Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen

Das übergeordnete Ziel dieses standardisierten Verfahrens besteht darin, Wasserproben mithilfe kommerziell erhältlicher, rezeptorbasierter Zelltests auf endokrin wirksame Chemikalien zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wasserqualitätsüberwachung zu beantworten, beispielsweise, ob endokrin wirksame Chemikalien tatsächlich in der Probe vorhanden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Gruppe endokrin aktiver Verbindungen wesentlich schneller analysieren kann als die derzeitigen chemischen Methoden.

Diese Technik kann dabei helfen, Probleme mit der Wasserqualität zu diagnostizieren, die durch das Vorhandensein endokrin wirksamer Chemikalien verursacht werden. Diese Methode liefert Erkenntnisse über Kontaminanten im Wasser, kann aber auch auf andere Umweltmatrices wie Sedimente und Gewebe angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, häufig Schwierigkeiten, da sie eine hohe Präzision bei der Anwendung von Pipettiermethoden erfordert.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Wasserprobe in Stammlösungen des assayspezifischen Mediums und der Referenzchemikalie vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Lagern Sie das assayspezifische Medium bei vier Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Geben Sie anschließend 15 Mikroliter der geeigneten Referenzchemikalien-Stammlösung in 285 Mikroliter Assay-Medium in einem sterilen Gefäß.

Mischen Sie die Probe durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter 5 % DMSO im Assay-Medium zu acht weiteren Röhrchen. Übertragen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot aus Röhrchen eins in Röhrchen zwei, um eine dreifache Verdünnungsreihe zu beginnen.

Mischen Sie die verdünnte Probe in Röhrchen zwei gründlich mit einer Pipette. Übertragen Sie anschließend eine 100-Mikroliter-Aliquot aus Röhrchen zwei in Röhrchen drei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Röhrchen.

Dann bereiten Sie eine Lösungsmittelkontrolle vor, indem Sie 10 Mikroliter DMSO in 190 Mikroliter Assay-Medium mischen. Sammeln und beschriften Sie anschließend vier neue Röhrchen. Geben Sie 95 Mikroliter Assay-Medium in das erste Röhrchen.

Danach fünf Mikroliter Wasserextrakt hinzufügen und gründlich mischen. Zu den anderen drei Reagenzgläsern 50 Mikroliter 5 % DMSO im Testmedium hinzufügen. Anschließend eine Verdünnung in Zweifachschritten durchführen, indem 50 Mikroliter Lösung von einem Reagenzglas in das nächste übertragen werden.

Beginnen Sie damit, ein Gefäß mit ER- oder GR-Teilungs-arrestierten Zellen aus dem kryogenen Gefrierschrank zu entnehmen. Tauen Sie die Zellen schnell auf, indem Sie das Gefäß für zwei Minuten in ein Wasserbad mit 37 °C stellen und dabei leicht schütteln. Desinfizieren Sie anschließend das Gefäß mit 70 % Ethanol.

Stellen Sie es in einen Sicherheitswerkbank der Klasse zwei. Öffnen Sie das Gefäß unter aseptischen Bedingungen und überführen Sie die Zellen in 10 Milliliter Assay-Medium. Zentrifugieren Sie bei 200 × g für fünf Minuten.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine sterile Glaspipette, um den Überstand abzusaugen. Suspendieren Sie dann das Zellpellet erneut in sechs Milliliter Assay-Medium. Mischen Sie fünf Mikroliter Zellsuspension mit fünf Mikrolitern Vitalfarblösung.

Fügen Sie dann eine Aliquotprobe in eine Zählkammer hinzu. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mithilfe eines Lichtmikroskops oder eines automatischen Zellzählgeräts. Schätzen Sie anschließend die Dichte der lebenden Zellen in der Zellsuspension.

Falls erforderlich verdünnen, um eine endgültige Dichte von 550.000 lebenden Zellen pro Milliliter Testmedium zu erhalten. Erstellen Sie zunächst ein Plattenlayout, das eine neunpunktbasierte, assayspezifische Kalibrierungskurve, QA/QC-Proben und mehrere Verdünnungen für jeden Wasserextrakt umfasst. Geben Sie 90 Mikroliter Testmedium in die replikativen zellfreien Kontrollmulden.

Geben Sie die Zellsuspension in ein steriles Pipettierreservoir. Fügen Sie dann mithilfe einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter Zellsuspension in die anderen Vertiefungen hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter der verdünnten Proben in die entsprechenden Vertiefungen.

Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab. Anschließend stellen Sie die Platte 16 Stunden lang in einen Inkubator mit 5% CO₂ bei 37 Grad Celsius. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur akklimatisieren.

Die anschließenden Schritte sollten in Abwesenheit von direktem Licht durchgeführt werden. Bereiten Sie eine 6x-Lösung zum Beladen gemäß den Herstelleranweisungen vor. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter der Beladelösung in jedes Brunnenloch.

Geben Sie 10 µL Reagenz zur Bestimmung der Zellviabilität in jede Vertiefung, um die Zytotoxizität des verdünnten Wasserextrakts zu bewerten. Versiegeln Sie die Platte mit einem aluminiumbeschichteten Haftfilm. Anschließend inkubieren Sie die Platte zwei Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Nach Abschluss der Inkubation die Platte in den Mikroplattenreader mit Bottom-Reading-Funktion geben. Die Fluoreszenz messen und die Daten analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wurden vier 24-Stunden-Kompositsproben von behandeltem kommunalem Abwasser, sechs Einzelproben von Oberflächenwasser aus Süßwassersystemen in Südkalifornien sowie eine Feldprobe aus ultrareinem Wasser analysiert.

Die ER-Aktivität wurde in sieben von zehn repräsentativen Wasserproben nachgewiesen, während die GR-Aktivität in vier Proben festgestellt wurde. Die Leitlinien für die Qualitätssicherung/Qualitätskontrolle der Assays für den Östrogenrezeptor und den Glukokortikoidrezeptor sind hier ersichtlich. Die Untersuchungsergebnisse für Zytotoxizität und Probengenauigkeit lagen deutlich innerhalb der Annahmekriterien, wodurch die Messungen an den Wasserproben bestätigt wurden.

Die höchsten bioassay-äquivalenten Konzentrationen wurden in den Sekundärausläufen gefunden, während die GR-Aktivität des Tertiärauslaufs unterhalb der bioassay-basierten Nachweisgrenze lag. Ebenso wiesen die meisten Oberflächenwasserproben keine GR-Aktivität über der Nachweisgrenze auf und zeigten deutlich niedrigere ER-Aktivitätsniveaus als die Sekundärausläufe. Die Mehrheit der Proben von Kläranlagenausläufen zeigte eine dosisabhängige Antwort oberhalb der Nachweisgrenze in den Bioassays für ER und GR.

Die repräsentativen Ergebnisse für das mittlere Verhältnis von blauer zu grüner Fluoreszenz dieser Proben, aufgetragen gegen den relativen Anreicherungsfaktor, sind hier dargestellt. Diese Technik kann innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung ist es wichtig, alle Richtlinien für Qualitätssicherung und Qualitätskontrolle (QA/QC) zu befolgen.

Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Manager alternative Ansätze zur Überwachung endokriner Disruptoren in Wasser untersuchen konnten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumazid gefährlich sein kann. Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise die Arbeit in einer ordnungsgemäß funktionierenden Abzugshaube.