mausmodell der Gruppe B Streptococcus Vaginal Colonization

Das übergeordnete Ziel dieses Tiermodells ist es, eine Streptokokken-Besiedlung des murinen Vaginaltrakts mit Streptokokken der Gruppe B oder GBS zu etablieren. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen zur Besiedlung von Streptokokken der Gruppe B zu verstehen, z. B. welche bakteriellen Faktoren für die Besiedlung wichtig sind und wie sich die Reaktionen des Wirts auf die vaginale Persistenz auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Inokulation in der Regel zu einer Besiedlung von mehr als 90 Prozent führt, ohne dass Anästhesie, Immunsuppressiva oder Verdickungsmittel verwendet werden.

Beginnen Sie damit, 0,5 Milligramm Beta-Östradiol pro Maus in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu wirbeln, bis alle Klumpen entfernt sind und das Beta-Östradiol als feines Pulver erscheint. Spritzen Sie dann 100 Mikroliter Sesamöl pro Maus durch ein 0,45-Mikron-Sieb in das Röhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen erneut ein. Wenn das Hormon als homogene Suspension im Öl verteilt ist, ziehen Sie das Reagenz in eine neue 10-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel mit einem Zoll.

Aliquotieren Sie 100 Mikroliter der Suspension in eine Tuberkulinspritze von einem Milliliter pro Maus und rüsten Sie jede Tuberkulinspritze mit einer sterilen Nadel von 26 Gauge und einem halben Zoll aus. Geben Sie dann 100 Mikroliter Beta-Östradiol in den unteren linken oder rechten Quadranten der Bauchhöhle jedes Tieres. Züchten Sie am selben Tag wie die Injektion eine Flüssigkultur von fünf Millilitern über Nacht des GBS-Stammes von Interesse in Todd Hewitt-Brühe oder THB bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Morgen subkulturieren Sie das GBS mit einem Volumen von 1 bis 10 in frischem THB für eine zwei- bis dreistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius, bis die Bakterien die mittlere Log-Phase erreichen. Übertragen Sie dann die Subkultur in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Bakterienzellen. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern sterilem PBS.

Bringen Sie dann das Gesamtvolumen der Suspension auf bis zu einem Milliliter PBS pro 10 Mäuse, um einen OD600 von 0,4 in einem neuen Fünf-Milliliter-Kulturröhrchen zu erreichen. Übertragen Sie die Kultur in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie die Bakterien erneut. Resuspendieren Sie dann die Zellen in PBS mit einem Zehntel des ursprünglichen Volumens.

Reservieren Sie 50 Mikroliter der Bakterien für die serielle Verdünnung und Beschichtung auf THB-Agar, um die genaue KBE des Inokulums zu bestimmen. Ziehen Sie dann 10 Mikroliter GBS in eine 200-Mikroliter-Gellade-Pipettenspitze und befestigen Sie die lose Haut manuell am Nacken des ersten Tieres zwischen Daumen und Zeigefinger, gefolgt von einer Immobilisierung des Schwanzes. Führen Sie die Pipettenspitze 5 bis 10 Millimeter in das Vaginallumen ein und geben Sie das gesamte Volumen des Inokulums ab.

Lassen Sie dann sofort das Genick los und heben Sie den Schwanz an, um das Hinterteil des Tieres anzuheben, während Sie mit den Vorderpfoten auf einer harten Oberfläche gehen. Überprüfen Sie nach einer Minute die Vaginalöffnung visuell auf einen Inokulumrückfluss. Befeuchten Sie die Watte kurz vor dem Abstrich mit PBS und halten Sie eine der Mäuse zurück, wie gerade gezeigt.

Führen Sie den Tupfer 10 Millimeter in das Vaginallumen ein und drehen Sie ihn vorsichtig viermal im Uhrzeigersinn und viermal gegen den Uhrzeigersinn, während Sie leichten Druck auf die Vaginalwand ausüben. Legen Sie den Tupfer in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern PBS und wirbeln Sie das Röhrchen und den Tupfer etwa 15 Sekunden lang, um die Bakterien aus den Baumwollfasern zu lösen. Dann verdünnen Sie jede Probe seriell in PBS und plattieren Sie 20 Mikroliter von eins bis 10 bis 10.000 Verdünnungen auf eine Agarplatte mit unterschiedlichem Medium, die gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet wurde, für die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.

GBS-Kolonien erscheinen entweder in leuchtendem Rosa oder Malven. Um die Vaginalspülung zu sammeln, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um 20 Mikroliter PBS in das Vaginallumen abzugeben. Pipettieren Sie das gesamte Volumen vorsichtig viermal innerhalb des Lumens auf und ab.

Ziehen Sie dann mit der gleichen Spitze das gesamte Volumen ab. Für die nachgeschaltete Analyse der Spülflüssigkeit geben Sie die Spülung in ein 0,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Für die Homogenisierung der Gewebedissektion sprühen Sie den Bauchbauch eines euthanasierten Tieres mit 70 Prozent Ethanol ab und verwenden Sie eine sterile Schere, um die Bauch-Becken-Höhle zu öffnen.

Verlagern Sie den Darm, so dass der Fortpflanzungstrakt freigelegt wird. Schneiden Sie dann beide Gebärmutterhörner in mittlerer Länge zwischen Gebärmutterkörper und Eierstöcken ab. Trennen Sie mit Schere und Pinzette das viszerale Fett, die Membranen und die Harnblase vom Fortpflanzungstrakt und bewegen Sie das Gewebe kaudal.

Schneiden Sie dann die Vagina so nah wie möglich an der Vulva quer durch, um den Fortpflanzungstrakt vom Körper zu trennen. Übertragen Sie den intakten Fortpflanzungstrakt in eine sterile Petrischale und verwenden Sie eine neue Rasierklinge, um die Gebärmutter in einem einzigen, quer verlaufenden Schnitt vom Gebärmutterhals zu trennen. Trennen Sie den Gebärmutterhals mit einem weiteren Querschnitt von der Scheide.

Verwenden Sie dann eine sterile Pinzette, um jedes der Gewebe in einzelne, vorgewogene Zwei-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, die 500 Mikroliter PBS und Homogenisierungsperlen enthalten. Wiegen Sie jeweils 2 Milliliter Röhrchen, um die Gewebegewichte zu bestimmen. Verschließen Sie dann die Schraubverschlussröhrchen fest und homogenisieren Sie das Gewebe eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit in einem Gewebehomogenisator.

Um die bakterielle Belastung zu quantifizieren, verdünnen Sie seriell 25 Mikroliter Gewebehomogenat und platten Sie eins bis 10 bis eins bis 10.000 Verdünnungen auf Agarplatten mit unterschiedlichem Medium für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Um Proben für die Citokin-Quantifizierung zu lagern, frieren Sie die Homogenate bei minus 20 Grad Celsius ein. In diesen Bildern sind die vier Stadien des Brunstzyklus der Maus dargestellt, wie sie mit Hilfe von Nassspülflüssigkeit bestimmt werden.

Mäuse, die im Proöstrusstadium geimpft wurden, waren länger mit GBS besiedelt als jedes andere Stadium der Brunst, insbesondere diejenigen, die sich zum Zeitpunkt der Inokulation im Distrus befanden. Eine anhaltende Brunst fördert die Persistenz von GBS A909 bei CD-1-Mäusen mit einer 90-prozentigen Besiedlung, die zwei Wochen nach der Inokulation beobachtet wurde. In einem typischen Experiment mit einer Dosis Beta-Östradiol vor der Inokulation waren nur 40 bis 50 Prozent der Mäuse eine Woche nach der Inokulation besiedelt, mit einem wiedergefundenen mittleren GBS, der den Prozentsatz der Besiedlung nachahmt.

Es konnte gezeigt werden, dass die Aufrechterhaltung einer kontinuierlichen Brunst die vaginale GBS-Persistenz bei der Mehrzahl der CD-1-Mäuse fördert. GBS A909 persistiert im Vaginaltrakt von gezüchteten CD-1-Mäusen und gezüchteten FVB-Mäusen für etwa eine Woche. Während die Mehrheit der Inzucht-Mäuse BALB/c und C57BL/6 nach einer Woche für einen Monat oder länger besiedelt wird.

Die Visualisierung von GFP-positivem GBS bei inokulierten Tieren zeigt das Vorhandensein von GBS, das an das Vaginalepithel der Maus und in unmittelbarer Nähe zu anderer nativer Vaginalflora adhaftiert. Es ist wichtig, während der Inokulation einen Rückfluss zu verhindern, um sicherzustellen, dass alle Mäuse besiedelt werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik je nach Anzahl der Tiere in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden.

Dieses Modell ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Fähigkeit von Bakterien, wie Streptokokken der Gruppe B, zu untersuchen, den weiblichen Fortpflanzungstrakt zu besiedeln. Mit diesem Verfahren können neuartige Verbindungen oder probiotische Behandlungen getestet werden, um zusätzliche Fragen zu therapeutischen Interventionen zu beantworten.