Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine neue Methode zur Erzeugung von aus Stammzellen gewonnenen entzündeten Gelenk-assoziierten regulatorischen T-Zellen für die Immuntherapie gegen Autoimmunarthritis zu entwickeln. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Autoimmunität über mögliche Immunotherpeutika bei Autoimmunarthritis zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die aus Stammzellen gewonnenen regulatorischen T-Zellen nyped und von einem einzigen Typ sind.

Beginnen Sie damit, die interessierenden Feederzellen auf eine Mindestdichte von eins mal 10 der vierten Zellen pro Quadratzentimeter in OP9-Medium zu verdünnen und die sechste Feederzellen pro 10-Zentimeter-Schale einmal 10 zu plattieren. Wenn die Zellen zu 80 bis 90 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium aus den Kulturen und säen Sie 0,5 bis eins mal 10 bis zum fünften, retroviral transduzierten induzierbaren pluripotenten Stammzellen oder IPSCs in OP9-Medium in jeder Schale. Fünf Tage später aspirieren Sie das Medium und waschen die Zellen mit 10 Millilitern PBS.

Dann lösen Sie die Zellen mit vier Millilitern Trypsin pro Schale bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie nach 10 Minuten die Reaktionen mit acht Millilitern IPSC-Medium und ziehen Sie die Zellen zur Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem IPSC-Medium und legen Sie die Zellen auf neue 10-Zentimeter-Schalen

Lassen Sie die Feeder-Zellen 30 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator an der Platte haften. Sammeln Sie dann die schwimmenden IPSCs und filtrieren Sie die transduzierten Zellen zur Zählung durch ein 70-Mikron-Sieb. Säen Sie fünfmal 10 bis zu den fünften IPSCs auf eine frische 80 bis 90%ige konfluente Platte mit Feederzellen in OP9-Medium, ergänzt mit Murine-Flt3-Liganden, und geben Sie die Kulturen zurück in den Inkubator.

Verwenden Sie nach drei Tagen eine 10-Milliliter-Pipette, um das Geschirr mit dem Nährmedium zu spülen. Geben Sie dann fünf Milliliter frisches OP9-Medium in die Schale und waschen Sie alle halb anhaftenden IPSCs vorsichtig mit vorsichtigem, kräftigem Pipettieren ab, ohne die Feeder-Zellschicht zu stören. Wiederholen Sie die Wäsche mit 10 Millilitern PBS, um die letzten halb anhaftenden Zellen zu ernten, und ziehen Sie die Waschungen aus jeder Schale in ein konisches Röhrchen pro Kultur.

Nach dem Schleudern der Zellen resuspendieren Sie die Pellets in 10 Millilitern OP9-Medium, das mit Murin-Flt3-Ligand und IL-7 ergänzt ist, und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb. Säen Sie eine IPSC-Kultur pro Vertiefung in eine Sechs-Well-Kulturplatte mit 80 bis 90 % konfluenten Feeder-Zell-Monoschichten und stellen Sie die Co-Kulturen wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums durch frisches OP9-Medium, das mit Murine-Flt3-Ligand und IL-7 ergänzt wird, und säen Sie alle vier bis sechs Tage die differenzierenden IPSCs auf neue Platten mit einer frischen Schicht aus Feeder-Zellen aus.

Beginnen Sie damit, die interessierenden Zellkulturen mit Trypsin abzulösen und jeden Zelltyp in 10 Millilitern frischem Medium zu resuspendieren. Füllen Sie jede Zellkultur in eine neue 10-Zentimeter-Schale und lassen Sie die Feeder-Zellen im Zellkultur-Inkubator anhaften. Sammeln Sie nach 30 Minuten die schwimmenden IPSCs und führen Sie die Kulturen durch einzelne 70-Mikron-Zellsiebe, um die Zellcluster für die Zählung zu entfernen.

Resuspendieren Sie jede Kultur in einer Konzentration von 1,5 mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in kaltem PBS und filtrieren Sie bei Bedarf erneut. Legen Sie dann vier bis sechs Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse nacheinander in eine Kleintier-Fixierung und übertragen Sie adoptiv 200 Mikroliter eines Zelltyps pro Maus in die Schwanzvene jedes Tieres. Verwenden Sie einen Messschieber, um die Schwellung beider Knie zu messen, um die Basismessung zu ermitteln.

10 Tage nach dem Zelltransfer injizieren Sie den Mäusen mit einer Ein-Milliliter-Spritze 100 Mikrogramm methyliertes BSA, das in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert ist, an der Basis des Schwanzes jedes Versuchstieres. 17 Tage nach dem Zelltransfer wird Arthritis durch intraartikuläre Injektion von 20 Mikrogramm methyliertem BSA in 10 Mikroliter PBS in das linke Kniegelenk und 20 Mikrogramm methyliertem BSA und 100 Mikrogramm ganzem Ovalbumin induziert in 10 Mikrolitern PBS in das rechte Kniegelenk jedes anästhesierten adoptiv übertragenen Tieres. Sieben Tage nach der Induktion der Arthritis messen Sie die Knie erneut, um die prozentuale Zunahme des Kniedurchmessers zu berechnen, und entfernen Sie chirurgisch die Patella.

Fixiere die Fugen mit Formalin. Nach der Entkalkung in EDTA werden die Knie in Paraffin eingebettet und vier Mikrometerschnitte für die histochemische Färbung und Analyse erhalten. An Tag 28 exprimieren die antigenspezifischen T-regulatorischen Zellen erhebliche Mengen an CD3- und antigenspezifischen T-Zell-Rezeptoren.

Die meisten dieser Zellen exprimieren auch CD25, CD127 und CTLA-4, die alle typischerweise in natürlich vorkommenden T-regulatorischen Zellen in erhöhten Konzentrationen exprimiert werden. Tatsächlich bleibt FoxP3 in IPSC-abgeleiteten T-regulatorischen Zellen bestehen, selbst nach langfristiger In-vitro-Stimulation mit dem Notch-Liganden, wie durch intrazelluläre Färbung nachgewiesen wurde. Darüber hinaus produzieren diese antigenspezifischen IPSC T-regulatorischen Zellen suppressive Zytokine, wenn sie in vitro mit antigengepulsten Splenozyten stimuliert werden, was auf einen potenziellen suppressiven Phänotyp für diese Zellen hinweist.

FoxP3-positive Zellen werden in OVA-behandelten Knien beobachtet, wobei in Knien, die Kontrollvektor-transduzierte IPSCs erhalten, keine FoxP3-positiven Zellen sichtbar sind. Darüber hinaus sind in den Knien von Mäusen, die IPSCs erhalten, die mit dem TCR-FoxP3-Vektor transduziert wurden, viel mehr CD4-, FoxP3- und TCR3-Beta-5-positive Zellen sichtbar als mit dem FoxP3-Vektor allein, was darauf hindeutet, dass antigenspezifische IPSC-Treg-Zellen nach ihrem adoptiven Transfer in Empfängertiere in das Antigen-induzierte Arthritis-Knie migrieren. Der IPSC-abgeleitete Zelladoptivtransfer bewirkt auch eine signifikante Abnahme der entzündlichen Knieschwellung, wenn OVA vorhanden ist, hat jedoch keinen Einfluss auf die kontrolliert methylierten BSA-injizierten Knie.

Die positiven Auswirkungen der Schwellungsreduktion werden durch die hochauflösende Mikro-CT-Bildgebung des reduzierten Knochenverlusts bestätigt, der bei mit Zelltransfer behandelten Knien im Vergleich zu Kontrolltieren, die nur MBSA injiziert wurden, beobachtet wurde. Einmal gesammelt, können diese tiefgreifenden Eingriffe in sechs Wochen abgeschlossen sein, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, die durchdrungene Differenzierung der TCR-FoxP3-Antigen-transduzierten IPSCs zu induzieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können auch verschiedene Verbindungen suppressiver Zytokine debattiert werden, um zusätzliche Fragen zum Überleben und zur Qualität der antigenspezifischen IPSCs T-reg-Zellen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der zellbasierten Therapie, um die Rolle antigenspezifischer regulatorischer T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit direkten Karosserie-Baktoren extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung eines Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Arbeit in einer einfachen Zwei-Kabine.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.