Name: Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Lernen Sie die Herstellung und Reinigung von Maus-MOG-Protein für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-Studien. Diese zugängliche Methode ermöglicht die Erforschung von Multipler Sklerose.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Multiple Sclerosis Society of Canada unterstützt. RWJ ist Preisträger des Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Scholarship Award.

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von MOG - Tag - Protein beschrieben und wie zur Erzeugung reinen MOG 1-125 aus dem MOG - Tag - Protein. Dieses Protokoll wird sowohl anhand His-Tag - basierte Proteinreinigungsverfahren auf Standard sowie einem zuvor beschriebenen Protokoll für die Erzeugung eines älteren MOG-basierten Protein - 15. Obwohl es hier nicht beschrieben wird, ist die primäre Verwendung des MOG - Tag - Protein EAE durch Immunisierung mit Pr...

MS ist eine menschliche Krankheit durch eine chronische Entzündung und Neurodegeneration des ZNS charakterisiert, die in Richtung Myelin gerichtet durch eine Autoimmunreaktion angetrieben wird gedacht werden. Der Verlust von Myelin und Axonen im Laufe der Zeit führen zur allmählichen Rückgang der kognitiven und motorischen Funktion 1. &quot;Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis&quot; ist ein Oberbegriff für Tiermodellen von Autoimmunkrankheit zu CNS Myelin gerichtet. Wie menschliche MS wird EAE typischerweise durch Immunzellinfiltration des ZNS gekennzeichnet und in einigen Fällen Demyelinisierung 2. Um jedoch zu der Grad zu einem gegebenen EAE-Modell menschlichen MS teil ähnelt, hängt von der Spezies oder Stamm verwendet und von der Komplexität der zugrunde liegenden anti-Myelinautoimmunreaktion. Anti-Myelin-Autoimmunität kann experimentell auf verschiedene Weise hervorgerufen werden, aber die am häufigsten verwendete Methode ist heute Mäuse mit einem kurzen Peptid von Aminosäuren zu immunisieren, die immunodominante CD4 nachahmen <soben&gt; + T - Zell - Epitop eines Myelinprotein. Dies stellt die Mindestanforderung eine pathogene Reaktion zu induzieren. Vielleicht die häufigste von diesen ist ein 21 Aminosäure-Peptid , das von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein abgeleitet ist (MOG 35-55), die EAE verwendet wird , 3 in C57BL / 6 - Mäusen zu induzieren. Jedoch für einige experimentelle Zwecke ist es wünschenswert oder sogar notwendig, mit größeren Proteinantigenen zu immunisieren und tatsächlich gibt mehrere Vorteile dieses über Immunisierung mit kurzen Peptid. Erstens, weil der MHC-Restriktion, sind kurze Peptide Regel nur dann wirksam, in einem sehr begrenzten Bereich von Spannungen, während größere Proteinantigene, entweder das gesamte Protein oder einen bestimmten Domäne darstellt normalerweise in mehreren Inzuchtmäusestämmen zur Präsentation verarbeitet werden kann, oder sogar in anderen Spezies 4. Zweitens ist ein größeres Protein-Antigen in der Lage, eine komplexere Immunantwort enthält mehrere Arten von Lymphozyten in Antigenerkennung induzierende, anstatt limiting Antigen - Erkennung an CD4 + T - Zellen. Beispielsweise B-Zellen über den B-Zell-Rezeptor (BCR) interagieren direkt mit ganzen nicht prozessierten Proteins. Wir und andere haben gezeigt, dass B - Zellen durch MOG 35-55 Immunisierung aktiviert gezeigt nicht erkennen MOG - Protein 5. Da B - Zellen 6, die vor kurzem in der menschlichen MS gezeigt wurden Modelle EAE eine pathogene Rolle zu spielen , die B - Zellen bei Autoimmunpathologie integrieren zunehmend an Bedeutung gewinnen . Trotz der Vorteile der größeren Protein-Antigene unter Verwendung von EAE zu induzieren, bleiben einige im Handel erhältliche Quellen für solche Proteine. Tatsächlich, während kurze Peptide wie MOG 35-55 sehr schnell synthetisiert werden kann und bei relativ niedrigen Kosten, die kommerziellen Möglichkeiten für MOG Proteins sind begrenzt und die Kosten wesentlich zu erwerben. Dennoch gibt es mehrere Expressionsvektoren für Forschungsgruppen verfügbar MOG extrazelluläre Domäne (MOG 1-125) selbst zu erzeugen. However, alle der Expressionssysteme, die in der Literatur identifiziert worden sind , auf älteren Technologien basieren , die seit mit effizienter Expressionssysteme 7 ersetzt wurden. Ferner sind die meisten 8 basierend auf Ratten- oder menschlichen MOG. Für einige Untersuchungen der Autoimmunität bei Mäusen, ein Antigen auf der Maus MOG Autoantigen basiert, ist bevorzugt. Schließlich werden alle MOG-basierten Proteine , die wir identifiziert haben, entweder kommerziell oder als Expressionsvektoren, Fusionsproteine zusätzliche Aminosäuren zum MOG 1-125 Base enthält. Dazu gehören ein Tag für die Reinigung und in der Regel andere Sequenzen als auch, von denen viele mit einer Funktion, die wir nicht in der Lage waren, zu identifizieren. Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir einen für ein Protein neuartige Fusion basiert auf der Maus MOG extrazelluläre Domäne an einen Tag fusionierten thioredoxin mit dem bekannten Unlösbarkeit von MOG - Protein 5 zu bekämpfen. Die Tag-Sequenz enthält auch eine 6xHis-Sequenz für die Reinigung und eine TEV-Protease cleAvage Seite, die für die vollständige Entfernung aller Tag-Sequenzen ermöglicht, falls gewünscht. Dies ist die einzige Methode , die wir kennen reinen MOG 1-125 Protein zu erzeugen. Zur Produktion großer Mengen an Protein zu erleichtern, wurde die MOG 1-125 - Sequenz für die bakterielle Expression-Kodon - optimierten und das MOG - Tag - Fusionsprotein wurde in den pET-32 - Expressionssystem eingesetzt wird . Hier beschreiben wir ausführlich in das Protokoll zu erzeugen und MOG - Tag - Protein zu reinigen und rein MOG 1-125, mit nicht spezialisierten Ausrüstung zur Verfügung zu den meisten Immunologie Laboratorien.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot Labor</td><td></td><td>Diese Bakterien werden benötigt, um das MOGtagProtein herzustellen. Glycerinbestände dieser Bakterien sind auf Anfrage erhältlich.</td></tr><tr><td>LB Brühe Müller</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Rekonstituieren Sie das Pulver zu 50% Ethanol/ 50% H2O bei 100 mg/ml. Bei -20 μC lagern.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Rekonstituieren Sie das Pulver in H2O bei 1M und lagern Sie es bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Hühner-Ei-Lysozym</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Rekonstituieren in H2O bei 50 mg/ml und lagern bei -80 °C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td>Kommerzielle phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist nicht erforderlich, jede im Labor hergestellte phosphatgepufferte Standardkochsalzlösung ist ausreichend.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>Die Qualität muss mehr als 98% Reinheit betragen.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Nickel (II)-sulfat</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Sein Bindeharz</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>In 20 % Ethanol 80 % H2O bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Wasserfreies Ethanol</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EAAN</td><td>Nach Bedarf mit Wasser verdünnen.</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin Standard</td><td>Bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad Protein Assay Farbstoff Reagenzkonzentrat</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure, Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Schlangenhaut-Dialyseschlauch</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Dieses Reagenz sollte nicht außerhalb eines Abzugs gehandhabt werden.</td></tr><tr><td>AcTEV-Protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>Die Herstellung Ihrer eigenen TEV-Protease kann mit (https://www.addgene.org/8827/) durchgeführt und wie in der Referenz gereinigt werden 17</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon Mikroplatten-Spektrometer</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Dieses Gerät verwendet die Datenanalysesoftware Gen5.</td></tr><tr><td>Gen5 Datenanalyse-Software</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Entsalzungssäulen</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glycin Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>vorgefertigtes 12% Polyacrylamid-Gel</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Schnellfärbereagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ Imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Weißlicht-Probentablett</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Wird zusammen mit dem Gel Dock EZ Imager für Coomassie-Blauflecken verwendet</td></tr><tr><td>Proteinleiter</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

einfache und effiziente herstellung und reinigung von maus-myelin-oligodendrozyten-glykoprotein für experimentellen autoimmunen enzephalomyelitis studies

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), von der angenommen wird, dass sie als Folge von Autoimmunreaktionen auftritt, die auf Myelin abzielen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das häufigste Tiermodell für ZNS-Autoimmunerkrankungen und wird typischerweise durch Immunisierung mit kurzen Peptiden induziert, die immundominante CD4+ T-Zell-Epitope von Myelinproteinen repräsentieren. B-Zellen erkennen jedoch unverarbeitetes Protein direkt, und die Immunisierung mit kurzem Peptid aktiviert keine B-Zellen, die das native Protein erkennen. Da jüngste klinische Studien mit B-Zell-depletierenden Therapien bei MS darauf hindeuten, dass B-Zellen bei der Krankheitsauslösung beim Menschen eine Rolle spielen, besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen, die die B-Zell-Erkennung von Autoantigenen beinhalten. Zu diesem Zweck haben wir ein neues Fusionsprotein generiert, das die extrazelluläre Domäne der Mausversion des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG) sowie N-terminale Fusionen eines His-Tags zur Aufreinigung und des Thioredoxin-Proteins zur Verbesserung der Löslichkeit (MOG-Tag) enthält. Eine Protease-Spaltstelle des Tabakätzvirus (TEV) wurde eingebaut, um die Entfernung aller Tag-Sequenzen zu ermöglichen, so dass nur die reine extrazelluläre Domäne MOG1-125 übrig blieb. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, bei dem nur Standard-Laborgeräte verwendet werden, um große Mengen an reinemMOG-Tag oder MOG1-125 herzustellen. Dieses Protokoll erzeugt konstant über 200 mgMOG-Tag-Protein. Die Immunisierung mitMOG-Tag oder MOG1-125 erzeugt eine Autoimmunreaktion, die pathogene B-Zellen umfasst, die das native Maus-MOG erkennen.

Nachdem die Reinigung abgeschlossen ist, gesammelten Proben in den Schritten 1.4, 2.1, 3.4, und das Endprodukt aus Schritt 6.4 sollte auf einem Proteingel (3A) betrieben werden. MOG - Tag sollte zuerst erscheinen als 31,86 kDa - Bande in der T O / N Probe, aber nicht 0 T, und sollte die einzige Band in der letzten reinen Produkt. Um zu testen , ob das MOG - Tag - Protein korrekt gefaltet ist, kann das MOG - Tag - Pro...

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll, das nur grundlegende Laborgeräte verwendet, um große Mengen eines Fusionsproteins zu erzeugen und zu reinigen, das das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein der Maus enthält. Dieses Protein kann verwendet werden, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis zu induzieren, die sowohl von T- als auch von B-Zellen angetrieben wird.

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein Protein herzustellen, das auf der extrazellulären Domäne des myelinhaltigen Oligodendrozyten-Glykoproteins oder MOG basiert und zur Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) verwendet werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht es jedem Labor, MOG-Protein als Antigen zur EAE-Induktion herzustellen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass keine spezielle Ausrüstung für die Proteinhandhabung erforderlich ist, sondern stattdessen Standardgeräte verwendet werden können, wie sie in nahezu jedem Immunologielabor vorhanden sind.Nun, dieses Protokoll wurde für das MOG-Tag-Protein basierend auf der Mausversion optimiert und sollte auch für andere MOG-Protein-Expressionssysteme funktionieren, die ein Hestat zur Reinigung enthalten. Inokulieren Sie fünf Milliliter sterilisierten Brühe mit dem BL21 MOG-Tag-Glycerinbestand und inkubieren Sie diese über Nacht bei 37 Grad Celsius und 200 U/min. Geben Sie 500 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin-Lösung zu jedem der zwei 500-Milliliter-Kolben, die jeweils 500 Milliliter sterile LB-Bouillon enthalten. Übertragen Sie ein Milliliter der Übernachtkultur in jeden der beiden Kolben mit LB-Brühe.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für fünf Stunden oder bis zu einer optischen Dichte von 0,6. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, geben Sie 0,5 Milliliter einer einmolaren IPTG-Lösung zu jedem Kulturkolben hinzu. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für vier Stunden und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur und 75 U/min.Verteilen Sie die Kulturen gleichmäßig auf 250-Milliliter-Flaschen, die für die Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet sind, und lagern Sie die Flaschen ab diesem Zeitpunkt auf Eis. Pelletieren Sie die bakteriellen Zellen bei 22.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren und vereinigen Sie alle bakteriellen Pellets in insgesamt 30 Milliliter Lysepuffer.Überführen Sie dieses Volumen in ein ungefähr 50 ml fassendes Röhrchen, das für die Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet ist. Stellen Sie dieses Röhrchen für 30 Minuten in ein Wasserbad mit 30 Grad Celsius. Während der Inkubationszeit schütteln Sie das Röhrchen zweimal, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.Nach der Inkubation das Röhrchen auf Eis bringen und die Lösung bei 20 Kilohertz und einer Amplitude von 70 % fünf Impulse lang jeweils drei Sekunden lang ein- und drei Sekunden lang ausschalten. Die Lösung insgesamt sechs Runden zu je fünf Impulsen beschallen, wobei die Lösung zwischen den Runden auf Eis abkühlen kann. Anschließend die Lösung bei 24.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und dann das Pellet in 30 Milliliter Puffer A resuspendieren und die Lösung drei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Lösung erneut wie zuvor auf Eis beschallen und anschließend 17,2 Gramm Guanidin-HCl zur Lösung hinzufügen.Incubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis, um das MOG-Tag-Protein zu löslichen. Um das Nickelharz zu beladen und zu equilibrieren, waschen Sie zunächst das Harz, indem Sie 40 Milliliter Wasser zu jedem Röhrchen mit Harz hinzufügen. Legen Sie die Röhrchen horizontal auf einen Schüttler und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius agitieren.Nach Beendigung die Röhrchen bei 4500 × g für acht Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen, um das Pellet nicht aufzuwirbeln. Anschließend 40 Milliliter Ladepuffer zu jedem Röhrchen hinzufügen.Überführen Sie die Röhrchen auf einen Schüttler und lassen Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius schütteln, bevor erneut wie zuvor zentrifugiert wird. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 40 Milliliter Puffer B zu den Röhrchen hinzu. Überführen Sie die Röhrchen auf einen Schüttler und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius schütteln, bevor die Röhrchen mit der Harzmatrix erneut zentrifugiert werden.Um das MOG-Tag-Protein zu reinigen, überführen Sie das gesamte Volumen des solubilisierten Proteins in das erste Röhrchen mit Nickelsäule. Nach dem Mischen legen Sie das Röhrchen horizontal auf einen Schüttler bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Zentrifugation des Röhrchens bei 4500 × g für acht Minuten bei vier Grad Celsius überführen Sie diesen Überstand in das zweite Röhrchen mit Nickelsäule und inkubieren wie zuvor. Unterdessen das Nickelharz im ersten Reagenzglas in 40 Milliliter Elutionspuffer resuspendieren und das Gefäß fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius horizontal auf einen Schüttler stellen, bevor erneut wie zuvor zentrifugiert wird. Das Überstand, der das angesprochene MOG-Tag-Protein enthält, in eine mit „gereinigtes MOG-Tag-Protein“ beschriftete 250-Milliliter-Flasche überführen. Diese Flasche bei vier Grad Celsius aufbewahren.Sammeln Sie bei jedem Elutionsschritt das resultierende Überstand in dieser Flasche. Geben Sie 40 Milliliter Abpuffpuffer zu dem Nickel in dem ersten Reagenzglas hinzu und legen Sie es fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius horizontal auf einen Schüttler. Zentrifugieren Sie das Reagenzglas, entsorgen Sie den Überstand und laden Sie das Nickel erneut auf, wie zuvor beschrieben.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem zweiten Reagenzglas genauso fort wie mit dem ersten. Insgesamt vier Runden der Absorption des solubilisierten Proteins an das beladene Nickelsäulenharpfen und der anschließenden Elution ermöglichen die Gewinnung des Großteils des Proteins. Schneiden Sie etwa 30 Zentimeter Schlangenhaut-Dialyse-Schlauch ab.Befestigen Sie ein Ende mit einer Klemmzange, indem Sie das Ende der Schlangenhaut dreimal umschlagen und das gefaltete Ende mit der Zange festklemmen. Füllen Sie die Schlangenhaut mit verdünntem MOG-Tag-Protein. Entfernen Sie anschließend alle Luftblasen aus der Schlangenhaut, indem Sie sie aus dem offenen Ende herausdrücken.Schließlich verschließen Sie das andere Ende des Schlauchs mit einem zweiten Absperrklemme. Füllen Sie anschließend einen großen Eimer mit einem Liter 1× Acetatpuffer mit vier Molar Guanidin. Geben Sie bis zu zwei Abschnitte Dialyse-Schläuche, die das MOG-Tag-Protein enthalten, in den Eimer.Befestigen Sie die Hämostaten mithilfe von Klebeband an der Seite des Eimers, sodass genügend Platz bleibt, damit sich ein magnetischer Rührstab ungehindert am Boden drehen kann. Stellen Sie den Eimer in einen auf vier Grad Celsius gekühlten Raum auf eine magnetische Heizplatte und schalten Sie diese auf eine langsame Drehgeschwindigkeit ein. Das Dialyseverfahren dauert mindestens drei Tage, um die Menge an Guanidin im Puffer schrittweise zu verringern.Überprüfen Sie regelmäßig, ob der Schlauch unversehrt ist und die Enden sicher verschlossen sind. Geben Sie nach vier bis fünf Stunden einen Liter 1x-Acetatpuffer in den Dialyseeimer. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle vier bis fünf Stunden insgesamt dreimal, sodass sich eine Gesamtmenge von vier Litern im Eimer befindet.Nachdem die Hälfte des Puffers im Eimer entsorgt wurde, diesen mit einem Liter frischem 1x Acetatpuffer auffüllen und Schlauch sowie Rührfisch einrichten. Abschließend das gesamte Volumen von vier Litern im Eimer durch vier Liter frischen 1x Acetatpuffer ersetzen und vier bis fünf Stunden unter Rühren stehen lassen. Für optimale Ergebnisse sollte dieser Schritt am Tag der Protein-Konzentrierung durchgeführt werden.Um das MOG-Tag-Protein zu konzentrieren, legen Sie einen Behälter mit Aluminiumfolie aus und bedecken Sie die Aluminiumfolie mit PEG 3350 und PEG 1000 im Verhältnis eins zu eins. PEG 3350 kann helfen, Proteinaggregation während der Konzentration zu verhindern, und wirkt zudem als wirksames Kryopreservativ. Legen Sie die Schlangenhaut-Röhre, die das MOG-Tag-Protein enthält, auf die Aluminiumfolie und bedecken Sie sie mit PEG 8000.Lassen Sie dies bei Raumtemperatur stehen und überprüfen Sie regelmäßig das Volumen, bis es gleich oder geringer als das geschätzte Endvolumen ist. Falls der Stift während des Konzentrationsprozesses mit Wasser übersättigt wird, bereiten Sie eine neue Schale mit Aluminiumfolie und PEG vor. Proteinproben, die während des Reinigungsprotokolls entnommen wurden, werden zur Bestätigung der Reinheit auf einem SDS-Page-Gel laufen gelassen.Ein repräsentatives Gel zeigt das hochreinigte MOG-Tag bei 31,86 Kilodalton. Um zu überprüfen, ob das MOG-Tag-Protein korrekt gefaltet ist, wurde die Bindung des MOG-Tag-Proteins an CD19-positive, CD4-negative, neun B-Zellen aus Lymphknoten entweder von Wildtyp-C57-Schwarzmäusen der Linie sechs oder von IgH-MOG-Mäusen, die eine für das MOG-Protein spezifische Immunglobulin-Schwerkette exprimieren, mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dieses Protokoll erfordert insgesamt mindestens 10 Tage von Anfang bis Ende.Während des gesamten Isolierungsverfahrens ist es wichtig, die Proteine im Auge zu behalten und sich daran zu erinnern, was aufbewahrt und was verworfen werden muss. Vergessen Sie nicht, dass Nickelsulfat-Hexahydrat, das zum Beladen des Nickelharzes verwendet wird, äußerst gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Inhalation oder Haut- und Augenkontakt zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr eigenes MOG-Tag-Protein herstellen und reinigen können.Nach der Reinigung kann das MOG-Tag-Protein in komplettem Freund-Adjuvans emulgiert und als Immunogen zur Induktion von EAE verwendet werden. Durch das MOG-Tag induziertes EAE kann genutzt werden, um die Beteiligung verschiedener Zelltypen wie CD4- oder CDAT-Zellen oder B-Zellen an der Autoimmunität des zentralen Nervensystems zu untersuchen. Im Gegensatz zu kurzen Peptiden, die auf den MHC beschränkt sind, kann das Proteinantigen in jeder Mauslinie verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine effiziente Homogenisierungstechnik zur Erzeugung einer Antigen-adjuvanten Emulsion zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in einem Mausmodell. Die Emulsion enthält ein Autoantigen – Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) – in der Wasserphase, umgeben von einer kontinuierlichen Ölphase, die aus einem inaktivierten pathogenen Bakterium besteht. Die Emulsion sorgt für eine anhaltende Freisetzung von Antigenen für eine verlängerte...

Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Quelle: Jain, R. W., et al. Einfache und effiziente Herstellung und Aufreinigung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein aus der Maus für experimentelle Studien zur Autoimmun-Enzephalomyelitis. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Isolierung und Reinigung von MOGtag, einem rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), das in experimentellen Studien zur Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) verwendet wird. Das Protokoll umfasst bakterielle Lyse, Beschallung, Zentrifugation und...

Isolierung und Reinigung von rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein etabliertes Tiermodell für multiple Sklerose. C57BL / 6 Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-Peptid 35-55 (MOG 35-55) immunisiert, was zu einer aufsteigenden schlaffen Lähmung durch autoreaktive Immunzellen im zentralen Nervensystem verursacht. Protokolle für die Krankheitsinduktion und Überwachung diskutiert.

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Lernen Sie die Herstellung und Reinigung von Maus-MOG-Protein für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-Studien. Diese zugängliche Methode ermöglicht die Erforschung von Multipler Sklerose.

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

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