Nachweis von Trypanosoma brucei Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Trypanosomen, die eine bestimmte Variante des Oberflächenglykoproteins oder VSG exprimieren, vom Rest der Population zu isolieren und Parasiten zu identifizieren, die vom anfänglich dominanten VSG zu einem anderen VSG gewechselt sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Trypanosomenbiologie zu beantworten, wie z.B. welche Faktoren oder Ereignisse das VSG-Switching in einer Population von Parasiten beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schneller ist als zuvor veröffentlichte Methoden und eine einfache Quantifizierung von Switch- zu Nicht-Switch-Zellen ermöglicht.

Als das Labor anfing, sich mit antigener Variation zu beschäftigen, bestand das erste Problem darin, wie man seltene Wechsler erkennen kann. Diese Art von Problem wurde in der Immunologie vor einigen Jahren tatsächlich gelöst, indem magnetisch aktivierte Zellsortierung verwendet wurde, um Zellen anzureichern, die für ein bestimmtes Merkmal negativ waren. Die Portierung des Nicht-Selektionsprozesses auf die antigene Variation schien eine wirklich vielversprechende Idee zu sein.

Zu Beginn sollten die Trypanosomen des Blutkreislauf-Stammes Lister 427 auf eine Dichte von 0,5 bis 100.000 pro Milliliter gezüchtet werden. Aliquotieren Sie eine 50 mal 10 zu der Probe mit sechs Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie dann. Sparen Sie einmal 10 zu den sechs Zellen und der Kultur, um sie später als positive und negative Antikörperkontrollen zu verwenden.

Pipettieren Sie den größten Teil des Überstands ab, so dass etwa 750 Mikroliter im Röhrchen verbleiben. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für vier Minuten bei 2800 mal g.

Und dann pipettieren Sie den gesamten Überstand ab. Resuspendieren Sie die Zellen in 150 Mikrolitern Kulturmedium plus primärem Anti-Varianten-Oberflächenglykoprotein-Antikörper oder Anti-VSG in der entsprechenden Verdünnung. Als nächstes wirbeln Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius vortexen.

Mit 800 bis 1000 Mikrolitern kaltem Nährmedium waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für vier Minuten bei 5200 mal g. Nach dem Aspirieren des Überstands werden die Zellen mit einem Milliliter Kulturmedium gewaschen und erneut zentrifugiert.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Nährmedium. Fügen Sie 110 Mikroliter magnetisch aktivierte Zellsortier-Mikrokügelchen des für den Primärantikörper geeigneten Typs hinzu. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und dann vortexen.

Während die Zellen wirbeln, stellen Sie eine magnetisch aktivierte Trennsäule auf. Legen Sie ein 15-Milliliter-Röhrchen darunter, um das Grundierungsmedium aufzufangen. Fügen Sie zwei Milliliter Nährmedium hinzu, um die Säule zu grundieren.

Nehmen Sie anschließend die Probe aus dem Vortex und fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter kaltes Kulturmedium hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie dann den Überstand, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen Sie die pelletierten Zellen mit einem Milliliter Nährmedium und zentrifugieren Sie erneut.

Diesmal den Überstand ansaugen, aber 100 Mikroliter im Rohr lassen. Bewegen Sie das Zentrifugenröhrchen kräftig, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Fügen Sie einen Milliliter Nährmedium hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen vollständig zu resuspendieren.

Entfernen Sie das konische 15-Millimeter-Rohr, mit dem das Ansaugmedium aufgefangen wurde, und ersetzen Sie es durch ein neues konisches 15-Milliliter-Rohr, um den Durchfluss mit den geschalteten Parasiten aufzufangen. Tragen Sie die Zellsuspension auf die grundierte Säule auf. Sammeln Sie den Durchfluss in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das normalerweise sechs bis sieben Minuten für einen Milliliter Medium plus Trypanosomen benötigt.

Waschen Sie anschließend die Säule zweimal mit einem Milliliter Nährmedium und sammeln Sie den Durchfluss im selben Röhrchen. Teilen Sie den Durchfluss, der insgesamt etwa drei Milliliter betragen sollte, auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Legen Sie dann die Röhren auf Eis.

Geben Sie drei Milliliter Nährmedium in die Säule und tauchen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dadurch erhalten Sie die Zellen, die das dominante Ausgangs-VSG exprimieren. Entfernen Sie 300 Mikroliter dieses eluierten Materials und bewahren Sie es auf Eis auf, der Rest kann entsorgt werden.

Um eine Positivkontrolle zu erzeugen, nehmen Sie etwa 100.000 Zellen aus der Ausgangskultur der Zellen und pipettieren Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine Negativkontrolle zu erstellen. Die Durchflussproben und die Positivkontrollprobe werden zentrifugiert.

Und dann entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Die positiven Kontrollzellen werden in 100 Mikrolitern Kulturmedium mit primärem Fluorophor-markiertem Anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung resuspendiert. Als nächstes resuspendieren Sie ein Durchflusspellet in 100 Mikrolitern Kulturmedium mit primärem Fluorophor-markiertem Anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung.

Verwenden Sie die Suspension, um das Pellet im zweiten Durchflussrohr wieder zu suspendieren, wodurch ein Poolrohr entsteht. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Wirbeln Sie die Zellen vor und fügen Sie dann 800 bis 1000 Mikroliter kaltes Kulturmedium hinzu.

Die Proben werden vier Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5200 mal g zentrifugiert und dann der Überstand verworfen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Kulturmedium und zentrifugieren Sie die Zellen dann. Die Positiv- und Negativkontrolle und die eluierten Zellen wurden zuvor auf Eis gelagert.

Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie danach 148,5 Mikroliter Nährmedium zu den Proben. Fügen Sie als nächstes 25 Mikroliter absolute Zählperlen hinzu, gefolgt von 1,5 Mikrolitern Propidiumiodid-Färbelösung.

Die Positiv- und Negativkontrollpellets werden mit 175 Mikrolitern Nährmedium resuspendiert. Proben können nun auf dem Durchflusszytometer durchgeführt werden. Diese Durchflusszytometrie-Diagramme zeigen die Ergebnisse der Zelltrennung aus Populationen von Trypanosomen, die induziert wurden, um einen Doppelstrang-DNA-Bruch im Vergleich zu nicht induzierten Zellen zu erzeugen.

Die linken Felder zeigen die Vorwärts- und Seitenstreuung, was eine Aufklärung der lebenden und toten Zellen und Kügelchen ermöglicht, die der Probe hinzugefügt wurden. Anschließend können Gates generiert werden, die diese anhand der Streucharakteristik bestimmen. In den rechten Feldern werden nur die Zellen angezeigt, die auf der Grundlage der in den linken Feldern generierten Scatter-Gates als aktiv klassifiziert werden können.

Das dominierende Start-VSG war in diesem Fall VSG zwei. Zellen, die sich positiv auf Propidiumiodid färben, sind tote Zellen. Und diese sind in den Bereichen Q eins und Q zwei des Diagramms zu sehen.

Zellen, die positiv für das dominante VSG und negativ für PI gefärbt sind, fallen in die Q-3-Region und sind Kontaminanten. Schließlich sind Zellen in Q vier lebende Zellen, die negativ für das dominante VSG färben und als Switcher gelten. Dieses Diagramm zeigt die berechneten beobachteten Schaltfrequenzen der Trypanosomen-Populationen mit versus ohne induzierte Brüche.

Das Niveau des stochastischen Schaltens in vitro ist relativ gering. Während die Induktion eines Bruchs zu signifikant mehr Zellen führt, wird auf das nicht-dominante VSG umgeschaltet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Proben durchgehend kalt zu halten und die Pellets angemessen zu resuspendieren, insbesondere vor der Isolierung auf der Säule. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Sequenzierung verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche VSGs in einer Switch-Population exprimiert werden. Diese Methode wird typischerweise zur Messung des VSG-Schaltens verwendet, sie kann auch für die Isolierung und Quantifizierung von Parasiten verwendet werden, die ein beliebiges Oberflächenprotein von Interesse exprimieren.