Name: Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Filterung von Wasserproben mit einer Filterpatrone zur Extraktion von Umwelt-DNA ohne Öffnen des Gehäuses. Diese Methode ermöglicht metabarcoding von eDNA aus aquatischen Organismen für ökologische Biodiversitätsüberwachung.

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Diese Studie wurde als Grundlagenforschung von CREST von der Japan Science and Technology Agency (JST) und durch Zuschüsse von JSPS/MEXT KAKENHI (Nummer 26291083) und der Canon Foundation an M.M unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Hinweis: Dieses Protokoll befasst sich nicht mit Wasser Probenahme und metabarcoding Methoden. Wasser kann auf verschiedene Arten je nach Studienzwecke 16 und siehe Miya et al. 12 Einzelheiten zu den metabarcoding Methoden MiFish Primer zu beproben. Beachten Sie, dass das abgetastete Wasser sollte sehr kalt und innerhalb weniger Stunden gefiltert gehalten, um den Abbau von Edna zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass dieses Protokoll die Verwendung eines Rotationsschüttler beinhaltet und einen Inkubator, und dieser muss groß genug sein, um den ehemaligen zubringen. Zusätzlich kann eine Zentrifuge, Das beherbergen jeweils 15 ml und 50 ml konische Röhrchen ist unerlässlich, um die restliche Flüssigkeit aus dem post-Filtrationsfilter zu entfernen und extrahierte DNA innerhalb der Kassette zu sammeln, respectively. 1. Die Verarbeitung einer Schraubkappe und einem 1 L-Plastiktasche HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen&gt; 4 L. <ol><li> Bohren Sie ein Loch durch die Mitte einer Schraube cap (befestigt an einem wegwerfbaren 1 L Plastiktüte) mit gleichem Durchmesser (4,8 mm) als das Rohr aus einem männlichen Luer-Lock Anschluss vorsteht. Verwendung Beißzange, verkürzen die Röhre des männlichen Luer-Lock - Anschluss auf eine geeignete Länge (ca. 3 mm) Zusetzen einer kleinen Menge an Wasser innerhalb der Kappe nach der Filtration zu vermeiden. </li><li> Tragen Sie einen Klebstoff Klebstoff spezialisiert für Polyethylen (PE) und Polypropylen (PP) sowohl mit dem Boden und der Oberfläche des männlichen Luer-Lock-Anschluss und Schraubverschluss sind. Warten Sie ein paar Minuten für eine gute Verklebung (siehe Anweisungen des Herstellers). </li><li> Setzen Sie den männlichen Luer-Lock-Anschluss in das Loch der Schraubkappe. Warten, bis eine vollständige Verklebung der beiden Teile (in der Regel&gt; 24 h). Sterilisieren Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock - Anschluss mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch. </li><li> Lochen Sie zwei Löcher an den beiden unteren Ecken des 1 L Plastikbeutel, um sie von einem mes zu hängenh Panel (Schritt 3). Sicherzustellen, dass der Durchmesser der Löcher größer ist als die der Zacken auf dem Netzeinsatz. </li></ol> 2. Montage des Filtrationssystems <ol><li> Bringen Sie Hochvakuumschlauch an den Eingangsanschluss einer Saugpumpe und das andere Ende des Schlauchs an einem Verteiler. Achten Sie darauf , dass die drei roten T-Ventile des Verteilers in der &quot;Aus - Position&quot; sind (dh horizontal). </li><li> Das Tragen eines sauberen Reihe von Handschuhen, legen Sie eine weibliche Luer-Fitting und ein Vakuum-Anschluss an den oberen und unteren Ende des Vakuumgummischlauch für die Filtration, respectively. </li><li> Sorgfältig befestigen den Vakuumverbinder mit einem Silikonstopfen den weiblichen Luer-Fitting an einem Auslassanschluss der Filterpatrone und befestigen. </li></ol> 3. Filtration von Wasserproben (≤4 L), um die Filterpatrone mit HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen&gt; 4 L. Dieses Filtrationssystem erfordert eine selbststehende Platte foder hängen Sie den Plastikbeutel mit 1 l Wasser gefüllt. Ein Mesh-Panel, mehrere Zinken, und ein Ständer für das Panel, die alle von Online-Shops, würde für die Montage dieses Gerät nützlich sein. den Einlass Autoklav und Luer-Kappen für die Filterpatrone vor dem Gebrauch Steckdose. <ol><li> Gießen Sie die 1 L abgetastet Wasser in den Plastikbeutel und schließen Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock-Anschluss. </li><li> eine Einlaßöffnung des zusammengebauten Filterpatrone mit dem männlichen Luer-Lock Anschluss des Kunststoffbeutels sorgfältig verbinden. Sie nicht zu fest anziehen, den Luer-Lock-Anschluss; sonst wird das Gerät auslaufen, sobald die Pumpen beginnt. Seien Sie sicher, dass alle Verbindungen sicher sind, bevor die Plastikbeutel von einem Mesh-Panel hängen. </li><li> hängen Sie vorsichtig den Plastikbeutel mit der Filterpatrone aus zwei Zinken auf dem Mesh-Panel und einsetzen des Verteilers einen Silikonstöpsel in einer Einlassöffnung. </li><li> Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone ist trocken, tHenne die roten T-Ventil in die Stellung drehen. </li><li> Wiederholen 3.1-3.4 Schritte, bis die gewünschte Menge Wasser gefiltert wird. HINWEIS: Für 1 l Wasser aus den subtropischen Korallenriffen genommen, es etwa drei Minuten für die Filtration erfolgt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss. </li><li> Kappe an beiden Enden der Patrone mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps. </li><li> Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. </li><li> Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion. </li></ol> 4. Filtration von Wasser (&gt; 4 L) Proben die Filterpatrone mit Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn der Wasserfiltrationsvolumen ist ≤4 L. Dieses Filtrationssystem 10 L Buch-Flasche mit einem Ventil und einem Einweg-10-ml-Pipettenspitze ausgestattet erfordert. Ein Innendurchmesser der Pipettenspitze 10 ml (15,0 mm) und eine Verjüngung der SpitzeEnde sollte zu einem Außendurchmesser des das Ventil (15,0 mm) passen und Einlassöffnung der Filterpatrone sind. Beide Verbindungen werden sicher während der Filtration in einer Reibungspassung gehalten wird. Sterilisieren Sie die Pipettenspitze mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch. <ol><li> Bereiten Sie eine angemessene Menge an abgetasteten Wasser in dem Buch Flasche. Dicht legen Sie die 10 ml Pipettenspitze in das Ventil von 10 L Buch Flasche. </li><li> die Auslassöffnung der Filterpatrone in die Pipettenspitze Ende fest einsetzen und den Silikonstopfen in die Einlaßöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone trocken ist, dann drehen Sie den roten T-Ventil in die Stellung. HINWEIS: Für 10 l Meerwasser aus den subtropischen Außen Korallenriffe genommen, es ca. 30-40 min für die Filtration erfolgt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss. Cap beidedie Kartusche Enden mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps. Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion. </li></ol> 5. Extraktion von Edna aus dem Filter HINWEIS: In den Schritten 4 und 5, verwenden wir einen kommerziellen Kit, weitgehend nach einem Protokoll für &quot;nukleierten Blut&quot; von dem Kit zur Verfügung gestellt. Der Einfachheit halber beschreiben wir das Verfahren zur Verarbeitung einer einzelnen Patrone. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung 8 (oder die maximale Anzahl der Zentrifuge) oder weniger Filter auf einmal. <ol><li> Wärmen Sie einen Inkubator auf 56 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine 2,0-ml-Röhrchen durch den Klappdeckel aus dem Rohr zu schneiden. Entsorgen Sie die Kappe. HINWEIS: Dieser Schlauch wird als Sammelrohr für die restliche Flüssigkeit in dem Filter verwendet. </li><li> Entfernen Sie den Einlass (NICHT Auslass) Luer-Kappe aus der Filterpatrone und setzen Sie die Einlassöffnung inde Sammelröhrchen. dicht schließen eine Verbindung zwischen der Patrone und dem Sammelrohr eine selbstdichtende Folie verwendet wird. </li><li> Legen Sie die kombinierte Einheit in ein Zentrifugen Adapter für einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Patrone bei 5.000 × g für 1 min die restliche Flüssigkeit in dem Filter zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Sammelröhrchens aus der Filterpatrone und dem Rohr zu verwerfen. Re-Kappe die Einlassöffnung der Patrone. </li><li> Bereiten einer Mischung aus 20 &amp; mgr; l Proteinase-K-Lösung, 220 ul PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, nicht von dem Kit bereitgestellt) und 200 &amp; mgr; l AL puffern. HINWEIS: Die Filterpatrone für bis zu vier Mal die Volumina des Gemisches (. Ca. 1,8 ml). </li><li> Entfernen Sie die Einlasskappe und fügen Sie die Mischung (440 ul) in die Filterkartusche mit einer Pipettenspitze. Legen Sie die Pipette vollständig in die Einlassöffnung, so dass die Pipettenspitze nur oberhalb der Membran in der Kassette sichtbar. </li><li> Re-Kappe die Einlassöffnung und setzen Sie den Filter AutoTridge auf einem Rotationsschüttler. </li><li> Setzen Sie den Rotationsschüttler im vorgeheizten Inkubator bei 56 ° C und schalten Sie den Schüttler bei einer Geschwindigkeit von 20 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten. </li><li> Während der Inkubation bereiten ein neues 2,0-ml-Röhrchen, beschriften Sie das Rohr in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift und legen Sie sie in einem 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Die ehemalige (2,0 ml) und letztere Rohre (50 ml) für die Erfassung der extrahierten DNA und zum Halten der 2,0-ml-Röhrchen verwendet wurden. </li><li> Nach der Inkubation die Einlasskappe entfernen und den Einlass (NICHT Auslass) -Anschluss der Patrone in die 2,0-ml-Röhrchen in der 50 ml konischen Röhrchen ein. Schließen die 50 ml konischen Röhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Zentrifugieren der 50-ml konischen Röhrchen bei 5.000 × g für 1 min die extrahierte DNA aus der Patrone zu sammeln. Entfernen Sie die Filterpatrone und das 2,0-ml-Röhrchen mit sterilisierten Zange und die Kappe der Röhre. Entsorgen Sie die Filterpatrone. </li></ol> 6. Reinigung von extrahierter DNA HINWEIS: Wir eluieren EDNA mit 100 ul Puffer AE anstelle von 200 &amp; mgr; l in der Bedienungsanleitung des kommerziellen Kits angegeben. <ol><li> In 200 ul Ethanol (96-100%) zu der extrahierten DNA in der 2,0-ml - Röhrchen aus dem obigen Schritt (ca. 440 &amp; mgr; l) und gründlich mischen durch Vortexen. </li><li> Pipettieren der Mischung in eine Spin-Säule in ein Sammelröhrchen 2 ml gebracht. Zentrifuge bei 5000 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500 &amp; mgr; l Puffer AW1 und Zentrifuge für 1 min bei 5.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500-ul Puffer AW2 und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr. </li><li> Bereiten Sie einen neuen 1,5-ml-Röhrchen (nicht im Kit enthalten) und beschriften Sie das Rohr entsprechend einem wasserfesten Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Übertragen Sie die Spin-Säule to der 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Eluieren der DNA durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l Puffer AE zu der Mitte der Spinsäule Membran. Inkubieren für 1 min bei Raumtemperatur und dann bei 6.000 × g für 1 min zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie die Spin-Säule und die Kappe der Röhre. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In vielen metabarcoding Studien unter Verwendung von Umweltproben wie Wasser und Boden, post-Filtrationsbehandlung der Filterpatrone ist in der Regel wie folgt 24,25: 1) Aufschneiden oder rissiger das Gehäuse mit Handwerkzeugen (Rohrschneider oder Zange); 2) Entfernen des Filters aus der Patrone; und 3) Schneiden des Filter in kleine Stücke mit einer Rasierklinge für die DNA-Extraktion. Um derartige umständliche und zeitraubende Verfahren zu vermeiden, die zu einer Verunreinigung im Labor anfällig sind, haben...

Umwelt DNA (EDNA) in der aquatischen Umwelt bezieht sich auf genetisches Material in der Wassersäule gefunden. Jüngste Studien zeigten den Nutzen von Edna für Fische aus verschiedenen Gewässern zu erfassen, einschließlich Teiche 1-3, Flüsse 4-8, Ströme 9 und Meerwasser 14.10. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich auf Nachweis eines einzelnen oder wenigen invasive 1,4-6,8,14 und seltene oder bedrohte Arten 3,9, während einige neuere Studien gleichzeitigen Nachweis mehrerer Spezies in lokalen Fischgemeinschaften 7,9 versuchte, 12,13,15 und Mesokosmen 11,12. Der zweite Ansatz ist &quot;metabarcoding&quot; genannt und Edna metabarcoding verwendet einen oder mehrere Sätze von PCR-Primer über taxonomisch diverse Proben eine Genregion auf coamplify. Dies wird durch die Bibliotheksvorbereitung mit Indexierungs- und Adapter-Addition und die indizierten Bibliotheken von einem Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert parallel sindPlattform. Kürzlich Miya et al. 12 entwickelte Universal-PCR - Primer für metabarcoding EDNA von Fischen (genannt &quot;MiFish&quot;). Die MiFish Primer zielen auf eine hypervariablen Region des mitochondrialen 12S-rRNA-Gens (163-185 bp), die ausreichende Informationen enthält Fische zu taxonomischen Familie, Gattung und Art zu identifizieren, mit Ausnahme einiger eng verwandten Artgenossen. Mit der Verwendung dieser Primer in EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 erfasst mehr als 230 subtropische Meeresarten von Aquarien mit bekannten Artenzusammensetzung und Korallenriffe in der Nähe des Aquariums. Während das Protokoll metabarcoding Optimierung natürlichem Meerwasser aufzunehmen mit einem Gehalt an EdNA Konzentration von Fischen unterschiedlicher haben wir bemerkt, dass die MiFish Primer gelegentlich die Zielregion für die nachfolgende Herstellung Bibliothek zu amplifizieren fehlgeschlagen. Eine der häufiger Grund für diese nicht erfolgreich PCR-Amplifikation ist der Mangel an ausreichender Mengen der template DNA in kleinen Mengen Wasser enthielt gefiltert (dh 1-2 L). Obwohl EDNA-Konzentration von einer bestimmten taxonomischen Gruppe vor der Verstärkung unerkennbar ist, Filtration von großen Wassermengen (&gt; 1-2 L) wäre ein einfaches und wirksames Mittel sein, um mehr EDNA aus den Gewässern mit knappen Fischreichtum und Biomasse zu sammeln, wie zum Beispiel im offenen Meer und Tiefseeökosysteme. Bezogen auf Platte Faserfiltern üblicherweise in einer Reihe von Fisch EDNA Forschung 16 verwendet, Filterpatronen haben den Vorteil , größere Wassermengen vor 17 Verstopfung zuvorkommend . Eigentlich eine aktuelle Studie zeigte großes Volumen (&gt; 20 L) Filtration von Küstenmeerwasser Proben unter Verwendung von Filterkartuschen 18. Darüber hinaus werden sie einzeln verpackt und steril, und mehrere Schritte des experimentellen Arbeitsablauf kann in das Filtergehäuse durchgeführt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination aus der Labor 19 reduziert wird . letztereMerkmal ist entscheidend für die EDNA metabarcoding, in denen die Gefahr einer Kontamination bleibt unter den größten experimentellen 20,21 herausfordert. Trotz dieser technischen Vorteile von Filterpatronen, es war nicht in EdNA Studien von Fischen mit zwei Ausnahmen 8,15 verwendet. Hier bieten wir ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit der Filterpatrone und Extraktion von Edna aus seinem Filter, ohne das Gehäuse öffnen zu schneiden zu müssen. Wir bieten auch zwei alternative Wasserfiltersysteme in Abhängigkeit von den Wassermengen (≤4 L oder&gt; 4 l). Um die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Protokoll vergleichen und ein zuvor verwendetes Protokoll ein Glasfaserfilter in unserer Forschungsgruppe mit 12,14,22,23, führen wir EDNA metabarcoding Analyse von Meerwasser aus einem riesigen Aquarium (7500 m 3 ) mit bekannten Artenzusammensetzung und zeigen die Anzahl der nachgewiesenen Spezies aus den beiden Protokollen als repräsentative Ergebnisse abgeleitet. Dieses Protokoll hwie für metabarcoding EDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch für Edna aus anderen Organismen.

<table><tbody><tr><td>Mesh-Panel</td><td>Iris Ohyama</td><td>MPP-3060-BE</td><td></td></tr><tr><td>Metallstift</td><td>Iris Ohyama</td><td>MR12F</td><td></td></tr><tr><td>Ständer für das Mesh-Panel</td><td>Keine Marke</td><td>4184-9507</td><td>bei Amazon Japan erhältlich</td></tr><tr><td>1 L Plastiktüte mit Schraubverschluss</td><td>Yanagi</td><td>DP16-TN1000</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock-Stecker</td><td>ISIS</td><td>11620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipettenspitze</td><td>Eppendorf</td><td>0030 000.765</td><td></td></tr><tr><td>10 L Buchflasche mit Ventil</td><td>As One</td><td>1-2169-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-HV Filter</td><td>Millipore</td><td>SVHVL10RC</td><td>im gesamten ms als "Filterpatrone" bezeichnet und im Protokoll verwendet</td></tr><tr><td>Männliche Luer-Armatur</td><td>As One</td><td>1-7379-04</td><td></td></tr><tr><td>Weibliche Luer-Armatur</td><td>As One</td><td>5-1043-14&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Einlass-Luer-Kappe</td><td>ISIS</td><td>VRMP6</td><td></td></tr><tr><td>Auslass-Luer-Kappe</td><td>ISIS</td><td>VRFP6</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumschlauch</td><td>As One</td><td>6-590-01</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumanschluss</td><td>As One</td><td>6-663-02</td><td></td></tr><tr><td>Silikonstopfen</td><td>As One</td><td>1-7650-07</td><td></td></tr><tr><td>Verteiler</td><td>As One</td><td>2-258-01</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-GAS-1</td><td>As One</td><td>1-7483-21</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Tissue Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>14600-50-NF</td><td>gekennzeichnet als "optionales Kit" in der ms</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Kubota</td><td>Modell 4000</td><td>Maximale Drehzahl 6.000 U/min</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Kubota</td><td>AT-508C</td><td></td></tr><tr><td>Adapter für ein konisches 15-ml-Röhrchen</td><td>Kubota</td><td>055-1280</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilisierungslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>bezeichnet als "selbstklebende Folie"</td></tr></tbody></table>

die verwendung einer filterpatrone für die filtration von wasserproben und extraktion von umwelt-dna

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Verwendung von Umwelt-DNA (eDNA) von Fischen als nicht-invasives Überwachungsinstrument geeignet ist. Bei den meisten dieser Studien wurden Scheibenfaserfilter verwendet, um eDNA aus Wasserproben zu sammeln, obwohl in einer Reihe von mikrobiellen Studien in aquatischen Umgebungen Filterpatronen verwendet wurden, da die Patrone den Vorteil hat, große Wassermengen aufzunehmen und insgesamt einfach zu verwenden. Hier stellen wir ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit der Filterpatrone und die Extraktion von eDNA aus dem Filter zur Verfügung, ohne dass das Gehäuse aufgeschnitten werden muss. Die Hauptteile dieses Protokolls bestehen aus 1) Filtration von Wasserproben (Wasservolumen ≤4 l oder >4 l); (2) Extraktion der DNA auf dem Filter unter Verwendung eines Rollenschüttlers, der in einem vorgeheizten Inkubator platziert ist; und (3) die Aufreinigung von DNA mit einem kommerziellen Kit. Mit diesem und zuvor verwendeten Protokollen führen wir eine Metabarcoding-Analyse von eDNA durch, die aus einem riesigen Aquarienbecken (7.500m3) mit bekannter Artenzusammensetzung entnommen wurde, und zeigen die Anzahl der nachgewiesenen Arten pro Bibliothek aus den beiden Protokollen als repräsentative Ergebnisse. Dieses Protokoll wurde für das Metabarcoding von eDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch auf eDNA aus anderen Organismen anwendbar.

Es ist technisch schwierig zu isolieren und nur Fische EdNA aus dem extrahierten bulk EdNA quantifizieren, da die MiFish Primern den Zielbereich von einigen nicht-Fisch Vertebraten, wie Vögel und Säugetiere, mit PCR - Produkten der gleichen Größe coamplify (ca. 170 bp ) 12. Statt Fisch EDNA der Quantifizierung führen wir MiFish von Edna aus einem Aquarium Tank mit bekannten Artenzusammensetzung metabarcoding Analyse der zwei verschiedenen Methoden der Filtration und D...

Wir beschreiben ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit einer Filterpatrone und die Extraktion von Umwelt-DNA (eDNA), ohne dass das Gehäuse aufgeschnitten werden muss, um den Filter zu entfernen. Dieses Protokoll wurde für das Metabarcoding von eDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch auf eDNA aus anderen Organismen anwendbar.

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Wasserproben mithilfe einer Filterpatrone zu filtrieren und anschließend Umwelt-DNA zu extrahieren, ohne das Gehäuse öffnen zu müssen, um den Filter zur Metabarcoding-Analyse von eDNA verschiedener aquatischer Organismen zu entnehmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im ökologischen Bereich zu beantworten, beispielsweise im Bereich Biodiversitätsmonitoring und Gemeinschaftsökologie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Filterpatronen größere Wassermengen aufnehmen können und sowohl die Filtration als auch die DNA-Extraktion unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden können.Um dieses Verfahren zu beginnen, schließen Sie eine Vakuumschlauchleitung an den Eingangsanschluss einer Vakuumpumpe an. Verbinden Sie das andere Ende der Schlauchleitung mit einem Verteiler. Stellen Sie sicher, dass sich die drei roten T-Ventile am Verteiler in der Aus-Position befinden.Danach einen sauberen Satz Handschuhe anziehen. Ein weibliches Luer-Stück am oberen Ende des Vakuum-Gummischlauchs einsetzen. Anschließend am unteren Ende einen Vakuum-Verbinder einsetzen.Bringen Sie die weibliche Luer-Anschlussmuffe vorsichtig an einem Auslassstutzen der Filterpatrone an. Anschließend verbinden Sie den Vakuumanschluss mit einem Silikonstopfen. Gießen Sie einen Liter der Probenahmewasser in die vorbereitete Plastiktüte.Schließen Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock-Anschluss ein. Schließen Sie dann vorsichtig einen Einlassstutzen der zusammengesetzten Filterpatrone an den männlichen Luer-Lock-Anschluss an. Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen fest sitzen.Danach hängen Sie die Plastiktüte an zwei Zinken der Netzplatte auf. Setzen Sie einen Silikonstopfen in die Einlassöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie dann den Vakuumpumpenabscheider ein.Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Betreiben Sie das Manifold, bis die Filterpatrone trocken ist. Schließen Sie dann die roten T-Ventile.Wiederholen Sie diesen gesamten Vorgang, um die gewünschte Menge Wasser zu filtern. Sobald das gesamte Probenwasser filtriert wurde, entfernen Sie die Filterpatrone vorsichtig aus der Plastiktüte und dem Vakuumbehälter. Verschließen Sie beide Enden der Patrone mit den entsprechenden Luer-Kappen.Dann das Kartusche und die Inlet-Luer-Kappe mit einem lösungsmittelbeständigen Stift beschriften. Bei 20 Grad Celsius lagern, bis die DNA-Extraktion durchgeführt wird. Für Proben, die größer als vier Liter sind, eine zehn-Liter-Flasche gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereiten.Fügen Sie die zu filtrierende Wasserprobe hinzu. Stecken Sie dann eine zehn Milliliter-Pipettenspitze fest in das Ventil der Buchflasche. Stecken Sie den Einlass des Filterkartuschen fest in die Pipettenspitze.Danach einen Silikonstopfen in die Einlassöffnung des Verteilers einsetzen. Den Wasserstrahlpumpe einschalten. Danach die roten T-Ventile zur Filtration öffnen.Führen Sie den Manifold so lange aus, bis die Filterpatrone trocken ist. Schließen Sie nach Beendigung der Filtration die roten T-Ventile. Entfernen Sie die Patrone vorsichtig aus der Plastiktüte und dem Vakuumanschluss.Beide Enden der Kartusche anschließend mit den entsprechenden Luer-Kappen verschließen. Die Kartusche und die Einlass-Luer-Kappe mit einem lösungsmittelbeständigen Stift beschriften. Bis zur Durchführung der DNA-Extraktion bei 20 Grad Celsius lagern.Heizen Sie einen Inkubator auf 56 Grad Celsius vor. Schneiden Sie danach die Scharnierkappe von einem 2,0-Milliliter-Röhrchen ab und entsorgen Sie die Kappe. Entfernen Sie die Inlet-Luer-Kappe von der Filterpatrone.Danach wird der Einlassstutzen in das 2,0-Milliliter-Röhrchen eingeführt. Mithilfe einer selbstversiegelnden Folie wird die Verbindung zwischen der Kartusche und dem Sammelröhrchen fest abgedichtet. Anschließend wird die kombinierte Einheit in einen Zentrifugenadapter für ein 15-Milliliter-Konusröhrchen eingesetzt.Zentrifugieren Sie die Kartusche eine Minute lang mit 5000 × g, um die restliche Flüssigkeit im Filter zu entfernen. Nach Abschluss der Zentrifugation entfernen Sie das Sammelröhrchen von der Filterkartusche und entsorgen es. Danach verschließen Sie den Einlassstutzen erneut.Mischen Sie anschließend 20 µL Protein A-Case-Lösung, 220 µL gepufferte Kochsalzlösung und 200 µL Puffer AL. Entfernen Sie die Eingangsverschlusskappe und geben Sie die Mischung mit einer Pipette in die Kartusche, wobei Sie die Pipette vollständig in die Einlassöffnung einführen. Setzen Sie die Verschlusskappe auf die Einlassöffnung wieder auf. Stellen Sie danach die Filterkartusche auf einen Rüttelschüttler.Stellen Sie den Rüttelapparat in den vorgeheizten Inkubator und stellen Sie den Apparat auf 20 U/min für 20 Minuten ein. Während der Inkubation beschriften Sie ein neues 2,0-Milliliter-Röhrchen mit einem lösungsmittelbeständigen Stift. Anschließend stellen Sie es in ein 50-Milliliter-Konischröhrchen. Nach Beendigung der Inkubation das Einlass-Cap entfernen. Anschließend die Einlassöffnung in das neue 2,0-Milliliter-Röhrchen einführen. Das kegelförmige Röhrchen mit einem Schraubverschluss verschließen.Zentrifugieren Sie eine Minute bei 5000 × g, um die extrahierte DNA zu pelletieren. Entfernen Sie dann die Kartusche mit sterilisierten Pinzetten in ein 2,0-Milliliter-Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen und reinigen Sie die extrahierte DNA gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Bei diesem Verfahren werden vier verschiedene Volumina von Meerwasser auf demselben Vakuummanifold unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Filtern filtriert, und anschließend wird die eDNA extrahiert. Die Filterkassette detektierte im Durchschnitt 50 % mehr Arten als die Glasfaserfilter. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wasserproben mit einer Filterpatrone filtriert und wie man eDNA extrahiert, ohne das Gehäuse öffnen zu müssen, um den Filter zur Metabarcoding-Analyse von eDNA verschiedener aquatischer Organismen zu entnehmen.

use-filter-cartridge-for-filtration-water-samples-extraction

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Dieses Protokoll ist für die Extraktion und Konzentration von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse, die aus Meerwasser gesammelt wurde, gefolgt von der Erzeugung von tryptischen Peptiden, die für die Tandem-Massenspektrometrie-basierte Proteomanalyse geeignet sind.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Zwei komplementäre Analysen von atmosphärischen biologischen Partikeln aus Luftprobefiltern werden hier beschrieben: die Extraktion und der Nachweis von Endotoxin und von DNA.

Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Auswirkungen des Hydraulic Fracturing auf nahe gelegene Bäche zu untersuchen, indem wir ihre mikrobiellen Wasser- und Sedimentgemeinschaften analysieren.

Bewertung der Auswirkungen von Hydraulic Fracturing auf Bäche mit mikrobiellen molekularen Signaturen

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Hier stellen wir ein neuartiges Protokoll zur Gewinnung mariner eDNA durch die Entnahme und Filtration von Meerwasserproben von in Betrieb befindlichen Fähren und anderen Handelsschiffen vor.

Das schwimmende Labor: Standardverfahren zum Sammeln und Filtern von Meerwasserproben von in Betrieb befindlichen Fähren für die Umwelt-DNA-Analyse

Zuverlässige und präzise Formen der vor Ort einsetzbaren DNA-Analysen sind für viele Branchen entscheidend. Dieses Papier bietet zwei Methoden für die Umweltmikrobienanalyse im Feld: 1) die Isolierung mikrobieller DNA aus Umweltproben mittels eines biologischen Extraktions-Feldkits und 2) die Analyse der DNA über die Feld-qPCR-Einheit.

Mikrobielle DNA-Analyse im Feld mit einem biologischen Extraktions-Feldkit und einer Feld-qPCR-Einheit

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Workflow zur Sammlung von Umwelt-DNA-Proben von Walbeobachtungsschiffen. Die Machbarkeit für Forscher und ausgebildete Bürgerwissenschaftler wird priorisiert, während Umweltbedingungen, Filtrationszeit, Trübung und Bordlogistik die praktischen Grenzen ihrer Anwendung definieren.

Umwelt-DNA-Probenahme von Walbeobachtungsschiffen zur Überwachung von Walwalen

Erfahren Sie die Filterung von Wasserproben mit einer Filterpatrone zur Extraktion von Umwelt-DNA ohne Öffnen des Gehäuses. Diese Methode ermöglicht metabarcoding von eDNA aus aquatischen Organismen für ökologische Biodiversitätsüberwachung.

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

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