Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Zelloberflächenexpression von Membranproteinen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Spaced-Assays zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Durchflusszytometrie-Assays quantifizierbare Endpunkte an großen Volumina lebender Zellen in einem einzigen Experiment liefern. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Therapie von kardialen ventrikulären Arrhythmien, da diese Pathologien oft mit genetischen Mutationen verbunden sind, die Defekte im Transport von kardialen Ionenkanälen verursachen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, eine geeignete extrorale Insertionsstelle für das Epitop zu identifizieren, die ihre Proteinfunktion nicht beeinträchtigt und in Gegenwart des konjugierten Antikörpers ein starkes Fluoreszenzsignal erzeugt. Dieses Verfahren wird Benoite Bourdin, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, vorführen. Zu Beginn konstruiert sich Doubley-Tag-DNA mit mCherry am intrazellulären C-Terminus.

Exprimieren Sie auch ein extrazelluläres Hemmagglutinin-Epitop, das mit einem Fluoreszenzantikörper gemessen werden kann, um die Zelloberflächenexpression von Membranproteinen abzuschätzen. Als nächstes kultivieren Sie eine Platte mit TSA201-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen. Für jede Probe werden die Transfektionsreagenzien in zwei Röhrchen vorbereitet.

Bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit vier Mikrogramm DNA und 250 Mikrolitern reduziertem Serummedium und ein zweites Röhrchen mit 10 Mikrolitern des Liposomen-vermittelten Transfektionsreagenzes und 250 Mikrolitern serumreduziertem Kulturmedium vor. Mischen Sie die beiden Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Mischen Sie dann vorsichtig den Inhalt von Röhrchen eins und röhrchen zwei und inkubieren Sie die Liposomen-DNA-Komplexe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie die Komplexe zu den kultivierten Zellen und schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig. Stellen Sie das Gericht wieder bei 37 Grad Celsius und 24 Stunden lang unter eine 5%ige Kohlendioxidatmosphäre. 24 Stunden nach der Zugabe des Transfektionsreagenzes nehmen Sie das Medium aus der Kulturschale und waschen die Zellen vorsichtig mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem Trypsin-EDTA.

Fügen Sie dann 400 Mikroliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Schale fünf Minuten lang, damit sich die Zellen von der Schale lösen können. Nach dem Ablösen stoppen Sie die Enzymverdauung, indem Sie den Zellen einen Milliliter kaltes Kulturmedium ohne Penicillin oder Streptomycin zusetzen. Pipettieren Sie das Medium vier- bis fünfmal vorsichtig über die Platte, um alle Zellen von der Oberfläche zu waschen.

Sammeln Sie dann die Zellen in sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie sofort auf Eis. Verwenden Sie für die nächsten Schritte eine eiskalte Lösung und halten Sie die Zellen bei vier Grad, um die Internalisierung des Oberflächenepitops zu verhindern. Verringern Sie auch die Lichteinwirkung der Zellen, um die Photobleiche des Fluoreszenzsignals zu begrenzen.

Zentrifugieren Sie anschließend die Röhrchen, um die Zellen zu pelletieren. Saugen Sie dann den entstandenen Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie das Pellet, um eine einzellige Suspension mit einem Milliliter PBS herzustellen.

Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen kurz. Pelletieren und resuspendieren Sie die Zellen erneut, um das Kulturmedium vollständig zu entfernen. Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in 600 Mikrolitern PBS.

Messen Sie die Zellkonzentration und stellen Sie sie auf mindestens drei Millionen Zellen pro Milliliter ein. Teilen Sie dann die Zellen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen auf. Achten Sie darauf, die entsprechenden Kontrollen zur Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Färbungen sowie für extrazelluläre Färbungen und auch für intrazelluläre Färbungen einzuschließen.

Der Isotopenkontrollantikörper hilft bei der Beurteilung des Grades der Hintergrundfärbung und sollte mit dem Primärantikörper, dem glücksverheißenden Isotop und dem Fluorophor übereinstimmen. Es ist wichtig, den Kontrollisotopen-Antikörper und den Fluoreszenz-Antikörper in der gleichen Konzentration zu verwenden. Um die Zelloberflächenexpression von Membranproteinen abzuschätzen, markieren Sie zunächst nur das extrazelluläre HA-Epitop mit einem fluoreszierenden Lichtkonjugationsantikörper.

Geben Sie dann einen FITC-konjugierten monoklonalen Anti-HA-Antikörper in einer Menge von fünf Mikrogramm pro Milliliter in das Röhrchen. Wirbeln Sie die Zellen kurz vor und inkubieren Sie sie dann auf einer Wippenplattform im Dunkeln. Entfernen Sie die Zellen aus dem Dunkeln und fügen Sie 900 Mikroliter PBS hinzu.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand abzusaugen. Waschen Sie anschließend die Zellen, indem Sie das Pellet in einem Milliliter PBS resuspendieren und die Zellen kurz vortexen. Wiederholen Sie dann den Zentrifugenschritt, um die Zellen erneut zu pelletieren.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt dreimal, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und überführen Sie die Einzelzellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Durchflusszytometrieröhrchen. Halten Sie die Zellen im Dunkeln bei vier Grad Celsius, bis die Probe entnommen ist.

Um die intrazelluläre Expression des Gesamtproteins abzuschätzen, markieren Sie als nächstes die permeabilisierten Zellen. Dies wird unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls wie die extrazelluläre Markierung erreicht, jedoch unter Zugabe eines Saponin-basierten Zellpermeabilisierungspuffers. Pelletieren Sie die Zellen, entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Fixierungspermeabilisierungslösung direkt aus dem vorbereiteten Stoff.

Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Geben Sie dann 100 Mikroliter frisch zubereiteten Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzu und wirbeln Sie die Zellen kurz ein. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen und waschen sie zwei weitere Male mit dem Permeabilisierungs-Waschpuffer.

Fügen Sie dann den FITC-konjugierten monoklonalen Anti-HA-Antikörper in einer Menge von 5 Mikrogramm pro Milliliter und 100 Mikroliter des Permeabilisierungs-Waschpuffers hinzu. Kurz die Zellen durchwirbeln und im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter des Permeabilisierungs-Waschpuffers hinzu.

Pelletieren Sie die Zellen und waschen Sie sie dreimal in 100 Mikrolitern desselben Puffers wie zuvor gezeigt. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und überführen Sie die Einzelzellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Durchflusszytometrieröhrchen. Lassen Sie die nicht-permeabilisierten und permeabilisierten Zellen am selben Tag durch das Durchflusszytometer laufen.

Starten Sie zunächst die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und importieren Sie die fcs-Dateien, die während der Durchflusszytometrie erstellt wurden. Klicken Sie auf das erste Beispiel und starten Sie den Gating-Prozess im Diagramm von Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung. Zeichnen Sie als Nächstes das P1-Gatter mit dem Ellipsensymbol um die lebenden Zellen, um Ablagerungen, abgestorbene Zellen oder Aggregate zu entfernen.

Zeichnen Sie dann das Röhrenparameter-Konturdiagramm der mCherry im Vergleich zur FITC-Fluoreszenzintensität. Setzen Sie das P2-Gate um die FITC- und mCherry-positiven Zellen und das P3-Gate um die fluoreszenznegative Zellpopulation. Wählen Sie als Nächstes die Gatter P2 und P3 aus und klicken Sie auf das Symbol Statistik hinzufügen im ursprünglichen Arbeitsbereichsfenster.

Klicken Sie auf Zählung und dann auf Mittelwert. Wenden Sie abschließend die Gates-Parameter und Statistiken auf alle Proben an, die vom Zytometer untersucht werden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Rolle der N-Glykosylierung auf die Gesamt- und Zelloberflächenexpression von CaV Alpha 2 Delta 1 in TSA201-Zellen zu charakterisieren.

Um Zugang zur Proteinexpression auf der Zelloberfläche zu erhalten, wurde HA an nicht permeabilisierten Zellen gemessen, bei denen die N-Glykosylierungsstellen an vier, 16 oder keiner Stelle gestört waren. Die FITC-Spiegel waren im Wildtyp und in Zellen mit N-Glykosylierungszellen an vier Stellen hoch, aber in den Zellen mit 16 gestörten Stellen wurden nur Hintergrundwerte gefunden. Bei den permeabilisierten Zellen stieg die FITC-Fluoreszenz unter allen Bedingungen an, was darauf hindeutet, dass alle transfizierten, HA-markierten CaV-Alpha-2-Delta-1-Proteine gefärbt und mit dem Anti-HA-FITC-Antikörper nachgewiesen wurden.

Darüber hinaus waren die mCherry-Fluoreszenzwerte für permeabilisierte und nicht permeabilisierte Zellen ähnlich, was bedeutet, dass die Permeabilisierung das relative mCherry-Signal nicht verändert. Assays, die nach der Zellpermeabilisierung durchgeführt wurden, zeigten, dass die Gesamtproteinexpression für die Zellen mit 16 gestörten Stellen ebenfalls signifikant verringert war, unabhängig davon, ob dies aus der FITC-Fluoreszenz in permeabilisierten Zellen oder aus der konstitutiven mCherry-Fluoreszenz abgeleitet wurde, die in nicht permeabilisierten und in permeabilisierten Zellen gemessen wurde. Zusätzlich zu diesem Verfahren können zusätzliche physiologische Aufzeichnungen durchgeführt werden, um die Expression und Funktion der Ionenkanäle zu korrelieren.

Diese Technik ebnet auch Forschern im medizinischen Bereich den Weg, um die Auswirkungen genetischer Mutationen, posttranslationaler Modifikationen, microRNAs, kleiner GTPasen und die Rolle von Chaperonen beim Transport von Membranproteinen zu untersuchen, die in rekombinanten oder in nativen Zellen exprimiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür bekommen, wie man DNA-Transfektion in rekombinanten Zellen durchführt, NTAC und permeabilisierte Zellen färbt und die Datenanalyse an den Proben durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Zellen Vorsichtsmaßnahmen erfordert, wie z. B. das Arbeiten in der Helaminalflüssigkeit für die Transfixation und das Tragen von Handschuhen beim Umgang mit Chemikalien.