Name: Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung antigen-spezifischer regulatorischer T-Zellen aus iPSCs für die Immuntherapie bei Autoimmunarthritis. Diese Technik liefert einheitliche Zellpopulationen für gezielte Behandlungsansätze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Projekt wurde finanziert, zum Teil unter Zuschüsse aus den National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 und K18CA151798), der American Diabetes Association (1-16-IBS-281) und der Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) zu JS

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Protokoll ist ein kritischer Schritt der in vitro Differenzierung von TCR / FoxP3 - Gen-Transduktion iPSCs. In vitro Notch - Signalweg induziert Entwicklung in Richtung der T - Zell - Abstammungslinie. Um iPSCs in CD4 + FoxP3 + Tregs unterscheiden, haben wir die OP9-DL1 / DL4 / IA b - Zellen, die hoch express MHC II (IA b) Moleküle. Die meisten der iPSCs differenzieren sich in CD4 + -Zellen. Doch nach der Oberfläche TCR-Expression, verlie...

Autoimmunarthritis ist eine systemische Erkrankung, die durch eine Hyperplasie des Synovialgewebes und eine fortschreitende Zerstörung von Gelenkknorpel, Knochen und Bändern gekennzeichnetist 1. Die fehlerhafte Erzeugung oder Funktion von Tregs bei Autoimmunarthritis trägt zu chronischen Entzündungen und Gewebeverletzungen bei, da Tregs eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der Entwicklung autoreaktiver Immunzellen spielen. 
Manipulation von Tregs ist eine ideale Strategie für die Entwicklung von Therapien zur Unterdrückung von Entzündungen in Ag-abhängiger Weise. Bei der Treg-basierten Immuntherapie ist die Spezifität der übertragenen Tregs wichtig für die Behandlung der anhaltenden Autoimmunität2. Um die suppressive Aktivität zu zeigen, müssen Tregs wandern und in der betroffenen Region gehalten werden, was durch die Spezifität des TCR für das Ag an diesem Ort gesteuert werden kann3. Obwohl polyklonale Tregs eine kleine Population enthalten können, die diese Ag-Spezifität aus ihren TCRs enthält, ist die Anzahl dieser Ag-spezifischen Tregs in der Regel gering. Folglich erfordern zellbasierte Therapien mit polyklonalen Tregs gegen Autoimmunerkrankungen einen adoptiven Transfer einer großen Anzahl von Tregs4,5. Da pluripotente Stammzellen (PSCs) die Fähigkeit haben, sich zu jeder Art von Zelle zu entwickeln, könnten sich Ag-spezifische PSC-Tregs als gute Kandidaten für eine Treg-basierte Immuntherapie erweisen. Frühere Studien haben die erfolgreiche Entwicklung von PSC-abgeleiteten T-Zellen gezeigt, einschließlich der Tregs6-8. 
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Entwicklung von Ag-spezifischen iPSC-Tregs. Des Weiteren beschreiben wir eine zellbasierte Therapie der Autoimmunarthritis in einem Mausmodell unter Verwendung solcher Tregs. Diese Methode basiert auf der genetischen Modifikation von murinen iPSCs mit Ag-spezifischen TCRs und dem Transkriptionsfaktor FoxP3. Die manipulierten iPSCs differenzieren sich dann in Ag-spezifische Tregs auf den OP9-Stromazellen, die die Notch-Liganden DL1, DL4 und MHC-II (I-Ab) Moleküle in Gegenwart der Zytokine mFlt3L und mIL-7 exprimieren. Diese Ag-spezifischen iPSC-Tregs können suppressive Zytokine wie TGF-β und IL-10 produzieren, wenn sie mit dem Ag stimuliert werden, und der adoptive Transfer solcher Tregs hat die Fähigkeit, die AIA-Entwicklung in einem Mausmodell zu unterdrücken. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um aus Stammzellen gewonnene Ag-spezifische Tregs für potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (2C11) Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Integrierte Wissenschaft</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Puffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Vorsicht: Allergen, krebserregend, toxisch</td></tr><tr><td>Permeabilisierungspuffer</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Eialbumin</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Rückhaltesystem</td><td>Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung von stammzellen abgeleiteten antigen-spezifische regulatorische t-zellen gegen autoimmunität

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmunerkrankungen entstehen aufgrund der Verlust der immunologischen Selbsttoleranz. Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind wichtige Vermittler von immunologischer Selbsttoleranz. Tregs repräsentieren etwa 5 - 10% der reifen CD4 + T - Zell - Subpopulation bei Mäusen und Menschen, mit etwa 1 bis 2% der Tregs im peripheren Blut zirkulieren. Induzierte pluripotenter Stammzellen (iPS) in funktionelle Treg unterschieden werden, die ein Potential für zellbasierte Therapie von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode Antigen (Ag) -spezifische Tregs von iPS - Zellen zu entwickeln (dh iPS-Tregs). Das Verfahren basiert auf den Transkriptionsfaktor FoxP3 enthält und eine Ag-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) in iPSCs und dann Notch Differenzierung auf Zellen OP9 Stromazellen exprimieren Liganden delta-like (DL) 1 und DL4. Folgende in vitro Differenzierung exprimieren die iPSC-Treg CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 und Ag-spezifischen TCR und können Ag - Stimulation reagiert.Diese Methode wurde zur zellbasierte Therapie von Autoimmun Arthritis in einem Mausmodell erfolgreich angewendet. Adoptive Übertragung dieser Ag-spezifischen iPSC-Treg in Ag-induzierten Arthritis (AIA) -haltigen Mäusen hat die Fähigkeit, Gelenkentzündung und Schwellungen zu reduzieren und Knochenverlust zu verhindern.

Wie hier gezeigt, am Tag 28, Ag-spezifischen Treg ausgedrückt wesentlichen CD3 und Ag-spezifischen TCR, zwei T-Zell-Marker. Die CD3 + TCRVβ5 + Bevölkerung ausgedrückt CD4. Die meisten der CD3 + TCRVβ5 + CD4 + Zellen auch CD25, CD127 exprimiert und CTLA-4, die in erhöhten Mengen exprimiert werden , typischerweise in natürlich T regs (nTregs) und in T - Zellen exprimieren FoxP3 ektopisch auftritt. Foxp3 - Expression in iPSC ...

Wir stellen hier eine Methode zur Entwicklung von funktionellen Antigen (Ag)-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) für die Immuntherapie von Autoimmunarthritis in einem Mausmodell vor.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine neue Methode zur Erzeugung aus Stammzellen abgeleiteter, entzündeten Gelenken assoziierter regulatorischer T-Zellen für die Immuntherapie bei autoimmuner Arthritis zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Autoimmunität bezüglich potenzieller Immuntherapeutika für die autoimmune Arthritis zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die aus Stammzellen abgeleiteten regulatorischen T-Zellen typisiert und von einem einzigen Zelltyp sind.Beginnen Sie damit, die interessierenden Fütterungszellen auf eine Mindestdichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Quadratzentimeter in OP9-Medium zu verdünnen und 1 × 10⁶ Fütterungszellen pro 10-Zentimeter-Platte zu impfen. Wenn die Zellen 80 bis 90 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium aus den Kulturen und säen Sie 0,5 bis 1 × 10⁵ retroviral transduzierte induzierbare pluripotente Stammzellen oder IPSCs in OP9-Medium in jede Platte aus. Fünf Tage später saugen Sie das Medium ab und waschen die Zellen mit 10 mL PBS.Anschließend lösen Sie die Zellen mit vier Milliliter Trypsin pro Platte bei 37 Grad Celsius ab. Stoppen Sie die Reaktionen nach 10 Minuten mit acht Milliliter IPSC-Medium und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem IPSC-Medium und säen Sie die Zellen erneut auf neuen 10-Zentimeter-Platten aus.Lassen Sie die Fütterungszellen 30 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator an die Platte anhaften. Sammeln Sie anschließend die schwebenden iPSCs und filtrieren Sie die transduzierten Zellen zur Zellzählung durch einen 70-Mikron-Filter. Säen Sie fünfmal 10 hoch 5 iPSCs in OP9-Medium, ergänzt mit murinem Flt3-Ligand, auf eine frische Platte mit 80 bis 90 % konfluenten Fütterungszellen aus und stellen Sie die Kulturen wieder in den Inkubator.Nach drei Tagen die Platte mit dem Kulturmedium mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette waschen. Anschließend fünf Milliliter frisches OP9-Medium zur Platte geben und alle halbadhärenten iPS-Zellen vorsichtig durch kräftiges, aber behutsames Pipettieren abwaschen, wobei die Feeder-Zellschicht nicht gestört werden darf. Den Vorgang mit 10 Millilitern PBS wiederholen, um die restlichen halbadhärenten Zellen zu gewinnen, und die Waschansätze jeder Platte in einem jeweils pro Kultur vorgesehenen kegelförmigen Reagenzglas sammeln.Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, resuspendieren Sie die Pellets in 10 Milliliter OP9-Medium, das mit murinem Flt3-Ligand und IL-7 ergänzt wurde, und filtrieren Sie die Zellen durch einen 70-Mikrometer-Filter. Säen Sie eine iPS-Zellkultur pro Vertiefung in eine sechswellige Kulturplatte aus, die eine mit 80 bis 90 % konfluenten Fütterungszellen bedeckte Monoschicht enthält, und stellen Sie die Kokulturen zurück in den Inkubator. Alle zwei Tage ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches OP9-Medium, das mit murinem Flt3-Ligand und IL-7 ergänzt wurde, und alle vier bis sechs Tage säen Sie die differenzierenden iPS-Zellen bei Bedarf auf neue Platten mit einer frischen Schicht von Fütterungszellen um.Beginnen Sie damit, die gewünschten Zellkulturen mit Trypsin zu lösen und jede Zellart in 10 Milliliter frischem Medium erneut aufzuschwemmen. Impfen Sie jede Zellkultur in eine neue 10-Zentimeter-Schale aus und lassen Sie die Fütterungszellen im Zellkulturgehäuse anhaften. Nach 30 Minuten sammeln Sie die schwimmenden iPS-Zellen ein und passieren die Kulturen einzeln durch 70-Mikrometer-Zellsiebe, um die Zellklumpen zur Zellzählung zu entfernen.Resuspendieren Sie jede Kultur in kaltem PBS mit einer Konzentration von 1,5 × 10⁷ Zellen pro Milliliter, gegebenenfalls erneut filtrierend. Stellen Sie dann nacheinander weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von vier bis sechs Wochen in eine Haltevorrichtung für Kleintiere und übertragen Sie adoptiv 200 µl einer Zelltyp-Suspension pro Maus in die Schwanzvene jedes Tieres. Messen Sie mit einem Messschieber die Schwellung beider Kniegelenke, um die Basislinienmessung zu erhalten.10 Tage nach der Zellübertragung injizieren Sie den Mäusen mit einer Ein-Milliliter-Spritze 100 Mikrogramm methyliertes BSA, emulgiert in komplettem Freund-Adjuvans, an der Basis des Schwanzes jedes Versuchstieres. 17 Tage nach der Zellübertragung induzieren Sie Arthritis durch intraartikuläre Injektion von 20 Mikrogramm methyliertem BSA in 10 Mikroliter PBS in das linke Kniegelenk sowie von 20 Mikrogramm methyliertem BSA und 100 Mikrogramm vollständigem Ovalbumin in 10 Mikroliter PBS in das rechte Kniegelenk jedes adoptiv übertragenen, anästhesierten Tieres. Sieben Tage nach der Arthrisinduktion messen Sie die Knie erneut, um die prozentuale Zunahme des Kniedurchmessers zu berechnen, und entfernen die Patellen chirurgisch.Fixieren Sie die Gelenke in Formalin. Danach werden die Knie nach einer Entkalkung in EDTA in Paraffin eingebettet und Vier-Mikrometer-Schnitte für die histochemische Färbung und Analyse gewonnen. Am Tag 28 exprimieren die antigenspezifischen T-regulatorischen Zellen beträchtliche Mengen an CD3 und antigenspezifischen T-Zell-Rezeptoren.Die meisten dieser Zellen exprimieren außerdem CD25, CD127 und CTLA-4, die typischerweise in natürlichen regulatorischen T-Zellen auf erhöhtem Niveau exprimiert werden. Tatsächlich bleibt FoxP3 in aus IPSCs abgeleiteten regulatorischen T-Zellen auch nach langfristiger In-vitro-Stimulation mit dem Notch-Liganden erhalten, wie durch intrazelluläre Färbung nachgewiesen wurde. Zusätzlich produzieren diese antigenspezifischen IPSC-regulatorischen T-Zellen unterdrückende Zytokine, wenn sie in vitro mit antigenbeladenen Milzzellen stimuliert werden, was auf ein potenzielles suppressives Phänotyp dieser Zellen hindeutet.FoxP3-positive Zellen werden in OVA-behandelten Knien beobachtet, während in Knien, die mit Kontrollvektor-transduzierten IPSCs behandelt wurden, keine FoxP3-positiven Zellen sichtbar sind. Darüber hinaus werden in den Knien von Mäusen, die IPSCs mit dem TCR-FoxP3-Vektor erhalten haben, deutlich mehr CD4-positive, FoxP3-positive, TCR3 Beta 5-positive Zellen nachgewiesen als bei alleiniger Gabe des FoxP3-Vektors, was darauf hindeutet, dass antigenspezifische IPSC-Treg-Zellen nach ihrer adoptiven Übertragung in Empfängertiere in das antigenerzeugte arthritische Knie wandern. Die adoptive Übertragung von IPSC-abgeleiteten Zellen führt außerdem zu einer deutlichen Verringerung der entzündlichen Schwellung des Knies bei Vorhandensein von OVA, hat jedoch keine Wirkung auf Kontrollknie, die mit methyliertem BSA injiziert wurden.Die positiven Effekte der Schwellungsreduktion werden weiterhin durch hochauflösende Mikro-CT-Bildgebung der beobachteten reduzierten Knochenresorption in behandelten Knien im Vergleich zu Kontrolltieren, die nur MBSA injiziert bekamen, untermauert. Einmal zusammengestellt, können diese detaillierten Verfahren innerhalb von sechs Wochen abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, die eingeleitete Differenzierung der TCR-FoxP3-Antigen-transduzierten iPS-Zellen zu induzieren.Nach dieser Methode können auch verschiedene Zusammensetzungen von suppressiven Zytokinen in Betracht gezogen werden, um weitere Fragen zur Überlebensfähigkeit und Qualität der antigenspezifischen iPS-Zellen und Treg-Zellen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der zellbasierten Therapie den Weg, um die Rolle antigenspezifischer regulatorischer T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit direkten Autoantikörpern äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise die Arbeit in einer Basis-Sicherheitsstufe-2-Einrichtung, getroffen werden sollten, während ein Verfahren durchgeführt wird.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Regulatorische T-Zellen: Therapeutische Potenzial zur Behandlung von Transplantatabstoßung und Typ-I-Diabetes

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Generierung von T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gibt einen alternativen Ansatz der Verwendung von embryonalen Stammzellen für die T-Zell-basierten Immuntherapie. Verfahren zeigt, dass durch Verwendung von...

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Dieses Video zeigt eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis bei Mäusen. iPSC-abgeleitete T-regulatorische Zellen, die Ovalbumin-spezifische Rezeptoren exprimieren, werden mit methyliertem Rinderserumalbumin (mBSA) injiziert, das in einem Adjuvans emulgiert wird. Murine Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verarbeiten und präsentieren das mBSA an T-Zellen, was zur Aktivierung der T-Zellen und zur Migration zur Synovialmembran des Kniegelenks führt. Nachfolgende Injektionen umfassen mBSA...

Eine zellbasierte Therapie für Autoimmunarthritis im Mausmodell

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen...

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung funktioneller Tumorantigen-spezifischer induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteterCD8- + einzelner positiver T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung antigen-spezifischer regulatorischer T-Zellen aus iPSCs für die Immuntherapie bei Autoimmunarthritis. Diese Technik liefert einheitliche Zellpopulationen für gezielte Behandlungsansätze.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Weitere Videos entdecken