Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen
23. Dezember 2016
Um Krebsmedikamente mit hoher Spezifität und reduzierten Nebenwirkungen an Tumorstellen zu bringen, sind neue Methoden auf Basis von Nanopartikeln erforderlich. Hier beschreiben wir disulfidvernetzte Mizellen, die durch Wasserstoffperoxid-vermittelte Oxidation leicht hergestellt werden können und in der Lage sind, unter einer reduzierenden Tumorumgebung effizient zu dissoziieren, um Nutzlasten freizusetzen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein einfaches und effektives Protokoll für die Synthese von wirkstoffbeladenen Disulfid-vernetzten Mizellen für die gezielte Wirkstoffabgabe bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Nanomedizin zu beantworten. Zum Beispiel, wie man effektiv stabile Nanoformulierungen herstellt.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, disulfidvernetzte Mizellen in großem Maßstab einfach zu synthetisieren, was für klinische Studien an Patienten äußerst wünschenswert ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie zwei Gramm monomethylterminiertes Polyethylenglykolmonoamin in einen Rundkolben. Fügen Sie zehn Milliliter wasserfreies DMF hinzu, um es aufzulösen.
Auf Eis chillen. Drei Äquivalente von Hydroxybenzotriazol, drei Äquivalente von DIC und drei Äquivalente von di-eth-moc-geschütztem Lysin werden in einen Rundkolben gegeben. Als nächstes fügen Sie zehn Milliliter wasserfreies DMF hinzu.
Rühren Sie die Mischung 20 Minuten lang auf einer magnetischen Rührplatte um. Dann wird die Mischung in den Rundkolben gegeben, der monomethylterminiertes Polyethylenglykol enthält. Nehmen Sie den Kolben mit rundem Boden aus dem Eisbad und rühren Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur um.
Sobald das Rühren abgeschlossen ist, bestätigen Sie den Abschluss der Reaktion, wie im Textprotokoll beschrieben. 200 Milliliter eiskalten Äther in den Reaktionskolben geben. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius Um das gefällte Polymer zu trennen.
Wiederholen Sie den Fällungs- und Zentrifugationsvorgang zweimal und lösen Sie das Produkt jedes Mal vor der Fällung in 10 Millilitern DMF auf. Waschen Sie das Polymer dann dreimal mit eiskaltem Äther ab. Schließen Sie das Rohr an eine Hochvakuumquelle an, um den restlichen Äther zu entfernen.
Geben Sie danach 20 Milliliter 20%4-Methylpiperidin in DMF zum Polymer. Rühren, bis die Auflösung abgeschlossen ist. Lassen Sie die Reaktion drei Stunden lang Spaß haben.
Nachdem Sie den Abschluss der Reaktion bestätigt haben, trocknen Sie das Polymerprodukt. Nun wird das Polymerzwischenprodukt Nummer zwei unter einem Vakuum erstellt, dann führen Sie weitere Schritte der Polymersynthese durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald das Polymerzwischenprodukt Nummer 10 hergestellt ist, wird es in einen Reaktionskolben überführt.
Fügen Sie 30 Milliliter wasserfreies DMF hinzu. In einem neuen Kolben werden 24 Äquivalente aktivierter Cholsäure in 20 Millilitern DMF gelöst. Fügen Sie dann 48 Äquivalente von N, N-Diisopropylethylamin hinzu.
10 Minuten rühren. Nach Beendigung des Rührens wird das Gemisch in den Reaktionskolben mit dem Polymerzwischenprodukt Nummer 10 überführt. Lassen Sie die Reaktion über Nacht laufen.
Am nächsten Tag bestätigen Sie den Abschluss der Reaktion und fällen das Polymerzwischenprodukt Nummer 11 aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie dann das Polymerzwischenprodukt in entionisiertem Wasser. Die Probe wird lyophilisiert, wodurch ein weißes Pulver entsteht.
Nach der Zubereitung der Mizelle werden 20 Milligramm Telodendrimer und fünf Milligramm PTX in einem Milliliter Chloroform gelöst. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer, um einen homogenen trockenen Polymerfilm zu erhalten. Rekonstituieren Sie die Folie mit einem Milliliter PBS durch Vortexen.
Dann 30 Minuten lang bei 40 Kilohertz beschallen. Fügen Sie 3% Wasserstoffperoxid hinzu, um die Thiolgruppen auf dem Telodendrimmer zu oxidieren. Führen Sie zusätzliche Vorbereitungs- und Überprüfungsschritte durch, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nachdem die Mizellenvorbereitung abgeschlossen ist, messen Sie die Größe und Größenverteilung der Mizellen mit einem dynamischen Lichtstreuinstrument. Führen Sie die Messungen bei Raumtemperatur durch und halten Sie die Mizellenkonzentration bei einem Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie als Nächstes eine Stammlösung von 7,5 Milligramm pro Milliliter Natriumdodecylsulfat in PBS vor.
Bereiten Sie dann eine Stammlösung von 1,5 Milligramm pro Milliliter aus disulfidvernetzten Mizellen in PBS vor. Unter Verwendung dieser Stammlösungen entsteht ein Gemisch, bei dem die endgültige SDS-Konzentration 2,5 Milligramm pro Milliliter beträgt. Und die Mizellenkonzentration beträgt 1,0 Milligramm pro Milliliter.
Laden Sie die Probe und messen Sie die Größe und Größenverteilung der Mizellenlösung in Zwei-Minuten-Intervallen. Nach der Entnahme von frischem Citratblut von Nacktmäusen zentrifugieren Sie eine Blutprobe von einem Milliliter bei 1.000 x g für 10 Minuten, um rote Blutkörperchen zu sammeln. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und resuspendieren Sie dann das Zellpellet mit PBS auf eine Endkonzentration von 2 %Mischen Sie 200 Mikroliter Erythrozytensuspension mit einer Lösung von 1,0 Milligramm pro Milliliter PTX NCMs.
Mischen Sie dann 200 Mikroliter Erythrozytensuspension mit einer Lösung von 1,0 Milligramm pro Milliliter PTX DCMs und inkubieren Sie diese Mischungen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubatorschüttler. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Mischungen bei 3.000 x g für fünf Minuten.
Übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands jeder Probe auf eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie danach ein Mikroplatten-Lesegerät, um die Absorption von freiem Hämoglobin bei 540 Nanometern zu messen. Wie mit dem Ellman-Test gemessen, erreichte die Umwandlungsrate von freien Thiolgruppen zu Disulfidbindungen nach 48 Stunden sauerstoffvermittelter Oxidation 85 %.
Hier wird ein Wasserstoffperoxid-vermitteltes Oxidationsverfahren als alternatives Verfahren eingesetzt. Die Conversion-Rate erreicht 88% in 30 Minuten. Das ist 96-mal schneller als der sauerstoffvermittelte Ansatz.
Mit diesem effizienteren Ansatz wurden über 50 Gramm Nanopartikel mit einer gemessenen Partikelgröße von 27 Nanometern bei einer engen Größenverteilung hergestellt. Die Stabilität von PTX-beladenen disufidvernetzten Mizellen wird auch unter stark mizellenschädigenden Bedingungen untersucht. Die Partikelgröße der Mizellen blieb im Laufe der Zeit konstant, was darauf hindeutet, dass sie intakt blieben.
Nach der Einführung von GSH in einer intrazellulären Konzentration blieb die Größe der mit Wirkstoffen beladenen Disulfid-vernetzten Mizellen 30 Minuten lang intakt und sank dann abrupt auf einen Nanometer. Dies bedeutet die Reduzierung einer kritischen Anzahl von Disulfidbindungen, eine Voraussetzung für die schnelle Dissoziation der Mizellen. Die repräsentativen Ergebnisse der hämolytischen Aktivität von PTX-beladenen Mizellen sind hier dargestellt.
Die PTX NCMs haben eine dosisabhängige Lysezahl der roten Blutkörperchen. PTX DCMs, die eine Disulfid-Vernetzung aufweisen, zeigen jedoch keine beobachtbaren hämolytischen Aktivitäten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer anderen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine gleiche Menge an 3%igem Wasserstoffperoxid für die Disulfidbildung hinzuzufügen. Nach diesem Verfahren kann ein Hämolyse-Assay durchgeführt werden, um die Blutverträglichkeit der disulfidvernetzten Mizellen zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Wirkstoffen beladene disulfidvernetzte Mizellen effektiv synthetisieren können.
Vergessen Sie nicht, dass einige dieser Chemikalien extrem gefährlich sein können und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Synthese von arzneimittelbeladenen, durch Disulfidbrücken vernetzten Mizellen vorgestellt, die auf die gezielte Arzneimittelabgabe in der Krebstherapie abzielen. Die Methode nutzt eine durch Wasserstoffperoxid vermittelte Oxidation zur Mizellenherstellung, die sich in reduzierenden Tumorumgebungen auflösen können, um therapeutische Wirkstoffe freizusetzen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanomedizin
- Krebstherapie
- Arzneimittelabgabesysteme
Hintergrund
- Die gezielte Arzneimittelabgabe ist entscheidend, um Nebenwirkungen bei der Krebsbehandlung zu minimieren.
- Nanopartikel bieten einen aussichtsreichen Ansatz, um Arzneimittel gezielt an Tumorstellen abzugeben.
- Disulfid-vernetzte Mizellen können synthetisiert werden, um die Arzneimittelstabilität und -freisetzung zu verbessern.
- Die durch Wasserstoffperoxid vermittelte Oxidation ist ein entscheidender Schritt im Syntheseprozess.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen und effektiven Protokolls zur Synthese von arzneimittelbeladenen Mizellen.
- Bewältigung der Herausforderungen bei der Herstellung stabiler Nanoformulierungen für klinische Anwendungen.
- Vereinfachung der großtechnischen Synthese von Mizellen für potenzielle Patientenstudien.
Verwendete Methoden
- Herstellung von monomethylierter, endständiger Polyethylenglykol-monoamin in wasserfreiem DMF.
- Oxidation durch Wasserstoffperoxid zur Bildung von Mizellen.
- Charakterisierung der Mizellen hinsichtlich Stabilität und Freisetzungsverhalten von Wirkstoffen.
- Beurteilung der Leistungsfähigkeit der Mizellen in einer reduzierenden Umgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synthese von Disulfid-überbrückten Mizellen.
- Die Mizellen zeigten eine wirksame Dissoziation in reduzierenden Umgebungen.
- Potenzial für die gezielte Abgabe von Krebstherapeutika.
- Skalierbare Herstellungsmethode, geeignet für klinische Studien.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll bietet eine geeignete Methode zur Herstellung von arzneimittelbeladenen Mizellen.
- Mizellen können die Spezifität der Arzneimittelabgabe an Tumore verbessern.
- Dieser Ansatz könnte die Nebenwirkungen herkömmlicher Krebstherapien verringern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung von Disulfid-überbrückten Mizellen für die gezielte Abgabe von Krebsmedikamenten und löst ein zentrales Engpassproblem bei der Übertragung von Nanomedizin. Durch die Nutzung der H₂O₂-vermittelten Oxidation erreicht die Methode eine 96-fach schnellere Vernetzung im Vergleich zu früheren Ansätzen, was die Herstellbarkeit für präklinische und klinische Studien unterstützt. Die resultierenden Nanopartikel weisen eine Stabilität in der Zirkulation auf und zeigen eine ausgelöste Freisetzung in reduzierenden Tumormikroumgebungen, wodurch der therapeutische Index verbessert und die Off-Target-Toxizität verringert wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Formulierung zytotoxischer Wirkstoffe wie Paclitaxel in stabile Nanotransporter für mechanistische Untersuchungen der tumorzielgerichteten Abgabe.
- Operativer Wert: Unterstützt die schnelle Erzeugung von Formulierungsvarianten, um Struktur-Wirkungs-Beziehungen in der Freisetzungskinetik von Wirkstoffen zu evaluieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine reproduzierbare Nanopartikelplattform zur Untersuchung von Freisetzungsprofilen von Wirkstoffen unter simulierten reduktiven Tumorbedingungen.
- Operativer Wert: Erzeugt eine enge Größenverteilung (27 nm), die für eine konsistente Assayleistung und regulatorische Vergleichbarkeit entscheidend ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Zeigt eine verminderte hämolytische Aktivität im Vergleich zu nicht vernetzten Mizellen, wodurch das Sicherheitsprofil hinsichtlich der Blutverträglichkeit verbessert wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Herstellung von Chargen mit mehr als 50 g, was toxikologische und pharmakokinetische Studien zur Vorbereitung einer IND-Anmeldung unterstützt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess der Nanomedizin von der frühen Formulierungsscreening bis zur präklinischen Validierung ein und ermöglicht einen iterativen Entwurf redoxreaktiver Abgabesysteme.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung, ob Disulfid-Vernetzung die tumorspezifische Arzneimittelanreicherung im Vergleich zum freien Wirkstoff verbessert.
- Screening: Stellt standardisierte Mizellen mit hoher Wirkstoffladeeffizienz bereit, um eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen in Zytotoxizitätsassays zu gewährleisten.
- Analytik: Erzeugt quantitative Daten zur Größe und Stabilität mittels DLS und Hämolyse-Assays, um die Leistung verschiedener Formulierungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase, indem die ausgelöste Freisetzung in intrazellulären reduktiven Umgebungen validiert wird (GSH-induzierter Größenabfall auf 1 nm).
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine modulare, auf Telodendrimeren basierende Plattform, die an unterschiedliche Wirkstoffe und gezielte Bindungsliganden angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der tumorspezifischen Freisetzung von Wirkstoffen durch validierte redoxabhängige Disassemblierung.
- Operativer Wert: Standardisierte, skalierbare Synthese mit zuverlässiger Kontrolle der Partikelgröße und hoher Wirkstoffbeladung.
- Strategischer Wert: Verringert das Risiko spätzeitiger Fehlschläge, indem der therapeutische Index durch minimierte Hämolyse und verbesserte Tumortargeting erhöht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Nanomedizin-Kandidaten durch skalierbare, GMP-kompatible Produktion.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Peptidchemie, Nanopräzipitation und Handhabung redoxsensitiver Polymere.
- Benötigt eine Infrastruktur für anhydrisches DMF, Wasserstoffperoxid, Dialyse und Lyophilisierung zur Polymersynthese.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Mizellenherstellung und Qualitätskontrolle (DLS, Hämolyse-Assay) für reproduzierbare Chargen voraus.
- Die Anpassung an alternative Wirkstoffe kann eine Optimierung der Lösungsmittelverdampfung und der Wirkstoffladeparameter erfordern.
- Praktische Einschränkung: Restliches Peroxid muss nach der Oxidation entfernt werden, um eine Degradation oder Toxizität des Wirkstoffs zu vermeiden.
