Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der D. discoideum Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging
December 2nd, 2016
Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde kürzlich als System zur Untersuchung von Proteinfehlfaltung und Proteostase etabliert. Hier beschreiben wir eine neue bildgebende Methodik, um die temperaturinduzierte Proteinaggregation und die zelluläre Stressantwort in D. discoideum zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel dieser bildgebenden Technik ist es, durch Hitzestress induzierte zelluläre Störungen in Dictyostelium discoideum-Zellen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, die Mechanismen der Hitzestressreaktion und der Proteinqualitätskontrolle in der Amöbe Dictyostelium discoideum zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die strenge und präzise Kontrolle der Temperatur, die auf die Bildgebung der Zelldatei angewendet wird.
Um den Vorgang zu beginnen, bereiten Sie Dictyostelium-Zellen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Am Tag vor der Bildgebung werden die Zellen in ein Medium mit niedriger Fluoreszenz bis zu 10.000 Zellen pro Milliliter aufgeteilt. Ernten Sie vor der Bildgebung die Zellen aus der Gewebeplatte in LFM und überführen Sie dann eine ausreichende Anzahl von Zellen in Glasbodenschalen.
Lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang ruhen und ersetzen Sie dann vorsichtig das verwendete Medium durch frisches Medium, um nicht abgesetzte Zellen zu entfernen. Bildzellen erfassen unter unbelasteten Bedingungen bei 23 Grad Celsius mindestens sechs Sichtfelder. Erfassen Sie Z-Stacks von maximal sieben Mikrometern in Schritten von einem bis 0,25 Mikrometern, um das gesamte Volumen der Zelle zu erfassen.
Nehmen Sie dann ein Referenz-Hellfeldbild auf, um die Gesamtzahl der Zellen zu beurteilen. Stellen Sie anschließend die Temperatur der Kühlkammer auf 30 Grad Celsius ein. Nachdem die Temperaturanzeige den gewünschten Wert erreicht hat, fokussieren Sie manuell im Hellfeldkanal.
Überprüfen Sie alle aufgezeichneten FOVs, bevor Sie den Zeitraffer starten, und starten Sie dann einen Zeitraffer für vier Stunden Hitzestress mit einem Zeitintervall von fünf bis 10 Minuten zwischen den Zeitpunkten. Überprüfen Sie, ob die Fokussierung während der Erfassung der ersten beiden Zeitpunkte korrekt ist. Nachdem die Hitzebelastung abgeschlossen ist, reduzieren Sie die Temperatur wieder auf 23 Grad Celsius.
Warten Sie, bis sich die Temperaturanzeige manuell angepasst und neu fokussiert hat. Nehmen Sie dann in der Erholungsphase Zeitrafferfilme für acht bis 10 Stunden in Zeitintervallen von 10 bis 20 Minuten auf. Überprüfen Sie, ob die Fokussierung während der Erfassung des ersten Zeitpunkts korrekt ist.
Öffnen Sie zunächst das Bildverarbeitungspaket, das mit dem Cell Counter-Plugin ausgestattet ist. Laden Sie den Hellfeld-Bildstapel, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Öffnen Sie als Nächstes das Cell Counter-Plugin und laden Sie den Bildstapel, indem Sie auf Initialisieren klicken.
Wählen Sie den Typ der Leistungsindikatoren aus, indem Sie auf das entsprechende Feld klicken. Zählen Sie danach die Gesamtzahl der Zellen und speichern Sie die Markierungen, indem Sie auf Markierungen speichern klicken. Nachdem die Marker gespeichert sind, laden Sie die maximale Projektion des Fluoreszenzbild-Hyperstacks.
Öffnen Sie das Cell Counter-Plugin und laden Sie die Marker, indem Sie auf "Marker laden" klicken. Wählen Sie als Nächstes den Markertyp für zytosolische Herde und zählen Sie die Zellen. Die vorhandenen Marker können als Orientierungshilfe für die Position einzelner Zellen verwendet werden.
Rufen Sie die Anzahl der Zählungen pro Slice ab, indem Sie auf Ergebnisse klicken, und speichern Sie die Zählungen dann an anderer Stelle für weitere Berechnungen. In dieser Studie wurde die Verteilung des GFP-markierten Polyglutaminproteins Q103 in Dictyostelium-Zellen beobachtet. Unter normalen Wachstumsbedingungen ist Q103-GFP diffus im Zytoplasma verteilt.
Bei Hitzestress verschmilzt der Q103-GFP-Marker zu punktförmigen Strukturen. Bei Stressabbau und Wachstum unter normalen Wachstumsbedingungen lösen sich diese Strukturen auf. Die Umverteilung von Q103-GFP und die Bildung von Hitzestress-induzierten zytosolischen Herden wird mittels Bildanalyse quantifiziert.
Die repräsentativen Ergebnisse der Hitzestressreaktion sind hier zu sehen. Die Anzahl der Zellen mit zytosolischen Q103-GFP-Herden nimmt mit anhaltendem Hitzestress zu. Bei Hitzestress ist das Qualitätskontrollsystem für Proteine überlastet, so dass aggregationsanfällige Proteine nicht in einem löslichen Zustand gehalten werden können.
Nach Hitzestress nimmt die Anzahl der Zellen mit zytosolischen Herden ab, was darauf hindeutet, dass sich die aggregierten Proteine auflösen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie durch Hitzestress verursachte Störungen in der Amöbe Dictyostelium discoideum überwachen können. Während der gesamten Bildgebung ist es wichtig, darauf zu achten, dass der Fokus richtig eingestellt ist, wenn Ihr Mikroskop nicht über einen Hardware-Autofokus verfügt.
Die in diesem Protokoll gezeigte Temperaturregelung kann über den Bereich der Hitzestressreaktion hinaus verwendet werden. Die Bildgebung unter normalen Wachstumsbedingungen unter Verwendung von Temperaturkontrolle kann phototoxische Effekte erheblich reduzieren.
Übersicht
Diese Studie präsentiert eine neuartige Bildgebungsmethode zur Untersuchung temperaturinduzierter Proteinaggregation und zellulärer Stressreaktionen in der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum. Die Technik ermöglicht eine präzise Temperaturkontrolle und erlaubt es Forschern, die Auswirkungen von Hitzestress auf die Proteinqualitätskontrolle zu beobachten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Proteinaggregation
Hintergrund
- Dictyostelium discoideum dient als Modellorganismus zum Studium zellulärer Stressreaktionen.
- Das Verständnis von Proteinfaltungsfehlern ist entscheidend für Einblicke in verschiedene Krankheiten.
- Hitzestress kann zu Proteinaggregation führen und die zelluläre Funktion beeinträchtigen.
- Bildgebungstechniken sind für die Echtzeitbeobachtung zellulärer Prozesse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Beobachtung von durch Hitzestress induzierten zellulären Störungen zu entwickeln.
- Die Mechanismen der Hitzestressreaktion in D. discoideum zu klären.
- Die Wirksamkeit der Proteinqualitätskontrolle unter Stressbedingungen zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Präparation von Dictyostelium-Zellen in einem Medium mit niedriger Fluoreszenz.
- Bildgebung unter kontrollierten Temperaturen (23°C und 30°C).
- Zeitraffer-Bildgebung zur Überwachung zellulärer Reaktionen über mehrere Stunden.
- Bildanalyse zur Quantifizierung von Proteinaggregation und Erholung.
Hauptergebnisse
- Das Q103-GFP-Protein zeigte unter normalen Bedingungen eine diffuse Verteilung.
- Während Hitzestress bildete Q103-GFP punktförmige Strukturen, die auf Aggregation hindeuten.
- Nach dem Stress sank die Anzahl der Zellen mit Aggregaten, was auf Erholung hindeutet.
- Die Methode demonstrierte erfolgreich die Dynamik der Proteinaggregation und -auflösung.
Schlussfolgerungen
- Die Bildgebungstechnik liefert Einblicke in zelluläre Stressreaktionen.
- Temperaturkontrolle ist entscheidend für die genaue Beobachtung der Proteindynamik.
- Diese Methodik kann auf andere Bereiche der zellulären Stressforschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
