Name: Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Durchflusszytometrie zur Quantifizierung allergenbeladener PM10-Partikel mit Bet v 1-Antikörpern. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Allergentransport in der Atemluft.

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Die Autoren danken Katrin Bossmann, Anett Neumann und Eike Wolter (Umweltbundesamt) für ihre wertvolle Vorarbeit.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Anfärbung von PM10-Partikel mit einem monoklonalen Antikörper (monoklonaler Maus-IgG1-Antikörper, Klon MA-3B4) gegen Bet v 1, das Birkenpollenhauptantigenkomponente plus einem Allophycocyanin (APC) -markiertem Sekundärantikörper (anti -mouse IgG1-Antikörper, Klon A85-1) und die anschließende Analyse auf einem Durchflusszytometer. Mit geeigneten anderen Antikörpern verfügbar, kann dieses Verfahren auf die Detektion von anderen Antigenen verlängert werden gebunden auf Umgebungs Luftteilchen. 1. PM10 Probenahme <ol><li> Sammeln PM10 aus der Umgebungsluft auf Polytetrafluorethylen (PTFE) Filter verwendet ein geringes Volumen Sampler mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,3 m 3 / h (Abbildung 1). Eine Charakterisierung des Probennehmers für die Experimente verwendet hier beschrieben ist , in 16 zu finden. Laufzeit hängt von der Menge an PM10 benötigt (üblicherweise zwischen 1 und 10 Tage). </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, entfernen Sie den Filter aus dem Sampler und frieren es-20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Abbildung 1. Geringes Volumen PM10 - Sampler. Beispiel für ein geringes Volumen PM10 - Sampler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. PM10 Abnahme und die Partikelzählung <ol><li> Lassen Sie die PTFE-Filter Tauwetter für ca. 5 min. Dann legen Sie den Filter in einem sauberen Polystyrol- Petrischale (2A). Nehmen Sie eine neue Petrischale für jeden Filter, wenn mehr als ein Filter verarbeitet wird. </li><li> Anschließend überlagert die PTFE-Filter mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dieses Protokoll ist für eine endgültige PM10 - Konzentration von 8x10 6 Partikel pro ml hergestellt wird (siehe Schritt 3.3). Zur Erzielung zumindest, dass die Konzentration, verwenden Sie die folgende empirische Volumen PBS, den Filter zu überlagern mit: Wenn die PM10 Sammelzeit war &lt;<html> Vor 2 Tagen, verwenden 2 ml. Für Inkubationszeiten ≥2 Tage, verwenden Sie 4 ml. HINWEIS: Um die Partikelkonzentration der PM10-Suspension, Suspensionen aus unterschiedlichen Filtern zu erhöhen gebündelt werden können, wenn dies angemessen ist. </li><li> Halten Sie die PTFE - Filter mit einer Pinzette und Bürste mit einer elektrischen Zahnbürste mit einem empfindlichen Bürstenkopf für 1 min (2B, 2C). Übertragen Sie die Partikel-PBS-Suspension, die im Folgenden genannt PM10 Suspension, auf eine saubere Reaktionsrohr. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Abbildung 2. PM10 Entfernung mit einer elektrischen Zahnbürste. Polytetrafluorethylen - Filter mit gesampelten PM10 in einer Polystyrol- Petrischale (A) angeordnet und mit 4 ml PBS überschichtet. Dann wird PM10 mit einer elektrischen Zahnbürste entfernt (B: vor dem Zähneputzen und C: nach 1 min Bürsten).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="4"><li> Messen der Konzentration von PM10 Partikel, beispielsweise durch die Verwendung eines Partikelzählers. Verdünnte ein ausreichendes Volumen von PM10 Suspension von beispielsweise 50 &amp; mgr; l in 10 ml isotonischer Messpuffer, messen dreimal und berechnet die mittlere Gesamtzahl der Teilchen pro ml. Achten Sie darauf, einen Partikelzähler zu verwenden, die Partikel der relevanten Größe erfassen kann. </li></ol> 3. Bet v 1-Färbung <ol><li> Berechnung der Anzahl der Reaktionsröhren zur Analyse der Probe benötigt: mindestens drei Reaktionsrohre erforderlich sind: (i) ein Rohr mit der Probe nur (native Kontrolle) (ii) ein Rohr mit Probe plus sekundären Antikörper (negative Kontrolle) und ( iii) ein Rohr mit Probe plus primären und sekundären Antikörper (spezifische Probe). Wenn zum ersten Mal gemessen wird, vorbereitet mindestens zwei Reaktionsrohre für (i) (ii),und (iii) genügend Material zu haben, um richtig cytometer Einstellungen anpassen (siehe Schritt 4.1). </li><li> Berechnen der Menge an PM10 Suspension, die für die Anzahl von Reaktionsrohren. Jedes Reaktionsröhrchen erfordert 50 ul Suspension. </li><li> Einstellen , die Partikelkonzentration in Schritt gemessen 2,4 für das Volumen der Suspension in Schritt berechnet 3,2 auf eine Endkonzentration von 8x10 6 Partikel pro ml durch eine entsprechende Menge an PBS hinzugefügt wird . ANMERKUNG: Die restlichen PM10 Suspension bei -20 ° C eingefroren für zukünftige Experimente werden, obwohl für dieses Protokoll frisch zubereitetes PM10 Suspension empfohlen. </li><li> Block unspezifische Bindung durch die PM10 Suspension mit Rinderserumalbumin (BSA) in einer Endkonzentration von 0,02% zu ergänzen, unter Verwendung einer Stammlösung, wie beispielsweise 1% BSA mit PBS hergestellt. Vortex kurz und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Für jede Probe mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, werden 50 ul der Suspension aus Schritt 3.4 bis acmageren Reaktionsrohr. Fügen einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen Bet v 1 in einer Endkonzentration von 0,02 ug / ul zu den Reaktionsrohren für spezifische Färbung bezeichnet wird, kurz vortexen und Inkubation für 60 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Lassen Sie die Reaktionsrohre mit der PM10-BSA Suspension für die native Kontrolle bezeichnet und die negative Kontrolle auch für 60 min bei Raumtemperatur bleiben. </li></ol></li><li> Waschen Sie alle Proben durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS mit 0,02% BSA zu jedem Reaktionsgefäß ergänzt, kurz vortexen und zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 4.700 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Überstand vorsichtig verwerfen durch Verwendung einer Vakuumpumpe. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6. </li><li> Bestimmung der Gesamtmenge an APC-markierten sekundären anti-Maus-IgG1-Antikörper benötigt: 1 &amp; mgr; g Antikörper, gelöst in 50 ul PBS mit 0,02% BSA ergänzt pro Reaktionsrohr. Verdünne die entsprechende Menge an Antikörper mit dem entsprechenden Volumen von PBS, ergänzt mit 0,02% BSA. </li><li> In 50 ul des verdünnten sekundären Antikörper zu allen Reaktionsgefäßen mit Ausnahme der Reaktionsrohr für die native Steuerung bezeichnet. Ergänzen Sie die letztere mit 50 &amp; mgr; l PBS mit 0,02% BSA ergänzt. Vortex alle Proben für einige Sekunden. </li><li> Inkubieren alle Proben für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6 zweimal. </li><li> In 50 ul PBS in jedes Reaktionsröhrchen, Wirbel und Analyse der Proben auf einem Durchflusszytometer. </li></ol> 4. Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Mit der nativen Kontrolle, adjust nach dem Zytometer Parameter Datenanalyse zu optimieren. <ol><li> Durch die Verwendung setzen die Vorwärtsstreuung (FSC) -Schwelle Controller auf dem Gerät Steuerplatine angezeigt, das FSC-Schwelle auf dem niedrigsten Wert (200) und die Analyse starten. </li><li> Durch die Verwendung der Streuspannungsregler, stellen Sie den FSC und Seitwärtsstreuung (SSC) auf diese Weise, dass alle PM10-Partikel nachgewiesen werden können und dass die Population von Teilchen befindet sich etwa in the Mitte der FSC-Achse und in der unteren Hälfte der SSC-Achse. </li><li> Durch die Verwendung des Fluoreszenzspannungsregler, stellen Sie die APC-Spannung und eine andere Fluoreszenzspannung wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), die bei der gleichen Wellenlänge emittieren, nicht wie APC, falls erforderlich. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel in der unteren Hälfte der beiden Fluoreszenz Achsen sichtbar sind. </li></ol></li><li> Nacheinander, untersuchen jede Probe einschließlich der nativen Kontrolle und Speicherung der FSC, SSC, APC und FITC Daten von mindestens 10.000 Partikel pro Probe. </li><li> Auswertung der Daten mit der entsprechenden Software. Adsorbiertem Allergengehalt in der bestimmten Probe kann auf zwei Arten quantitativ bestimmt werden: <ol><li> Analysieren Sie den APC Fluoreszenzintensität aller Partikel (Medianwert) als Maß für Bet v 1 Last über alle PM10-Partikel. HINWEIS: Wenn die spezifische Probe Allergen enthalten ist, APC Fluoreszenzintensität in der spezifischen Probe im Vergleich zur Negativkontrolle erhöhen sollte. Im Gegensatz dazu andere fluorescence Intensitäten (z. B. FITC Fluoreszenzintensität) nicht wesentlich ändern. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der PM10-Partikel mit gebundenen Anti-Bet v 1-Antikörper. Dadurch wird in der Negativkontrolle, setzen Sie ein Tor um die Teilchen APC positiv betrachtet, zu kopieren und dieses Tor in die spezifische Probe einfügen und den Prozentsatz der APC positiven Teilchen in der negativen Kontrolle aus dem Prozentsatz der APC positiven Teilchen in der spezifischen Probe subtrahieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Verwendung eines geeigneten Filters für die Sammlung von PM10 Partikel aus der Umgebungsluft (siehe Schritt 1.1). Der Filter muss stark genug sein, mit einer elektrischen Zahnbürste zu ertragen Bürsten, und nicht alle Filtermaterialien erfüllen diese Anforderung. Das Färbungsprotokoll wurde mit einer PM10 Partikelkonzentration von 8x10 6 Partikel pro ml hergestellt. Allerdings, wenn das Material begrenzt ist und die Bündelung von Proben nicht geeignet ist, wird das Verfahren wahrscheinlich genauso gut funktionieren, aber die Antikörper-Konzentrationen (siehe Schritte 3.5 und 3.8) können angepasst werden müssen. Bet v 1-Färbung von PM10-Partikel ergab keine unterschiedlichen Populationen von positiv und negativ gefärbten Teilchen. Dies könnte durch die unterschiedlichen Mengen von Bet v 1 Allergens auf jede der von sehr kleinen bis zu einer hohen Menge im Bereich Partikel adsorbiert verursacht werden. Dies könnte in der Erweiterung des APC-Signal führen somit die Bevölkerung verschiebt sich in RichtungAPC-Positivität. Da es schwierig ist , den positiven von den negativen Teilchen zu trennen, wurden zwei Quantifizierungsmethoden verwendet , um die Unterschiede in der Bet v 1 - Gehalt der PM10&gt; 0,5 Proben zu bestimmen: (i) eine relative Quantifizierung durch den Median APC Fluoreszenzintensität aller Teilchen Mess und (ii) Bestimmung des Prozentsatzes von APC positive Partikel. Die Bet v 1 - Last von Partikeln aus niedrigen und hohen Pollensaison PM10 In Bezug auf &gt; 0,5 zeigten beide Methoden ähnliche Ergebnisse. Dennoch empfiehlt sich eine relative Quantifizierung durch mittlere Fluoreszenzintensität aller Partikel, wie es das Gate des Anordnens und daher wahrscheinlich weniger fehleranfällig unabhängig ist. Viele Studien Bisher untersuchen die Allergengehalt in der Umgebungsluft Feinstaub durch das jeweilige Allergen und anschließende Quantifizierung Extraktion mit ELISA 5,12-14,17. Es besteht ein grundlegender Unterschied zwischen der hier beschriebene Verfahren und die quantification mit ELISA: ELISA quantifiziert die extrahiert und aufgelöst Antigen, während der Durchflusszytometrie die partikelgebundenen Antigen analysiert. Mittels ELISA die Bet v 1 Last der getesteten PM10 Proben (n = 8) unterhalb der Nachweisgrenze von 1,2 ng / ml (Daten nicht gezeigt). In ähnlicher Weise identifiziert Buters und andere keine Bet v 1 in der PM &lt;2,5 &amp; mgr; m - Fraktion und nur etwa 7% in der 10 &amp; mgr; m&gt; PM&gt; 2,5 um - Fraktion, aber mehr als 93% in der PM&gt; 10 um Anteil an Umgebungsluft 13. Die kontrastier Ergebnisse des ELISA auf der einen Seite und der FACS-Analyse auf der anderen Seite kann durch Unterschiede in der Detektionsverfahrens in Verbindung mit divergenten Empfindlichkeit verursacht werden. Weitere Forschung ist jedoch nötig, um diesen Unterschied zu verstehen. Ein Verfahren zur Visualisierung partikelgebundene Antigen wird rasterelektronenmikroskopisch 10,14. Durch Rasterelektronenmikroskopie, Ormstad et al. Visualisierten Bet v 1 an der Oberfläche von suspendierten teilchenförmigen matter Rußpartikeln im Hochpollensaison abgetastet und in geringerem Maße von Partikeln im Niederpollensaison abgetastete 15. Zusätzlich Allergenen aus Pollen, Latex und auch β-Glucane wurden gefunden 10 bis Verbrennungspartikel in der Luft adsorbiert werden. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nicht die Quantifizierung des partikelgebundenen Allergen. Durch die Verwendung der Durchflusszytometrie, partikelgebundene Bet v 1 Allergen quantifiziert werden konnte. Somit Durchflusszytometrie eine neue Möglichkeit bieten kann , die von 10 bis 0,5 &amp; mgr; m biologische Fraktion von PM10 als mit anderen geeigneten Antikörpern auf der Hand zu charakterisieren, kann dieses Verfahren auf die Detektion von anderen Antigenen über die Luftpartikel ausgedehnt werden, beispielsweise Schimmel, Hausstaubmilben Allergene oder LPS. Als PM10 Partikel nicht nur biologische Material adsorbieren, sondern auch Chemikalien und Metalle ganz leicht, unspezifische Bindung von Antikörpern könnte, stellen jedoch ein Problem. Wenn ein neuer Antikörper getestet wird, ist ein kritischer Schritt spezifischen bind beweisening. Dies kann dadurch erfolgen, um beispielsweise die Bindungskapazität des spezifischen Antikörpers mit dem entsprechenden Antigen Blockierung vor 11 bis Anfärbung. Als Bet v 1 - Gehalt von Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl unterscheiden können 12,13,18, könnten allergische Symptome korrelieren vielleicht besser mit Allergengehalt als mit Pollen 14,18 zählen. Daher ermöglicht das vorgestellte Verfahren in Verbindung mit klinischen Daten in zukünftigen Experimenten zu untersuchen , ob allergische Reaktionen entsprechen dem Bet v 1 Allergenbelastung von PM10&gt; 0,5 bis Birke.

Die Luftverschmutzung ist 1-3 in den letzten Jahrzehnten als wichtiger Umwelt Ursache für die erhöhte Häufigkeit und Schwere von Atemwegsallergien beobachtet werden berücksichtigt. Außerdem gab es bei der Verteilung von häufigen Allergenen in Staub 4,5 zunehmendes Interesse. Birkenpollen kann Heuschnupfen auslösen kann aber auch ein wichtiger Auslöser von allergischem Asthma 6-8 sein. Whole Birkenpollen ist nicht wahrscheinlich die unteren Atemwege zu betreten oder in PM10 infolge seiner Größe (22 &amp; mgr; m im Durchmesser) zu finden sind. Allerdings Birkenpollenallergenen wie Bet v 1, dem Hauptbirkenpollenallergen - Komponente können nach Pollen Bruch 9 freigesetzt werden und 10 bis Umgebungsluftpartikel binden kann, wodurch möglicherweise die unteren Atemwege gelangen. Tatsächlich hat es sich gezeigt , dass PM10 biologisch aktiven Allergenen durch in vitro Aktivierung von Basophilen von einem Pollen allergischen Probanden wie gezeigt , enthalten 11 </sup&gt;. Bet v 1 Allergengehalt in PM10 - Proben wurde durch Extraktion des jeweiligen Allergen und anschließende Quantifizierung mit ELISA 12-14 untersucht worden. Mit der ELISA-Technik wurde das gelöste Allergen gemessen, aber die Menge des allergenbeladenen Partikel blieben noch unbekannt. Rasterelektronenmikroskopische allergenbeladenen Partikel ergab , aber nicht erlauben die Quantifizierung 10,15. Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie den Anteil der Bet v 1-beladenen Partikel in PM10 Umgebungsluftproben zu quantifizieren. Aufgrund der Nachweisgrenze des Durchflusszytometers nur Partikel größer als 0,5 &amp; mgr; m untersucht werden. Die&gt; 0,5 um Anteil an PM10 weiter als PM10&gt; 0.5 bezeichnet.

<table><tbody><tr><td>Teflonfilter</td><td>Pall Life Sciences, USA</td><td>R2PL047</td><td>47 mm, 1,0 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Kleinvolumiger Probenehmer</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&uuml; ro GmbH, Deutschland</td><td>LVS3</td><td>Luftstrom von 2,3 m3/h</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biochrom, Deutschland</td><td>L1825</td><td>ohne Ca/Mg, elektrische Zahnbürste mit niedrigem Endotoxin&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>Braun, Deutschland</td><td>Oral-B Vitality Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>Casy Zellzähler&nbsp;</td><td>Sch&auml; rfe System GmbH, Deutschland</td><td>Modell TTC-Bereich</td><td>mit detektierbarer Partikelgröße: 0,7 &micro; m bis 45&nbsp; &Mikro; m</td></tr><tr><td>FACSCanto II&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>3-Laser, 8-Farben (4-2-2)</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva Software v6.1.3&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Maus-IgG1-Antikörper gegen Bet v 1</td><td>Indoor Biotechnologies, UK&</td><td>nbsp; MA-3B4-Klon</td><td>MA-3B4</td></tr><tr><td>APC (Allophycocyanin)-markierter sekundärer Anti-Maus-IgG1-Antikörper</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>Klon A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM Software Version 18&nbsp;</td><td>PASW Statistics 18, Hongkong, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Gosselin, Frankreich</td><td>BP50-02</td><td>D 55&nbsp; mm, H 15&nbsp; mm</td></tr><tr><td>FACS Rohr&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>REF 352054</td><td>5 ml Polystyrol</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Deutschland</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Blank Tubes</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>4140</td><td>1,4 ml, PP</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>INTEGRA Biosciences AG, Schweiz</td><td>Modell 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>rekombinantes Bet v 1a Antigen&nbsp;</td><td>Biotechnologien für den Innenbereich, UK</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>Konzentration: 2,0 mg/ml</td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrische analyse von partikelgebundenen bet v 1 allergens in pm10

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zu quantifizieren Schwebstoffe wie Zellen oder Bakterien in einem Größenbereich von 0,5 bis einigen zehn Mikrometern im Durchmesser verwendet. Zusätzlich zu einer Charakterisierung von Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften ermöglicht es die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Markern wie Antikörpern jeweiligen Strukturen zu erkennen. Verwendung indirekten Antikörperfärbung, Durchflusszytometrie wird hier verwendet birch pollen allergen zu quantifizieren (genau Bet v 1) -beladene Teilchen von 0,5 bis 10 um im Durchmesser in inhalierbaren Partikeln (PM10, Teilchengröße ≤10 &amp; mgr; m im Durchmesser). PM10 Partikel wirken können als Träger von adsorbierten Allergenen sie möglicherweise auf die unteren Atemwege zu transportieren, wo sie allergische Reaktionen auslösen können. Bisher ist die Allergengehalt von PM10 wurde mittels enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) und Rasterelektronenmikroskopie untersucht. ELISA misst die gelöste und nicht die Partikel-bound Allergen. Im Vergleich zu der Rasterelektronenmikroskopie, die allergen-beladenen Partikel visualisieren kann, Cytometry fließen kann zusätzlich sie quantifizieren. Als Allergengehalt der Umgebungsluft aus Birkenpollen Zahl abweichen können, können allergische Symptome vielleicht besser korrelieren mit Allergenexposition als mit Pollenflug. In Verbindung mit den klinischen Daten, bietet die vorgestellte Methode die Möglichkeit, in zukünftigen Experimenten zu testen, ob allergische Reaktionen Pollenantigene gegen Birkenpollen mit dem Bet v 1 Allergen zugeordnet sind, Gehalt an PM10-Partikel&gt; 0,5 um.

Bet v 1 Allergen Adsorption an PM10&gt; 0,5 Partikel wurde cytometer durch indirekten Antikörper - Färbung und die anschließende Analyse auf einem Fluss quantifiziert. Eine PM10 Probe von hoher Pollensaison diente als Vorlage. Als 3.1 in Schritt angegeben, bestand die negative Kontrolle von PM10 - Partikel mit APC inkubiert markiert nur sekundäre Antikörper (3A). PM10 Partikel gefärbt mit Anti-Bet v 1 - Antikörper und sekundärem Antikörper zeigte die allergen beladenen Partikel (3B). Wie 4.3 in Schritt beschrieben ist, zwei Möglichkeiten, um die Allergenbelastung der Quantifizierung wurden verwendet: Einerseits wurde der Medianwert der APC Fluoreszenzintensität aller Teilchen ist 137 für die negative Kontrolle und 904 für die spezielle Probe analysiert. Auf der anderen Seite ist der Anteil der Partikel mit der gebundenen anti-Bet v 1-Antikörper bestimmt: Ein Gate um die APC positive Teilchen in der negativen Kontrolle gesetzt wurde und anschließend copied und in die spezifische Probe eingefügt. In der Negativkontrolle, 3% der PM10&gt; 0,5 Teilchen wurden als APC positiv. Dieser Prozentsatz der falsch - positiven Teilchen wurde aus dem Prozentsatz der positiven Teilchen in der spezifischen Probe abgezogen somit in 77,5% APC positive PM10&gt; 0,5 Partikel in der spezifischen Probe ergibt. Um zu beweisen, dass die beobachtete Bindung des anti-Bet v 1-Antikörper spezifisch war, wurde Bindungskapazität mit dem entsprechenden Antigen vor der Färbung blockiert. Diese verminderte Bindung des anti-Bet v 1 - Antikörper von 69%, wenn sie von APC Fluoreszenzintensität quantifiziert, und um 84%, wenn nach prozentualer Bet v 1 positive PM10 quantifiziert&gt; 0,5 Teilchen (3C). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Abbildung 3. partikelgebundenen Bet v 1 Allergen durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. APC Fluoreszenzintensität einer Probe von PM10 hohen pollen Zeit nur mit APC markiertem Sekundärantikörper (A), gefärbt mit dem Anti-Bet v 1 primärem Antikörper und anschließend mit dem APC markiertem Sekundärantikörper (B) gefärbt, und nach der primären Antikörper mit rekombinantem Bet v 1 - Antigen blockieren (C ). Die Gate - P APC + wurde um die Partikel eingestellt APC positiv betrachtet (in rot dargestellt) und die jeweiligen Prozentsätze angegeben sind. Diese Zahl wurde von 11 leicht modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um zu testen , ob diese Methode Unterschiede in der Menge an adsorbiertem Bet v 1 - Gehalt von PM10&gt; 0,5 Proben von hoch und aus niedrigen Pollensaison angenommen werden könnte offenbaren, 13 PM10 - Proben von hoch und 6 PM10 Proben aus niedrigen Pollensaison analysiert. Abbildung 4zeigt signifikante Unterschiede in der APC - Fluoreszenzintensität und im Verhältnis von Bet v 1 positive PM10&gt; 0,5 Teilchen von PM10 - Proben von hoher Pollensaison im Vergleich zu PM10 Proben aus niedrigen Pollensaison. Beide Quantifizierungsmethoden zeigten hiermit ähnliche Ergebnisse. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Abbildung 4. PM10 - Proben von niedrigen und hohen Pollensaison unterscheiden sich in ihrer Menge an adsorbiertem Bet v 1. Niedrige Pollensaison PM10 wurde im Herbst / Winter abgetastete 2013 (n = 6), hohe Pollensaison PM10 Mai 2012 und 2013 (n = 13). (A) Die APC - Fluoreszenzintensität von PM10&gt; 0,5 Partikel aus hoch Pollensaison war signifikant höher als von niedrigen Pollensaison (Median / min / max hohe Pollensaison: 796/313/1097; Median / min / max niedrige Pollensaison: 197 / 85/277). (B) PM10 von hoher Pollensaison enthalten significantly mehr Bet v 1-positive PM10&gt; 0,5 Partikel als PM10 von niedrigen Pollensaison (Median / min / max hohe Pollensaison: 45,2 / 18,5 / 74,5; Median / min / max niedrige Pollensaison: 11,8 / 4,4 / 19,8). Box-Plots zeigen Medianwerte (innere Linie der Box), 25. und 75. Perzentile, bzw. (untere und obere Grenzen der Box) und Minimal- und Maximalwerte (Whiskers). *** P &lt;0,001 im Vergleich zu niedrigen Pollensaison, Mann Whitney-U-Test. Diese Zahl wurde von 11 leicht modifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll allergen-beladenen Partikel durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Feinstaub in der Luft Partikel können als Träger von adsorbiertem Allergene wirken. Wir zeigen hier, dass der Durchflusszytometrie ist ein Verfahren allgemein zur Charakterisierung von Schwebstoffen verwendet&gt; 0,5 um im Durchmesser, können diese allergen-beladenen Partikel zu messen, verwendet werden.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, mittels Durchflusszytometrie Allergene tragende Partikel des umgebenden Feinstaubs zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Allergenbelastung von PM10-Partikeln zu beantworten. Diese Partikel können als Träger adsorbierter Allergene fungieren und diese möglicherweise in die unteren Atemwege transportieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine schnelle Möglichkeit bietet, Allergene tragende PM10-Partikel sichtbar zu machen und zu quantifizieren.Wir haben diese Methode für das Bet v 1-Antigen etabliert, sie kann jedoch auch auf andere Antigene angewendet werden. Die Durchführung der Methode wird Sabine Bach, eine Technikerin aus unserem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, mithilfe eines Geräts mit geringem Probenvolumen Partikel mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern oder weniger aus der Umgebungsluft auf Polytetrafluoroethylen-Filtern zu sammeln.Führen Sie den Sammler je nach der Menge an Partikeln in der Luft und der gewünschten zeitlichen Auflösung zwischen einem und zehn Tagen lang durch. Entfernen Sie am Ende der Sammlung den Filter aus dem Probenahmegerät und frieren Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius ein, bis er analysiert wird.Wenn Sie bereit sind, mit der Probenanalyse fortzufahren, nehmen Sie den Polytetrafluorethylen-Filter aus dem Gefrierschrank und lassen Sie ihn etwa fünf Minuten lang auftauen. Anschließend geben Sie den Filter in eine saubere Polystyrol-Petrischale und bedecken den Filter mit ausreichend PBS, um eine Konzentration von acht mal 10 hoch sechs Partikeln pro Milliliter zu erreichen.Halten Sie den Filter mit einer Pinzette und bürsten Sie ihn mit einer elektrischen Zahnbürste mit empfindlichem Bürstenkopf eine Minute lang. Überführen Sie dann die partikuläre PBS-Suspension in ein sauberes Reaktionsröhrchen. Verdünnen Sie 50 Mikroliter der PM10-Suspension in 10 Milliliter isotonischem Messpuffer.Verwenden Sie einen Partikelzähler, um die Konzentration der gesammelten PM10-Partikel zu messen. Berechnen Sie die mittlere Partikelkonzentration aus drei separaten Messungen. Verwenden Sie die Partikel-PBS-Suspension aus einer Probe, um Partikel von einem anderen Filter zu sammeln, falls die Partikelkonzentration als zu niedrig befunden wird und das Zusammenlegen mehrerer Proben angemessen ist.Bestimmen Sie zunächst die erforderliche Anzahl an Reaktionsröhrchen. Für jede zu analysierende PM10-Suspension werden drei Arten von Reaktionsröhrchen benötigt: ein Röhrchen mit der nativen Kontrollprobe, ein Röhrchen mit der negativen Kontrollprobe und ein Röhrchen mit der spezifisch angefärbten Probe.Berechnen Sie anschließend das erforderliche Volumen der PM10-Suspension. Jeder Reaktionsgefäß benötigt 50 Mikroliter Suspension. Anschließend wird die in der Probe gemessene Partikelkonzentration durch Zugabe einer geeigneten Menge PBS auf eine Endkonzentration von acht mal 10 hoch 6 Partikel pro Milliliter eingestellt.Als Nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die PM10-Suspension mit 0,02 % BSA versetzen, verdünnt aus einer 1 %igen BSA-Standardlösung, die mit PBS hergestellt wurde. Vortexen Sie die PM10-BSA-Suspension kurz und inkubieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie für jede Probe, die mittels Durchflusszytometrie analysiert werden soll, 50 Mikroliter der Suspension in ein sauberes Reaktionsröhrchen.Fügen Sie den monoklonalen Maus-Antikörper gegen Bet v 1 in einer Endkonzentration von 0,02 Mikrogramm pro Mikroliter zu den für die spezifische Färbung vorgesehenen Reaktionsgefäßen hinzu. Vortexen Sie diese kurz und inkubieren Sie anschließend alle Reaktionsgefäße 60 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie danach alle Proben, indem Sie 500 Mikroliter PBS, ergänzt mit 0,02 % BSA, zu jedem Reaktionsgefäß hinzufügen und die Proben kurz vortexen.Anschießend pelletieren Sie die Proben und entfernen vorsichtig den Überstand mithilfe einer Vakuumpumpe. Bestimmen Sie die Gesamtmenge des APC-markierten sekundären Anti-Maus-IgG1-Antikörpers, die benötigt wird, und verdünnen Sie ihn mit dem entsprechenden Volumen an PBS, ergänzt mit 0,02 % BSA. Geben Sie 50 Mikroliter des verdünnten sekundären Antikörpers in alle Reaktionsgefäße außer in die native Kontrolle.Zur nativen Kontrolle 50 µL PBS mit 0,02 % BSA zugeben. Alle Proben kurz vortexen und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation alle Proben zweimal wie zuvor gezeigt waschen.Nach der letzten Wäsche 50 µL reines PBS zu jedem Reaktionsröhrchen hinzufügen. Anschließend die Proben vortexen und an einem Durchflusszytometer analysieren. Mithilfe der nativen Kontrolle die Zytometerparameter anpassen, um die Datenanalyse zu optimieren.Stellen Sie zunächst die Vorderstreustreuungsschwelle auf den niedrigsten Wert von 200 ein und beginnen Sie die Analyse. Passen Sie anschließend mithilfe des Streulicht-Spannungsreglers die Vorderstreustreuung und danach die Seitwärtsstreuung so an, dass alle PM10-Partikel erfasst werden und die Partikelpopulation ungefähr in der Mitte der Vorderstreustreuungsachse sowie in der unteren Hälfte der Seitwärtsstreuungsachse liegt. Starten Sie die Analyse erneut und nehmen Sie die Daten auf.Danach verwenden Sie den Fluoreszenzspannungsregler, um die Fluoreszenzspannung für den sekundären Antikörper sowie eine weitere Fluoreszenzspannung, beispielsweise für FITC, einzustellen. Sobald dies abgeschlossen ist, starten Sie die Analyse erneut und nehmen die Daten auf. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel in der unteren Hälfte beider Fluoreszenzachsen sichtbar sind.Untersuchen Sie nacheinander jede Probe und speichern Sie die Daten für Streuung in Vorwärtsrichtung, Streuung in Seitenrichtung, Fluoreszenz des sekundären Antikörpers sowie die FITC-Daten von mindestens 10.000 Partikeln pro Probe. Eine Möglichkeit, den absorbierten Allergengehalt zu quantifizieren, besteht darin, die APC-Fluoreszenzintensität aller Partikel zu analysieren. Bearbeiten Sie hierzu die Statistiken, indem Sie auf die Schaltflächen für den FITC-Median und den APC-Median klicken.Anschließend vergleichen Sie die jeweiligen Werte und die negative Kontrolle mit denen der spezifisch gefärbten Probe. Eine andere Möglichkeit, den gebundenen Allergengehalt zu quantifizieren, besteht darin, den Prozentsatz der PM10-Partikel mit gebundenem Anti-Bet v 1-Antikörper zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Gate um die als falsch positiv betrachteten Partikel gelegt wird.Klicken Sie anschließend auf die spezifisch gefärbte Probe und trennen Sie mithilfe desselben Gates die APC-positiven Partikel in der spezifischen Probe. Während der hohen Pollensaison haben eine große Anzahl von PM10-Partikeln das Bet v 1-Antigen gebunden. Die Erkennung von Bet v 1 ist spezifisch, da das Signal signifikant abnimmt, wenn der primäre Antikörper mit einer rekombinanten Version des Bet v 1-Antigens blockiert wird.Wenn die während der hohen Pollensaison gesammelten PM10-Partikel mit denen aus der niedrigen Pollensaison verglichen wurden, zeigte sich ein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Prozentsatzes an Bet v 1-positiven PM10-Partikeln. Die während der hohen Pollensaison gesammelten Partikel enthielten mit deutlich größerer Wahrscheinlichkeit das Bet v 1-Antigen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Durchflusszytometrie-Analyse der gesammelten PM10-Partikel in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Beachten Sie, dass die Durchflusszytometrie nur Partikel erfasst, die größer als 5 Mikroliter sind. Wenn Sie dieses Verfahren befolgen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass wir diese Methode zur Bestimmung der Bet-v-1-Allergenbelastung von PM10-Partikeln entwickelt haben, was einen grundlegenden Unterschied zur ELISA-Methode darstellt, bei der Sie es mit gelöstem Antigen zu tun haben. Wenn der Bet-v-1-Gehalt der Umgebungsluft von der Pollenzahl abweichen kann, könnten allergische Symptome mit dem Allergenspiegel korrelieren.Zusammen mit klinischen Daten ermöglicht uns diese Methode zu untersuchen, ob die allergischen Reaktionen auf Birkenpollen mit dem Allergengehalt in PM10 korrelieren. Bei Vorhandensein geeigneter anderer Antikörper könnte diese Methode auf den Nachweis weiterer Antigene auf Luftpartikeln ausgedehnt werden, wie beispielsweise LPS oder Allergene von Schimmelpilzen oder Hausstaubmilben.

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

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