Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, den Import von kernkodierten Proteinen in Chloroplasten zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf den Auswirkungen von Stress liegt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Chloroplasten zu beantworten, z. B. wie der Import von Chloroplastenproteinen reguliert wird. Ein besonderer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Auswirkungen von Stress auf den Import von Chloroplastenproteinen zu bewerten.

Obwohl diese Methode für die Verwendung mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana entwickelt wurde, könnte sie modifiziert und für die Verwendung mit anderen Systemen, wie z.B. Kulturpflanzen, angepasst werden. Das Verfahren wird von Qihua Ling, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn züchten Sie zunächst die Arabidopsis-Pflanzen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Dann, wenn die Pflanzen acht Tage alt sind, führe eine Stressbehandlung durch. Kratzen Sie die Pflanzen vorsichtig von Hand von der Agarplatte ab und legen Sie sie in einen sterilisierten Kolben mit flüssigem MS-Medium, das den Stressor enthält. Je nach Art des Versuchs kann es auch erforderlich sein, zusätzliche Pflanzen ohne Stressor als Kontrolle in einen ähnlichen Kolben zu setzen.

Decken Sie die Öffnung der Kolben mit sterilisierter Folie ab und lassen Sie die Pflanzen weitere zwei Tage auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln wachsen. Bereiten Sie einen kontinuierlichen Dichtegradienten vor, indem Sie zuerst 13 Milliliter Percoll, 13 Milliliter zwei x Chloroplasten-Isolationspuffer und fünf Milligramm Glutathion in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mischen. Dann zentrifugieren Sie die Mischung.

Behandeln Sie das Röhrchen nach dem Zentrifugieren vorsichtig, um den Gradienten nicht zu stören, und bewahren Sie es für die spätere Verwendung auf Eis auf. Übertragen Sie als Nächstes 100 Milliliter Chloroplasten-Isolationspuffer pro Bedingung in ein Ein-Liter-Becherglas. Nehmen Sie die Sämlinge aus dem flüssigen Medium, indem Sie sie in ein Sieb kippen.

Geben Sie sie dann in das Becherglas mit dem Chloroplasten-Isolationspuffer. Spülen Sie das Gewebe mit dem Puffer ab, um eventuelles Restmedium zu entfernen, und ersetzen Sie dann den Puffer durch 100 Milliliter frischen Isolationspuffer. Für die erste Runde der Homogenisierung das Pflanzengewebe von Hand in ein 50-Milliliter-Becherglas geben, so dass der vorherige Puffer durch die Finger abtropfen kann.

Anschließend setzen Sie die Sonde des Gewebehomogenisators in das Gewebe ein und homogenisieren mit zwei Impulsen von jeweils ein bis zwei Sekunden. Filtrieren Sie das Homogenat durch zwei Schichten Filtertuch in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zum Schluss drücke du das Tuch vorsichtig zusammen.

Das Filtrat zurückhalten und das Pflanzengewebe zurück in das 50-Milliliter-Becherglas übertragen. Geben Sie dann einen zweiten 20-Milliliter-Chloroplasten-Isolationspuffer in das 50-Milliliter-Becherglas und fügen Sie das restliche Gewebe hinzu, das in der ersten Homogenisierungsrunde nicht verwendet wurde. Wiederholen Sie die Homogenisierungs- und Filtrationsschritte noch viermal.

Zentrifugieren Sie das gepoolte Homogenat bei 1.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den Überstand unmittelbar nach dem Zentrifugieren ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Stellen Sie das Rohr auf Eis und suspendieren Sie das Pellet wieder im Restüberstand, indem Sie das Rohr vorsichtig umrühren.

Verwenden Sie anschließend eine Pasteurpipette, um das Homogenat vorsichtig über die Wand des Aufnahmeröhrchens auf die Oberseite des vorgefertigten kontinuierlichen Dichtegradienten zu übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Probe und den Gradienten in einem schwingenden Schaufelrotor bei 7.800 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius bei ausgeschalteter Bremse. Wenn Sie fertig sind, beachten Sie die beiden grünen Bänder, die im Farbverlauf zu sehen sind.

Entsorgen Sie die obere Bande, die gebrochene Chloroplasten enthält, und übertragen Sie mit einer Pasteurpipette die untere Bande mit intakten Chloroplasten in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie als Nächstes 25 Milliliter HMS-Puffer in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen zweimal um, um das Percoll von den Chloroplasten zu waschen. Setzen Sie dann das Rohr wieder in den schwingenden Schaufelrotor ein und pelletieren Sie die Chloroplasten erneut.

Gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Pellet wieder im Restpuffer, indem Sie das Rohr vorsichtig auf Eis bewegen. Fügen Sie bei Bedarf weitere 100 bis 300 Mikroliter des HMS-Puffers hinzu, aber versuchen Sie, die Probe nicht zu stark zu verdünnen. Lagern Sie die resuspendierten Chloroplasten auf Eis.

Beginnen Sie mit der Zugabe von fünf Mikrolitern der isolierten Chloroplasten zu 495 Mikrolitern HMS-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen um, um die Lösung vorsichtig zu mischen. Stellen Sie dann ein Deckglas auf die Zählkammer eines Hämazytometers.

Pipettieren Sie langsam 40 bis 60 Mikroliter der verdünnten Chloroplastensuspension in den Spalt zwischen dem Deckglas und der Zählkammer. Mit einem Phasenkontrastmikroskop die Chloroplasten mit einem 20-fach-Objektiv abbilden. Intakte Chloroplasten wirken rund und hell und sind von einem Lichtkranz umgeben.

Dann verwenden Sie das 10-fache Objektiv auf die Anzahl der Chloroplasten in 10 großen Quadraten. Die Anzahl der Chloroplasten pro großem Quadrat sollte im Durchschnitt zwischen 10 und 30 liegen. Wenn zu wenige oder zu viele Chloroplasten vorhanden sind, passen Sie den Verdünnungsfaktor an und wiederholen Sie den Vorgang.

Sobald Sie sich im richtigen Bereich befinden, berechnen Sie die Anzahl der Chloroplasten pro Milliliter, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Um einen Zeitverlauf mit drei Zeitpunkten durchzuführen, bereiten Sie drei Röhrchen vor, die jeweils ein 130-Mikroliter-Aliquot Importstopppuffer enthalten, und lassen Sie sie auf Eis. In einem Zwei-Milliliter-Röhrchen wird die Importreaktion vorbereitet, die den Reaktionspuffer und das radioaktiv markierte Vorläuferprotein enthält.

Beachten Sie, dass es für jede zu testende Bedingung eine Reaktion geben sollte. Verwenden Sie ca. 10 Millionen Chloroplasten pro Zeitpunkt. Inkubieren Sie das Reaktionsgefäß bei 25 Grad Celsius in einem Wasserbad unter begrenzter Lichtmenge.

Schnippen Sie gelegentlich mit den Röhren, um die Chloroplasten wieder zu suspendieren. Es wird ein Zeitverlauf durchgeführt, bei dem 130 Milliliter Aliquots aus der Reaktion zu den erforderlichen Zeitpunkten innerhalb des linearen Importbereichs liegen. Unmittelbar nach der Entnahme werden jeweils 130 Mikroliter Aliquot in ein Röhrchen mit eiskaltem Importstopppuffer überführt, das durch leichtes Klopfen auf das Röhrchen gemischt wird, und die Röhrchen bis zum Abschluss des Zeitverlaufs auf Eis legen.

Sobald die letzte Probe entnommen wurde, zentrifugieren Sie alle Proben 30 Sekunden lang bei 12.000 g in einer Mikrofuge. Als nächstes verwerfen Sie die Überstände und resuspendieren die Pellets in 15 Mikrolitern mit zwei x Proteinladepuffer. Anschließend werden die Proben durch Vortexen gemischt.

Analysieren Sie schließlich alle Proben sowie eine Vorläufer-Eingabesteuerung mit Standard-SDS-PAGE und Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphorbildgebung. PsaD ist eine 18-Kilodalton-Komponente des Photosystems I, die als größerer Vorläufer von 23 Kilodalton synthetisiert wird. Die Verarbeitung zur reifen 18-Kilodalton-Form deutet darauf hin, dass ein Import in die Chloroplasten stattgefunden hat.

Die hier untersuchte sp1-Mutante von Arabidopsis trägt einen Defekt in einem wichtigen Regulator der Importmaschinerie des Chloroplastenproteins, dem sp1-Protein. Unter Stressbedingungen ist die Menge an PsaD-Proteinimporten in sp1-mutierte Chloroplasten im Vergleich zum Wildtyp erhöht, jedoch nicht unter normalen nicht-stressigen Bedingungen. Während die reife Proteinform von PsaD zeitabhängig mit Chloroplasten beider Pflanzengenotypen akkumulierte, war die Importrate für sp1-mutierte Chloroplasten signifikant höher als für Wildtyp-Chloroplasten.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das sp1-Protein eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Chloroplastenproteinimports unter Stressbedingungen spielt. Einmal gemeistert, kann diese Methode von der Chloroplastenisolierung bis zum Abschluss des Import-Assays in fünf bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Chloroplasten-Isolationsschritte bei vier Grad Celsius durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Chloroplasten ihre maximale Aktivität beibehalten.

Nach seiner anfänglichen Entwicklung vor mehreren Jahrzehnten ebnete der In-vitro-Chloroplasten-Proteinimport-Assay den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, viele verschiedene Aspekte des Chloroplasten-Protein-Importmechanismus zu erforschen. Die hier vorgestellte Verfeinerung ermöglicht es, die Auswirkungen von Stressbedingungen auf den Proteinimport zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktivem Material besondere Sorgfalt erfordert.

Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und einer Schutzbrille sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.