Name: Nachweis von Trypanosoma brucei Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Trypanosomen mit spezifischen VSGs durch Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Detektion seltener Switching-Varianten.

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Wir möchten, dass George Cross für allgemeine Hinweise auf Trypanosomen Biologie anzuerkennen. Diese Arbeit wurde auch durch eine Bill and Melinda Gates Foundation GCE Zuschuss DS, ein NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) zu MRM und ein NIH / NIAID (Erteilungs # AI085973) zu FNP unterstützt. Wir danken Galadriel Hovel-Miner für die Verwendung des Stammes der I-SCEI-Gen und Erkennungsstelle enthält.

ANMERKUNG: In dem Verfahren ist es notwendig, Zellen auf Eis zu halten. Kalte Medien sollten auch überall eingesetzt werden. 1. Probenernte <ol><li> Wachsen Lister-Stamm 427 Blutstrom Trypanosomen zu einer Dichte von 0,5 bis 1.000.000 / ml. Es ist am besten Kulturen mit einer kleinen Anzahl von Parasiten zu starten. Spin down 50 x 10 6 Zellen / Probe für 10 min bei 1500 x g. Achten Sie darauf , 1 x 10 6 Zellen in Kultur zu verlassen , für später als positive und negative Antikörper - Steuerelemente verwenden. Hinweis: Dieses Protokoll kann auch auf aus Tierblut (siehe Diskussion für weitere Details) isoliert Trypanosomen verwendet werden. </li><li> Pipette oder schütten die meisten Überstand aus (lassen Sie etwa 750 &amp; mgr; l). Transfer der Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin-Zellen bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg in einer Mikrozentrifuge und entfernen Überstand. </li></ol> 2. Magnetische Labeling <ol><li> Die Zellen in 150 &amp; mgr; l Kulturmedium (HMI-9 with Serum zum Beispiel) + primäre anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung. HINWEIS: Die Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Es ist wichtig, eine primäre anti-VSG-Antikörper zu verwenden, die nicht mit einem Fluorophor markiert ist. </li><li> Vortex-Zellen einen Wirbel-Adapter-60 bei der Geschwindigkeit 6 unter Verwendung von - 10 min 8 in einem kalten Raum bei 4 ° C. Waschen mit 800 - 1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. </li><li> Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und den Überstand absaugen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und wie oben drehen. Den Überstand aspirieren. Pellet in 100 ul HMI-9 mit Serum. </li><li> Hinzufügen, 110 &amp; mgr; l magnetischen aktivierte Zellsortierung (MSC) Mikrokügelchen. Verwenden Sie Anti-Maus, anti-Kaninchen oder Anti-Biotin-Perlen als geeignet für den primären anti-Antikörper VSG. Gut mischen. Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Während Zellen werden verwirbelt, stellen eine Magnet-aktivierte Trennsäule / Probe auf einem Trennmagneten auf. Achten Sie darauf, eine erneute habenceptacle (wir verwenden, um eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen) unter der Spalte, die den Durchfluss zu sammeln. Stellen Sie das Gerät in einem kalten Raum. </li><li> 2 ml HMI-9 mit Serum zu grundieren Spalte. Nach der Grundierung Ort ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter dem Säulendurchfluss von jeder Probe zu sammeln. </li><li> Nach der 10-minütigen Inkubation in Schritt 2.4, fügen 800-1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und repeat 100 ul des Überstands zu verlassen. </li><li> Flick das Zentrifugenröhrchen kräftig und visuell inspizieren das Rohr, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig suspendiert. 1 ml der HMI-9 mit Serum und Pipette auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen sind gut suspendiert. </li></ol> 3. Magnetische Trennung <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Spalten grundiert werden, wie oben beschrieben. Anwenden Zellen Spalte. Sammeln der Durchströmung mit Zellen, die die nicht-dominante VS exprimierenG. 1 ml Medium + Trypanosomen dauert in der Regel 6 bis 7 min durch die Säule zu fließen. </li><li> Wasch 2x mit 1 ml HMI-9 mit Serum und zu sammeln, wie in Schritt 3.1 in dem gleichen Rohrdurchströmung. </li><li> Divide Durchfluss (3 ml) in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Diese später kombiniert werden können , oder die Hälfte kann verwendet werden , um RNA zu isolieren, usw. </li><li> Entfernen Sie Spalte von Magneten. 3 ml HMI-9 mit Serum-Säule und tauchen Sie Säule in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen Zellen zu erhalten, die die Ausgangs, dominant VSG auszudrücken. Entfernen 300 ul eluierte Material für eine spätere Analyse. Bewahren Sie diese Zellen auf Eis. </li><li> Zur Verwendung als positive und negative Kontrolle nehmen etwa 1 Million Zellen aus der Ausgangskultur von Kontrollzellen bei 37 ° C wachsen und Pipetten sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (die nicht zu wechseln häufig erwartet). HINWEIS: Positive Kontrollzellen werden mit Fluorophor-markierten Antikörper in Schritt 4.1 gefärbt werden. Negative Kontrollzellen REMAin für den Rest des Protokolls ungefärbt. </li><li> Spin Durchflussproben und positive Kontrollprobe Antikörper bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. HINWEIS: Weitere 300 &amp; mgr; l Aliquot von eluierten Zellen können als positive Kontrolle für die Anti-VSG-Färbung verwendet werden. </li></ol> 4. Die Färbung zu identifizieren Fremd- und Switcher <ol><li> Resuspendieren Durchflussproben und positive Kontrollzellen in 100 ul HMI-9 mit Serum + primären, Fluorophor-markiertem, anti-VSG Antikörper bei der geeigneten Verdünnung. HINWEIS: Die markierten Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1: 1000. Der Fluorophor-markierten, anti-VSG können aus der gleichen Quelle wie die unmarkierten Antikörper in der Trenn MACS step.There 3 ml Durchfluss Probe in zwei Mikrozentrifugenröhrchen folgenden Schritt 3.5 sein sollte. </li><li> Um alle Durchfluss mittels Durchflusszytometrie, vereinige die Pellets in den beiden Mikrozentrifugenröhrchen analysieren, während erneut susdie Proben in 100 ul anhängiger HMI-9 mit Serum + anti-VSG-Antikörper. Gut mischen. </li><li> Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. In 800 - 1000 ul kalt HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml von HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. Während dieser letzten Spin, drehen die eluierten-Proben aus Schritt 3.4 nach unten und der negativen Kontrollprobe. </li><li> Resuspendieren alle Flow-Through und eluierten Proben in: 148,5 ul HMI-9 mit Serum, 25 &amp; mgr; l absolute Zählen Perlen und 1,5 ul Propidiumiodidfärbung Lösung (175 ul insgesamt). Resuspendieren positive und negative Antikörper Kontrollproben in 175 &amp; mgr; l HMI-9 mit Serum. Achten Sie darauf, die Zahl der absoluten Zählen Perlen / 25 &amp; mgr; l für die jeweilige Menge zur Aufzeichnung. </li><li> Führen Sie alle Proben durch einen Durchflusszytometer und sammeln Daten. Tote Zellen anfärben als PI <sup&gt; +. Verunreinigungen Fleck als PI - VSG +. Switcher Fleck als PI - VSG - 8. </li><li> Berechnen Schaltfrequenzen mit Hilfe der Durchflusszytometrie Daten. HINWEIS: Für Anweisungen, wie Schaltfrequenzen zu berechnen, finden Sie in der Zusatzdatei <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Flow Cytometry Calculations.docx</a> und Tabelle 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In Bezug auf experimentelle Technik, die kritischste Komponente des Protokolls hält alle Proben kalt. Trypanosomen internalisieren sehr rasch Antikörper an ihre Oberfläche gebunden 9, aber dieser Prozess ist Motilität abhängig und beeinflussen nicht den Test, solange die Zellen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Alle Proben sollten immer auf Eis gehalten werden, und Pipettieren sollte schnell Exposition zu minimieren, um die 25 ° C Laborumgebung durchgeführt werden. Kalt HMI-9 mit Serum sollte zu Beginn des Experim...

Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper - Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. &#39;Switching&#39; des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG - Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in 1) auftreten. Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 6 Zellen 2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später 3 oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz 4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher 6 isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann - 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population 7 zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>unmarkierter Anti-VSG-Antikörper</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG-Antikörper wird im eigenen Haus hergestellt</td></tr><tr><td>Fluorophor-markierter Anti-VSG-Antikörper</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG-Antikörper wird im eigenen Haus hergestellt</td></tr><tr><td>HMI-9 Medien</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 wird im eigenen Haus hergestellt</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute Zählperlen</td><td>Thermofisher </td><td>Scientific C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD Säulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetabscheider</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Adapter-60</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Schar</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware für Durchflusszytometer</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; variante oberflächen-glykoprotein switching von magnetic activated cell sorting und durchflusszytometrie

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, ein Protozoen-Parasit, der sowohl menschliche als auch tierische afrikanische Trypanosomiasis (bekannt als Schlafkrankheit bzw. Nagana) verursacht, wechselt zwischen einem Tsetse-Vektor und einem Säugetierwirt. Es entzieht sich dem Immunsystem des Säugetierwirts, indem es periodisch das dichte, variante Oberflächenglykoprotein (VSG) umschaltet, das seine Oberfläche bedeckt. Der Nachweis der antigenen Variation bei Trypanosoma brucei kann sowohl umständlich als auch arbeitsintensiv sein. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Anzahl der Parasiten vor, die in einer bestimmten Population "umgeschaltet" haben, um ein neues VSG zu exprimieren. Die Parasiten werden zunächst mit einem Antikörper gegen das Ausgangs-VSG gefärbt und dann mit einem Sekundärantikörper, der an eine Magnetkugel gebunden ist. Parasiten, die das Ausgangs-VSG exprimieren, werden dann vom Rest der Population getrennt, indem die Parasiten über eine Säule laufen, die an einem Magneten befestigt ist. Parasiten, die das dominante, beginnende VSG exprimieren, werden auf der Säule zurückgehalten, während der Durchfluss Parasiten enthält, die ein neues VSG exprimieren, sowie einige Kontaminanten, die das ausgehende VSG exprimieren. Diese Durchflusspopulation wird erneut mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das Ausgangs-VSG zur Markierung von Kontaminanten und Propidiumiodid (PI), das tote Zellen markiert, angefärbt. Eine bekannte Anzahl von absoluten Zählkügelchen, die durch Durchflusszytometrie sichtbar sind, werden der Durchflusspopulation hinzugefügt. Das Verhältnis der Kügelchen zur Anzahl der gesammelten Zellen kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Zellen in der gesamten Probe zu extrapolieren. Die Durchflusszytometrie wird verwendet, um die Population der Wechsler zu quantifizieren, indem die Anzahl der PI-negativen Zellen gezählt wird, die sich nicht positiv für das beginnende, dominante VSG färben. Anhand der Daten der Durchflusszytometrie kann dann der Anteil der Wechsler in der Grundgesamtheit berechnet werden.

Die hier beschriebene Methode wurde verwendet , die Doppelstrangbrüche in der VSG Ausdruck Website zu demonstrieren stieg die Zahl der Switcher in einer Population 8. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Population von Trypanosomen, die einen Doppelstrangbruch an der Expressionsstelle ähnlich induziert zu erzeugen wurden. Wir vergleichen diese Trypanosomen zu denen , die einen Doppelstrangbruch zu erzeugen , wurden nicht induziert. Abbildung 1 z...

Afrikanische Trypanosomen, die in vitro gezüchtet werden, durchlaufen eine geringe antigene Variation, so dass die Populationen aus Parasiten bestehen, die eine dominante Variante des Oberflächenglykoproteins (VSG)-Typs exprimieren, und einer kleinen Population von "geschalteten" Varianten. Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Populationen.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Trypanosomen, die ein bestimmtes variantspezifisches Oberflächenglykoprotein oder VSG exprimieren, von der übrigen Population zu isolieren, und Parasiten zu identifizieren, die vom anfänglich vorherrschenden VSG zu einem anderen VSG gewechselt haben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Trypanosomenbiologie zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren oder Ereignisse den VSG-Wechsel in einer Parasitenpopulation beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie schneller ist als zuvor veröffentlichte Methoden und eine einfache Quantifizierung von Zellen, die den Wechsel vollzogen haben, im Vergleich zu solchen, die keinen Wechsel durchlaufen haben, ermöglicht.Als das Labor anfing, an der antigenischen Variation zu arbeiten, bestand das erste Problem darin, seltene Wechsler nachzuweisen. Dieses Problem war in der Immunologie bereits vor einigen Jahren gelöst worden, und zwar durch die Verwendung der magnetisch aktivierten Zellsortierung, um Zellen anzureichern, die für ein bestimmtes Merkmal negativ waren. Die Übertragung dieses Nicht-Auswahlverfahrens auf die antigenische Variation schien eine vielversprechende Idee zu sein.Zunächst sollten Trypanosomen der Lister-427-Stamm-Binzform in einer Dichte von 0,5 bis 100.000 pro Milliliter kultiviert werden. Eine Probe mit 50 × 10⁶ Zellen in eine 15-Milliliter-Röhrchen abpipettieren und anschließend zentrifugieren. Eine Probe mit 1 × 10⁶ Zellen beiseitestellen und weiterkultivieren, um sie später als positive und negative Antikörperkontrollen zu verwenden.Entfernen Sie das meiste Überstand, wobei etwa 750 Mikroliter im Gefäß verbleiben. Überführen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen abschließend vier Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 2800 × g.Und dann pipettieren Sie den gesamten Überstand ab. Resuspendieren Sie die Zellen in 150 Mikroliter Kulturmedium unter Zusatz des primären Antikörpers gegen das varianten Oberflächenglykoprotein oder anti VSG in der geeigneten Verdünnung. Anschließend wirbeln Sie die Zellen bei vier Grad Celsius zehn Minuten lang im Vortex. Spülen Sie mit 800 bis 1000 Mikrolitern kaltem Kulturmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 5200 × g. Nach dem Absaugen des Überstandes waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Kulturmedium und zentrifugieren erneut.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 µL Kulturmedium. Geben Sie 110 µL magnetisch aktivierter Zellsortier-Mikroperlen des geeigneten Typs für den primären Antikörper hinzu. Mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und anschließendes Vortexen.Während die Zellen vortexiert werden, bereiten Sie eine magnetisch aktivierte Trennsäule vor. Stellen Sie ein 15-Milliliter-Röhrchen darunter, um das Spülmittel aufzufangen. Geben Sie zwei Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Säule zu spülen.Entfernen Sie anschließend die Probe vom Vortex und geben Sie 800 bis 1000 Mikroliter kaltes Kulturmedium hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie danach den Überstand, um nicht gebundene Antikörper zu eliminieren. Waschen Sie die Zellen im Pellet mit einem Milliliter Kulturmedium und zentrifugieren Sie erneut.Aspirieren Sie diesmal den Überstand, lassen jedoch 100 Mikroliter im Gefäß zurück. Schlagen Sie das Zentrifugenröhrchen kräftig, bis der Pellet vollständig resuspendiert ist. Geben Sie ein Milliliter Kulturmedium hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen vollständig zu resuspendieren.Entfernen Sie das 15-mm-Kegelrohr, das zum Sammeln des Primmediums verwendet wurde, und ersetzen Sie es durch ein neues 15-ml-Kegelrohr, um den Durchlauf zu sammeln, der die umgeschalteten Parasiten enthält. Geben Sie die Zellsuspension auf die vorgespülte Säule. Sammeln Sie den Durchlauf in einem 15-ml-Röhrchen darunter, wobei typischerweise sechs bis sieben Minuten für ein Milliliter Medium plus Trypanosomen benötigt werden.Als Nächstes waschen Sie die Säule zwei Mal mit je einem Milliliter Kulturmedium und sammeln Sie den Durchlauf in demselben Gefäß. Teilen Sie den Durchlauf, der insgesamt etwa drei Milliliter betragen sollte, auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Anschließend stellen Sie die Röhrchen auf Eis.Geben Sie drei Milliliter Kulturmedium auf die Säule und stellen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dadurch werden die Zellen gewonnen, die das ursprüngliche dominante VSG exprimieren. Entnehmen Sie 300 Mikroliter dieses eluierten Materials und bewahren Sie es auf Eis auf; der Rest kann verworfen werden.Um eine positive Kontrolle herzustellen, entnehmen Sie etwa 100.000 Zellen aus der Ausgangszellkultur und pipettieren Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies, um eine negative Kontrolle anzulegen. Zentrifugieren Sie die Durchlaufproben und die Probe der positiven Kontrolle.Entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die positiven Kontrollzellen in 100 Mikroliter Kulturmedium mit primärem, fluorophor-markiertem anti-VSG-Antikörper in der geeigneten Verdünnung. Resuspendieren Sie anschließend ein Durchfluss-Pellet in 100 Mikrolitern Kulturmedium mit primärem, fluorophor-markiertem anti-VSG-Antikörper in der geeigneten Verdünnung.Verwenden Sie die Suspension, um den Pellet in dem zweiten Durchflussschlauch erneut aufzusuchen, sodass ein einziger Poolschlauch entsteht. Gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Die Zellen kurz vortexen und anschließend 800 bis 1000 Mikroliter kaltes Kulturmedium hinzufügen.Zentrifugieren Sie die Proben vier Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 5200 × g und entfernen Sie danach den Überstand, um nicht gebundene Antikörper zu eliminieren. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Kulturmedium und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Die positiven und negativen Kontrollen sowie die zuvor auf Eis gelagerten eluierten Zellen.Verwerfen Sie den Überstand. Danach geben Sie 148,5 µL Kulturmedium zu den Proben hinzu. Fügen Sie anschließend 25 µL absolute Counting-Beads hinzu, gefolgt von 1,5 µL Propidiumiodid-Färbelösung.Die Pellets der positiven und negativen Kontrollen mit 175 Mikroliter Kulturmedium resuspendieren. Die Proben können nun am Durchflusszytometer gemessen werden. Diese Durchflusszytometrie-Diagramme zeigen die Ergebnisse der Zellseparation von Trypanosomenpopulationen, bei denen ein DNA-Doppelstrangbruch induziert wurde, im Vergleich zu nicht induzierten Zellen.Die linken Felder zeigen das Vorwärts- versus Seitenstreulicht, anhand dessen lebende von toten Zellen sowie die der Probe zugesetzten Beads unterschieden werden können. Anschließend können Gates erstellt werden, die diese Unterscheidung auf Grundlage der Streulichteigenschaften ermöglichen. Die rechten Felder zeigen ausschließlich die Zellen, die basierend auf den in den linken Feldern generierten Streulicht-Gates als lebend klassifiziert wurden. Der dominante Start-VSG war in diesem Fall VSG two. Zellen, die positiv für Propidium Iodide angefärbt sind, sind tote Zellen. Diese befinden sich in den Bereichen Q one und Q two des Diagramms.Zellen, die positiv für das dominante VSG und negativ für PI gefärbt sind, liegen im Bereich Q3 und gelten als Kontaminanten. Schließlich sind Zellen im Viertel Q4 lebende Zellen, die negativ für das dominante VSG färben und als Switcher betrachtet werden. Diese Darstellung zeigt die berechneten beobachteten Umschaltfrequenzen der Trypanosomen-Populationen mit im Vergleich zu ohne induzierte Brüche.Das Ausmaß des stochastchen Umschaltens in vitro ist ziemlich gering. Die Induktion eines Bruchs führt zwar zu signifikant mehr Zellen, die zum nicht-dominanten VSG wechseln. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa drei Stunden durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Proben stets kühl zu halten und die Pellets insbesondere vor der Isolierung an der Säule ausreichend aufzulösen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Sequenzierung verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche VSGs in einer Schalt-Population exprimiert werden. Diese Methode wird typischerweise zur Messung des VSG-Schaltens eingesetzt, kann aber auch zur Isolierung und Quantifizierung von Parasiten verwendet werden, die ein beliebiges Oberflächenprotein von Interesse exprimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Das Hinzufügen eines Tags zu einem Protein ist eine mächtige Möglichkeit, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Hunderte von Trypanosoma brucei-Proteinen parallel endogen zu markieren, so dass eine Markierung im Genommaßstab möglich ist.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Viren oder extrazelluläre Vesikel wurden mit 15 nm magnetischen Nanopartikeln immungefangen, die an Antikörper gekoppelt sind, die Oberflächenantigene erkennen. Die gefangenen Virionen oder Vesikel wurden mit fluoreszierenden Antikörpern gegen andere Oberflächenantigene markiert. Die resultierenden Komplexe wurden in einem hohen Magnetfeld getrennt und mit herkömmlichen Durchflusszytometern, die auf Fluoreszenz ausgelöst wurden, analysiert.

Fluss Virometry zur Analyse Antigenic Spektren von Virionen und extracellular Vesikeln

Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

Fine Needle Aspiration ist eine Technik, bei der Zellen aus einer Läsion oder einem Organ mit einer dünnen Nadel gewonnen werden. Aspiriertes Material wird verschmiert, gebeizt und unter dem Mikroskop zur Diagnose untersucht oder für molekularbiologische, Zytometrie oder In-vitro-Analyse verwendet. Es ist billig, einfach, schnell und verursacht minimale Traumata.

Nachweis von extravaskulären Trypanosoma Parasiten durch Feine Nadelaspiration

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Weltweit wurden medizinische Blutparasiten in einfachen Schritten auf einer Low-Code-KI-Plattform automatisch gescreent. Die prospektive Diagnose von Blutausstrichen wurde durch den Einsatz einer Objekterkennungs- und Klassifikationsmethode in einem hybriden Deep-Learning-Modell verbessert. Das Zusammenwirken von aktivem Monitoring und gut trainierten Modellen hilft, Hotspots der Trypanosomenübertragung zu identifizieren.

Überlegene automatische Identifizierung von Trypanosomenparasiten durch Verwendung eines hybriden Deep-Learning-Modells

Wir beschreiben eine Methode, um zu untersuchen, wie der pH-Wert auf Umweltreize in den Glykosomen der Blutkreislaufform afrikanischer Trypanosomen reagiert. Dieser Ansatz beinhaltet einen pH-sensitiven Sensor für vererbbare Proteine in Kombination mit Durchflusszytometrie zur Messung der pH-Dynamik, sowohl als Zeitverlaufsassay als auch in einem Hochdurchsatz-Screen-Format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Lernen Sie die Isolierung von Trypanosomen mit spezifischen VSGs durch Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Detektion seltener Switching-Varianten.

Nachweis von Trypanosoma brucei Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Nachweis von

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