Eine schnelle und effiziente Erzeugung von rekombinanten humanen pluripotenten Stammzellen durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch in der AAVS1 Locus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle und effiziente gezielte Genom-Editierung in der AAVS1 von humanen pluripotenten Stammzellen oder menschlichen PSCs unter Verwendung eines Flippase-Ansatzes (Recombinase-mediated Cassette Exchange) oder RMCE durchzuführen. RMCE verbessert die Zielinsertion einer Sequenz in den AAVS1-Locus, was für die Stammzellbiologie von großer Bedeutung ist, da es eine schnelle Überprüfung der Funktion eines Moleküls durch Überexpression oder Knockdown ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass humane PSC-Linien frei von zufälligen Integrationsereignissen sind, immer noch pluripotent sind und normale Karyotypen in nur 15 Tagen erzeugt werden können.

Diese Methode stellt ein nützliches Werkzeug für die Transgenese im AAVS1-Locus dar, kann aber auch auf andere humane permissive Loci angewendet werden. Zu Beginn werden humane PSC-Masterzelllinien unter Standardverfahren an oder außerhalb von inaktivierten embryonalen Maus-Fybroblasten oder iMEFs in sechs Well-Platten kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenzplatte von 60 % bis 70 % erreichen, verwenden Sie zunächst 0,1 %ige Gelatinelösung, um die erforderlichen Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu beschichten, und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Plattieren Sie dann 125.000 iDR4s pro Vertiefung und inkubieren Sie die Kulturen über Nacht mit iMEF-Medium. Am folgenden Tag werden humane PSC-Kulturen eine Stunde lang mit frischem Medium einschließlich 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren bei 37 Grad Celsius vorinkubiert. In der Zwischenzeit humane ESC-Transfektionslösung und das Zelldissoziationsmittel auf Raumtemperatur bringen.

Bereiten Sie einen Milliliter Nukleofektions-Beschichtungsmedium pro Nukleofektionsbedingung vor. Entfernen Sie dann das iDR4-Medium aus den Vertiefungen, verwenden Sie einen Milliliter PBS bei Raumtemperatur, um die Zellen zu waschen, und fügen Sie Nukleofektions-Beschichtungsmedium hinzu. 500 Mikroliter Beschichtungsmedium pro Probe in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und bis zur Beschichtung bei 37 Grad Celsius lagern.

Um die humanen PSCs in einer Einzelzellsuspension abzulösen, entfernen Sie das Medium, verwenden Sie PBS bei Raumtemperatur, um die Zellen zu waschen, und fügen Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin oder Accutase auf Feeder- bzw. Feeder-freie hPSC-Kulturen hinzu. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie anschließend die Platte vorsichtig aus dem Inkubator und aspirieren Sie, ohne dass sich die Zellen ablösen können, das Dissoziationsmittel und fügen Sie 1 Milliliter humanes PSC-Medium hinzu.

Dissoziieren Sie die losen Zellen durch sanftes Spülen des Mediums auf der Plattenoberfläche und vermeiden Sie gleichzeitig die Bildung von Schaum. Sammeln Sie die Zellen in einer Einzelzellsuspension in einem sauberen und sterilen 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie dann 1 Milliliter hESC-Medium, um die Zellen zu waschen und im selben Röhrchen zu sammeln.

Nehmen Sie ein 50-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension zur Zählung und zentrifugieren Sie die restlichen Zellen bei 300 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzählgerät, während die Suspension zentrifugiert wird. Entfernen Sie das Übergewicht und verwenden Sie PBS bei Raumtemperatur, um die Zellfarbe sanft auf 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter zu resuspendieren.

Übertragen Sie dann zwei Milliliter pro Versuchsbedingung, um sterile 15-Milliliter-Röhrchen zu reinigen, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Während sich die Proben drehen, bereiten Sie Plasmidmischungen in drei sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Molekülverhältnis von 0:1, 2:1 und 2:0 mit 2,5 Mikrogramm Flippase-Plasmid vor. Um mit der Nukleofektion fortzufahren, nehmen Sie die iDR4-Platte und das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Plattierungsmedium aus dem Inkubator.

Pipettieren Sie das PBS vorsichtig ein Röhrchen nach dem anderen ab, ohne das Pellet zu stören, und entfernen Sie so viel Puffer wie möglich. Verwenden Sie 100 Mikroliter Transfektionslösung, um das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren wieder zu resuspendieren. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den Plasmidmischungen und mischen Sie vorsichtig.

Übertragen Sie die Zell-DNA-Mischung auf die Transfector-Küvette und achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Setzen Sie die Küvette in die Nukleofektorvorrichtung ein und führen Sie das Programm A13 für Zellen, die auf Feedern kultiviert werden, oder F16 für die Feeder-freie Transfektion aus. Nehmen Sie die Küvette heraus und geben Sie mit den Einweg-Transferpipetten im Kit 0,5 Milliliter Beschichtungsmedium sanft, aber schnell und in einer Bewegung in die Küvette ein.

Rekuperieren Sie dann das Volumen auf die gleiche Weise und plattieren Sie es tropfenweise in der 12-Well-Platte, die das iDR4 und das Beschichtungsmedium enthält. Stellen Sie die Kulturschale auf ein Regal im Inkubator und bewegen Sie sie langsam hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellsuspension gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Schale 24 Stunden lang, bevor Sie das Medium wechseln.

Beginnen Sie zwei bis drei Tage nach der Transfektion mit der Auswahl. Aspirieren Sie das Medium, verwenden Sie 1 Milliliter PBS, um die Zellen zu waschen, und fügen Sie dann humanes ESC-Medium mit 100 Nanogramm pro Milliliter Puromycin hinzu. Beobachten Sie das Zellwachstum und erhöhen Sie die Puromycin-Konzentration entsprechend auf maximal 250 Nanogramm pro Milliliter, wobei Sie die Puromycin-Selektion sieben Tage lang fortsetzen.

Beginnen Sie nach drei bis vier Tagen mit der Puromycin-Selektion die Selektion mit 0,5 Mikromolaren Fialuridin oder FIAU. Wechseln Sie das Medium täglich und behalten Sie die FIAU nicht länger als sieben ununterbrochene Tage bei. Nach Abschluss der Selektion, etwa an den Tagen 14 bis 15, werden resistente RMCE-Kolonien vorhanden sein, die die neue RMCE-Linie bilden.

Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 nach Standardverfahren. Wenn die Vertiefungen von Schlüssel 1 zum Teilen bereit sind, dissoziieren Sie die Vertiefung für die Charakterisierung in eine Einzelzellsuspension, wie weiter oben im Video beschrieben, und sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die Zellen bei 300 mal g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang herunter.

Verwenden Sie dann einen Milliliter PBS, um die Zellen zu resuspendieren, und teilen Sie die Probe in zwei Teile. Einer wird mit einem Zellsieb filtriert, um die Durchflusszytometrie durchzuführen, und der andere für die DNA-Analyse gemäß dem Textprotokoll. Nach der Transfektion mit der Flippase-Rekombinase und dem tdT RMCE-Donor bildeten die hPS-Zellen kleine Zellgruppen, die gleichmäßig über die iDR4-MEF-Schicht verteilt waren, und exprimierten konstitutives GFP und transientes tdT.

Die positive Selektion mit Puromycin begünstigt die RMCE-Donorinsertion, während die negative Selektion mit FIAU nur FRT-vermittelte Rekombinationsereignisse ohne TK selektiert. Etwa am sechsten Tag nach der Transfektion können kleine Cluster von RMCE GFP-negativen, tdT-positiven Zellen identifiziert werden. Wie hier gezeigt, sind GFP-negative, tdT-positive RMCE-Kolonien nur dann vorhanden, wenn sowohl RMCE-Donor als auch Flippase verwendet werden, während RMCE in Abwesenheit von Flippase nicht auftritt. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der neu generierten RMCE-Linien, d. h. der Puromycin- und FIAU-resistenten RMCE-Kolonien, kombiniert in einer nicht-klonalen Zellpopulation, bestätigt, dass 100% der Zellen den RMCE GFP-negativen, tdT-positiven Phänotyp repräsentieren.

Wenn RMCE-Donatoren ohne Recorder-Aktivität in hPSC verwendet werden, sind 100% der Zellen GFP-negativ. Die hier gezeigte PCR-Charakterisierung der nicht-klonalen RMCE-Linie zeigt den vollständigen Kassettenaustausch und dass das verwendete Auswahlprogramm zufällige integrationsfreie Linien sowohl des RMCE-Donors als auch des Flippase-exprimierenden Vektors erzeugt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese RMCE-Methode die Geneditierung in hPSCs für einen definierten Locus im Vergleich zu gezielten Nukleasen erheblich vereinfacht.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Tagen abgeschlossen werden. Daher ist RMCE ein sehr schnelles Gen-Editing-Tool, das vergleichende Studien in einem isogenen Umfeld ermöglicht. Bei der Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine Transfektionseffizienz von mehr als 30 % zu erreichen und ein geeignetes Mittel zur Auswahl des Kernspeichers herzustellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RMCE im AAVS1-Locus von menschlichen PSCs durchgeführt und wie die rekombinate Linie charakterisiert wird.