Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Generierung eines Proteins auf Basis der extrazellulären Domäne des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins oder MOG, das zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis oder EAE verwendet werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht es jedem Labor, MOG-Protein herzustellen, um es als Antigen zur Induktion von EAE zu verwenden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es nicht auf spezielle Geräte zur Handhabung von Proteinen angewiesen ist, sondern dass Sie Standardgeräte verwenden können, die in fast jedem Immunologielabor zu finden sind.

Nun, dieses Protokoll wurde für das MOG-Tag-Protein basierend auf der Mausversion optimiert, es sollte auch für andere MOG-Proteinexpressionssysteme funktionieren, die ein Hestate zur Reinigung enthalten. Beimpfen Sie fünf Milliliter sterilisierte Brühe mit dem BL 21 MOG Tag Glycerinfond und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 U/min. 500 Mikroliter Ampicillin mit 100 Milligramm pro Milliliter werden in jeden der 500 Milliliter Kolben mit 500 Millilitern sterilem LB gegeben. Übertragen Sie je einen Milliliter der Nachtkultur in jeden der beiden Kolben mit LB-Brühe.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für fünf Stunden oder bis zu einer optischen Dichte von 0,6. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, werden 0,5 Milliliter eines molaren IPTG in jeden Kulturkolben gegeben. Inkubieren Sie den Kolben, stellen Sie ihn vier Stunden lang auf 37 Grad Celsius und 200 U/min ein und dann über Nacht auf Raumtemperatur und 75 U/min.

Verteilen Sie die Kulturen gleichmäßig auf 250-Milliliter-Flaschen, die mit der Hochgeschwindigkeitszentrifugation kompatibel sind, und halten Sie die Flaschen von diesem Zeitpunkt an auf Eis. Pelletieren Sie die Bakterienzellen bei 22.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren und kombinieren Sie alle Bakterienpellets in insgesamt 30 Millilitern Lysatpuffer.

Übertragen Sie dieses Volumen in ein etwa unteres 50-Milliliter-Röhrchen, das eine Hochgeschwindigkeitszentrierung ermöglicht. Legen Sie diese Röhre für 30 Minuten in ein 30 Grad Celsius heißes Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen während der Inkubationszeit zweimal, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Transportieren Sie das Röhrchen nach der Inkubation auf Eis und beschallen Sie die Lösung bei 20 Kilohertz und einer Amplitude von 70 %, pulsieren Sie drei Sekunden lang und aus für drei Sekunden für fünf Impulse, beschallen Sie die Lösung für insgesamt sechs Runden von fünf Impulsen, so dass die Lösung zwischen den Runden im Eis abkühlen kann. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, suspendieren Sie dann das Pellet in 30 Millilitern Puffer A und inkubieren Sie die Lösung drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation die Lösung wie zuvor auf Eis beschallen, dann 17,2 Gramm Guanidin HCl zur Lösung geben.

Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis, um das MOG-Tag-Protein zu lösen. Um das Nickelharz aufzuladen und auszugleichen, waschen Sie das Harz zuerst, indem Sie 40 Milliliter Wasser in jedes Röhrchen mit Harz geben. Legen Sie die Rohre waagerecht auf eine Wippe und lassen Sie sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius rühren.

Wenn Sie fertig sind, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4500 mal g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand durch Pipettieren, um eine Störung des Pellets zu vermeiden. Geben Sie dann 40 Milliliter Ladungspuffer in jedes Röhrchen.

Setzen Sie die Röhrchen auf eine Wippe und lassen Sie sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius rühren, bevor Sie erneut wie zuvor zentrifieren. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 40 Milliliter Puffer B in die Röhrchen. Setzen Sie die Röhrchen auf eine Wippe und lassen Sie sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius rühren, bevor Sie die Röhrchen erneut mit Harz zentrifieren.

Um das MOG-Tag-Protein zu reinigen, übertragen Sie das gesamte Volumen des gelösten Proteins in das erste Röhrchen mit dem Nickelharz. Stellen Sie das Röhrchen nach dem Mischen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius waagerecht auf eine Wippe. Nachdem das Röhrchen acht Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 4500 mal g zentralgeschmolzen wurde, überträgt man diesen Überstand auf das zweite Röhrchen mit Nickelharz und inkubiert wie zuvor.

In der Zwischenzeit wird das Nickelharz im ersten Röhrchen in 40 Milliliter Evolutionspuffer resuspendiert und das Röhrchen fünf Minuten lang waagerecht bei vier Grad Celsius auf eine Wippe gestellt, bevor man wie bisher zentrifiert. Der Überstand, der das erwähnte MOG-Tag-Protein enthält, wird in eine 250-Milliliter-Flasche mit der Aufschrift "gereinigtes MOG-markiertes Protein" übertragen. Bewahren Sie diese Flasche bei vier Grad Celsius auf.

Bei jedem Elutionsschritt wird der resultierende Überstand in dieser Flasche gepoolt. Geben Sie 40 Milliliter Streifenpuffer zu dem in der ersten Tube vorhandenen Nickel und legen Sie es fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius waagerecht auf eine Wippe. Das Röhrchen zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das aufgestiegene Nickel wie zuvor wieder auffüllen.

Wenn Sie fertig sind, fahren Sie mit der zweiten Röhre fort, wie es bei der ersten Röhre der Fall war. Insgesamt vier Runden der Absorption des gelösten Proteins auf das geladene Nickelharz und der Elution werden den größten Teil des Proteins zurückgewinnen. Schneiden Sie etwa 30 Zentimeter des Dialyseschlauchs aus Schlangenhaut ab.

Sichern Sie ein Ende mit einem verriegelbaren Hämostaten, indem Sie das Ende der Schlangenhaut dreimal umklappen und das gefaltete Ende mit dem Hämostaten festklemmen. Füllen Sie die Schlangenhaut mit verdünntem MOG-Tag-Protein. Entferne dann alle Luftblasen von der Schlangenhaut, indem du sie aus dem offenen Ende herausdrückst.

Verschließen Sie schließlich das andere Ende des Schlauchs mit einem zweiten verriegelnden Hämostaten. Füllen Sie als Nächstes einen großen Eimer mit einem Liter eines x Acetatpuffers mit vier molaren Guanidin. Legen Sie bis zu zwei Abschnitte des Dialyseschlauchs mit dem MOG-Tag-Protein in den Eimer.

Befestigen Sie die Hämostaten mit Klebeband an der Seite des Eimers, damit sich ein magnetischer Rührstab ungehindert im Boden drehen kann. Stellen Sie den Eimer in einem vier Grad Celsius warmen Raum auf eine magnetische Schürzenplatte und schalten Sie ihn auf eine langsame Rotationsgeschwindigkeit ein. Die Dialyse dauert mindestens drei Tage, um die Menge an Guanidin im Puffer allmählich zu reduzieren.

Überprüfen Sie regelmäßig, ob der Schlauch intakt ist und die Enden fest verschlossen sind. Geben Sie nach vier bis fünf Stunden einen Liter eines x Acetatpuffers in den Dialyseeimer. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle vier bis fünf Stunden für insgesamt drei Mal, um insgesamt vier Liter im Eimer zu erhalten.

Nachdem Sie die Hälfte des Puffers in den Eimer geworfen haben, füllen Sie ihn mit einem Liter eines x Acetatpuffers auf und stellen Sie den Schlauch und den Rührstab auf. Zum Schluss ersetzst du das gesamte Volumen von vier Litern im Eimer durch vier Liter frischen One x Acetat-Puffer und lässt es vier bis fünf Stunden lang rühren. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, führen Sie diesen Schritt am Tag der Proteinkonzentration durch.

Um das MOG-Tag-Protein zu konzentrieren, legen Sie einen Stift mit Aluminiumfolie aus und bedecken Sie die Aluminiumfolie mit PEG 3350 und PEG 1000 im Verhältnis eins zu eins. Das PEG 3350 kann helfen, die Proteinaggregation während der Konzentration zu verhindern, und es ist ein wirksames Kryokonservierungsmittel. Legen Sie das MOG-Tag-Protein, das Schlangenhautschläuche enthält, auf die Aluminiumfolie und bedecken Sie sie mit PEG 8000.

Lassen Sie dies bei Raumtemperatur ruhen und überprüfen Sie die Lautstärke regelmäßig, bis die Lautstärke gleich oder unter der geschätzten endgültigen Lautstärke liegt. Wenn der Pen während des Konzentrationsprozesses mit Wasser übersättigt wird, stellen Sie eine frische Pfanne mit Alufolie und PEG auf. Proteinproben, die während des Aufreinigungsprotokolls entnommen oder auf einem SDS-Seitengel ausgeführt werden, um die Reinheit zu bestätigen.

Es wird ein repräsentatives Gel angezeigt, das den hochgereinigten MOG-Tag bei 31,86 Kilodalton zeigt. Um zu überprüfen, ob das MOG-Tag-Protein korrekt gefaltet ist, wurde die Bindung des MOG-Tag-Proteins an CD19-positive, CD4-negative, neun B-Zellen aus Lymphknoten von entweder Wildtyp-C57-Black-Six-Mäusen oder IgH-MOG-Mäusen, die eine Immunglobulin-Schwerkette exprimieren, die spezifisch für das MOG-Protein ist, mittels Durchflusszytometrie untersucht. Dieses Protokoll erfordert einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen von Anfang bis Ende.

Während der gesamten Isolierung ist es wichtig, den Überblick über das Protein zu behalten und sich daran zu erinnern, was aufbewahrt und was verworfen werden muss. Vergessen Sie nicht, wenn Sie Nickelsulfat-Hexahydrat verwenden, das zum Aufladen des Nickelharzes verwendet wird, äußerst gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um das Einatmen oder den Kontakt mit der Haut oder den Augen zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr eigenes MOG-Tag-Protein herstellen und reinigen können.

Nach der Reinigung kann das MOG-Tag-Protein in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert und als Immunisierung zur Induktion von EAE verwendet werden. Die durch den MOG-Tag induzierte EAE kann verwendet werden, um die Beteiligung mehrerer Zelltypen wie CD4- oder CDAT-Zellen oder B-Zellen an der Autoimmunität des Zentralnervensystems zu untersuchen. Im Gegensatz zu kurzen Peptiden, die MHC-beschränkt sind, kann das Proteinantigen in jedem Mäusestamm verwendet werden.