Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen In Vitro Trans Biotests

Das übergeordnete Ziel dieses standardisierten Verfahrens ist es, Wasserproben mit kommerziell erhältlichen, rezeptorbasierten Zellassays auf endokrin aktive Chemikalien zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Überwachung der Wasserqualität zu beantworten, z. B. sind endokrin aktive Chemikalien tatsächlich in der Probe vorhanden? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie viel schneller als die derzeitigen chemischen Methoden auf eine Gruppe endokrin aktiver Verbindungen analysieren kann.

Diese Technik kann bei der Diagnose von Problemen mit der Wasserqualität helfen, die sich aus dem Vorhandensein von endokrin wirksamen Chemikalien ergeben. Diese Methode gibt Aufschluss über Schadstoffe im Wasser, kann aber auch auf andere Umweltmatrizen wie Sedimente und Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie eine hohe Präzision bei der Anwendung von Pipettiertechniken erfordert.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Wasserprobe in Stammlösungen aus assayspezifischem Medium und Referenzchemikalie vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Lagern Sie das assayspezifische Medium für die Langzeitlagerung bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend 15 Mikroliter des entsprechenden chemischen Referenzmaterials in ein steriles Röhrchen zu 285 Mikrolitern Testmedium.

Mischen Sie die Probe, indem Sie auf und ab pipettieren. Geben Sie dann 200 Mikroliter 5%DMSO in das Testmedium in acht weitere Röhrchen. Übertragen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot von Röhrchen eins auf röhrchen zwei, um eine dreifache Verdünnungsreihe zu beginnen.

Mischen Sie die verdünnte Probe im zweiten Röhrchen gründlich mit einer Pipette. Übertragen Sie dann ein 100-Mikroliter-Aliquot von Röhrchen zwei auf Röhrchen drei. Setze diesen Vorgang für jede Tube fort.

Bereiten Sie dann eine Lösungsmittelkontrollprobe vor, indem Sie 10 Mikroliter DMSO in 190 Mikroliter Testmedium mischen. Sammeln und beschriften Sie als Nächstes vier neue Röhrchen. Geben Sie 95 Mikroliter Testmedium in das erste Röhrchen.

Fügen Sie dann fünf Mikroliter Wasserextrakt hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie 50 Mikroliter 5%DMSO im Testmedium in die anderen drei Röhrchen. Führen Sie dann eine zweifache Verdünnung durch, indem Sie 50 Mikroliter Lösung von einem Röhrchen in das nächste übertragen.

Beginnen Sie damit, ein Fläschchen mit ER- oder GR-Teilungszellen aus dem kryogenen Gefrierschrank zu nehmen. Tauen Sie die Zellen schnell auf, indem Sie das Fläschchen zwei Minuten lang unter leichtem Rühren in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad stellen. Dekontaminieren Sie dann das Fläschchen mit 70% Ethanol.

Stellen Sie es in eine biologische Sicherheitswerkbank der Klasse zwei. Öffnen Sie das Fläschchen mit aseptischen Techniken und überführen Sie die Zellen in 10 Milliliter Testmedium. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, wird der Überstand mit einer sterilen Glaspipette abgesaugt. Anschließend wird das Zellpellet in sechs Milliletern Testmedium resuspendiert. Mischen Sie fünf Mikroliter Zellsuspension mit fünf Mikrolitern vitaler Färbelösung.

Geben Sie dann ein Aliquot in eine Zählkammer. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Lichtmikroskop oder einem automatischen Zellzähler. Schätzen Sie dann die Dichte der lebenden Zellen in der Zellsuspension.

Bei Bedarf verdünnen, um eine endgültige Dichte von 550.000 lebenden Zellen pro Milliliter des Testmediums zu erhalten. Beginnen Sie mit der Erstellung eines Plattenlayouts, das eine neunstufige assayspezifische Kalibrierungskurve, QA/QC-Proben und mehrere Verdünnungen für jeden Wasserextrakt umfasst. Geben Sie 90 Mikroliter Assay-Medium in die replikationszellfreien Kontroll-Wells.

Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Pipettierreservoir. Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter Zellsuspension in die anderen Vertiefungen. Geben Sie 10 Mikroliter der verdünnten Proben in die entsprechenden Vertiefungen.

Decken Sie den Teller mit einem Deckel ab. Legen Sie die Platte dann 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einen 5%C02-Inkubator. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur ausgleichen.

Dann sollten die nächsten Schritte in Abwesenheit von direktem Licht durchgeführt werden. Bereiten Sie eine sechsfache Ladelösung nach Herstellerangaben vor. Geben Sie dann 20 Mikroliter der Ladelösung in jede Vertiefung

Geben Sie 10 Mikroliter Reagenz für die Zellviabilität in jede Vertiefung, um die Zytotoxizität des verdünnten Wasserextrakts zu bewerten. Versiegeln Sie die Platte mit Aluminium-Klebefolie. Inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie die Platte dem Mikroplatten-Reader mit Bodenablesefunktion hinzu. Messen Sie die Fluoreszenz und analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wurden vier 24-Stunden-Mischproben von behandeltem kommunalem Abwasser, sechs Stichproben von Oberflächenwasser aus Süßwassersystemen in Südkalifornien und ein Feldblindwert, der aus Reinstwasser bestand, analysiert.

Die ER-Aktivität wurde in sieben der 10 repräsentativen Wasserproben nachgewiesen, während die GR-Aktivität in vier nachgewiesen wurde. Die QA/QC-Leistungsrichtlinien für die Östrogenrezeptor- und Glukokortikoidrezeptor-Assays finden Sie hier. Die Studienergebnisse zur Zytotoxizität und Probengenauigkeit lagen gut innerhalb der Akzeptanzkriterien und validierten die Messungen der Wasserproben.

Die höchsten Bioassay-Äquivalentkonzentrationen wurden in den Sekundärabwässern gefunden, während die GR-Aktivität des Tertiärablaufs unterhalb der Nachweisgrenze des Bioassays lag. Ebenso wiesen die meisten Oberflächenwasserproben keine GR-Aktivität oberhalb der Nachweisgrenze auf und wiesen eine viel geringere ER-Aktivität auf als die sekundären Abwässer. Die Mehrzahl der Abwasserproben aus Kläranlagen zeigte eine Dosiswirkung oberhalb der Nachweisgrenze sowohl für ER- als auch für GR-Bioassays.

Die repräsentativen Ergebnisse für das mittlere Blau/Grün-Fluoreszenzverhältnis dieser Proben, aufgetragen gegen den relativen Anreicherungsfaktor, sind hier zu sehen. Diese Technik kann in 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie es versuchen, ist es wichtig, alle QA/QC-Richtlinien zu befolgen.

Diese Technik ebnete den Weg für Manager, alternative Ansätze zur Überwachung endokrin wirksamer Chemikalien im Wasser zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumazid gefährlich sein kann. Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einem ordnungsgemäß funktionierenden Abzug.