Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Wasserproben mit einer Filterpatrone zu filtern und Umwelt-DNA zu extrahieren, ohne das Gehäuse aufschneiden zu müssen, um den Filter von Metabarcoding-eDNA verschiedener Wasserorganismen zu entfernen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im ökologischen Bereich zu beantworten, wie z.B. das Biodiversitätsmonitoring und die Ökologie der Lebensgemeinschaften. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Filterpatronen größere Wassermengen aufnehmen können und die Filtration und DNA-Extraktion steril durchgeführt werden kann.

Um diesen Vorgang zu starten, schließen Sie einen Hochvakuumschlauch an den Eingangsanschluss einer Absaugpumpe an. Befestigen Sie das andere Ende des Schlauchs an einem Verteiler. Stellen Sie sicher, dass sich die drei roten T-Ventile am Verteiler in der Aus-Position befinden.

Ziehen Sie als Nächstes einen sauberen Satz Handschuhe an. Setzen Sie eine weibliche Luer-Armatur am oberen Ende des Vakuumgummischlauchs ein. Stecken Sie dann am unteren Ende einen Vakuumstecker ein.

Befestigen Sie die weibliche Luer-Armatur vorsichtig an einer Auslassöffnung der Filterpatrone. Befestigen Sie dann den Vakuumstecker an einem Silikonstopfen. Gießen Sie einen Liter probiertes Wasser in die vorbereitete Plastiktüte.

Schließen Sie den Schraubverschluss mit dem männlichen Luer-Lock-Anschluss ein. Verbinden Sie dann vorsichtig eine Einlassöffnung der montierten Filterpatrone mit dem Luer-Lock-Stecker. Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen sicher sind.

Hängen Sie dann die Plastiktüte an zwei Zinken an die Netzplatte. Setzen Sie einen Silikonstopfen in die Einlassöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie dann den Sauger ein.

Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Lassen Sie den Verteiler laufen, bis die Filterpatrone trocken ist. Schließen Sie dann die roten T-Ventile.

Wiederholen Sie den gesamten Vorgang, um die gewünschte Menge Wasser zu filtern. Sobald das gesamte beprobte Wasser gefiltert wurde, nehmen Sie die Filterpatrone vorsichtig aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumbehälter. Verschließen Sie beide Enden der Patrone mit den entsprechenden Luer-Kappen.

Beschriften Sie dann mit einem lösungsmittelbeständigen Stift die Patrone und die Luer-Kappe des Einlasses. Bei 20 Grad Celsius lagern, bis die DNA-Extraktion durchgeführt werden kann. Bereiten Sie für Proben, die größer als vier Liter sind, eine Zehn-Liter-Buchflasche vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie die zu filtrierende Wasserprobe hinzu. Führen Sie dann eine Zehn-Milliliter-Pipettenspitze fest in das Ventil der Buchflasche ein. Stecken Sie die Einlassöffnung der Filterpatrone fest in die Pipettenspitze.

Setzen Sie dann einen Silikonstopfen in die Einlassöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie den Sauger ein. Öffnen Sie dann die roten T-Ventile für die Filtration.

Lassen Sie den Verteiler laufen, bis die Filterpatrone trocken ist. Nachdem die Filtration abgeschlossen ist, schließen Sie die roten T-Ventile. Entfernen Sie die Kartusche vorsichtig aus der Plastiktüte und dem Vakuumanschluss.

Verschließen Sie dann beide Enden der Patrone mit den entsprechenden Luer-Kappen. Verwenden Sie einen lösungsmittelbeständigen Stift, um die Patrone und die Luer-Kappe im Einlass zu beschriften. Bei 20 Grad Celsius lagern, bis die DNA-Extraktion durchgeführt werden kann.

Heizen Sie einen Inkubator auf 56 Grad Celsius vor. Schneiden Sie dann den Klappdeckel aus einem 2,0-Milliliter-Röhrchen ab und entsorgen Sie den Deckel. Entfernen Sie die Luer-Einlasskappe von der Filterpatrone.

Setzen Sie dann die Einlassöffnung in das 2,0-Milliliter-Röhrchen ein. Verschließen Sie mit einer selbstklebenden Folie die Verbindung zwischen der Kartusche und dem Auffangröhrchen. Setzen Sie dann die kombinierte Einheit in einen Zentrifugenadapter für ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen ein.

Zentrifugieren Sie die Kartusche eine Minute lang bei 5000 mal g, um die restliche Flüssigkeit im Filter zu entfernen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Sammelröhrchen aus der Filterpatrone und entsorgen Sie das Röhrchen. Verschließen Sie dann die Einlassöffnung wieder.

Mischen Sie anschließend 20 Mikroliter Protein-A-Case-Lösung, 220 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung und 200 Mikroliter Puffer AL. Entfernen Sie die Einlasskappe und geben Sie die Mischung mit einer Pipette in die Kartusche, wobei Sie die Pipette vollständig in die Einlassöffnung einführen. Verschließen Sie die Einlassöffnung. Setzen Sie dann die Filterpatrone auf einen Rotationsschüttler.

Stellen Sie den Rotationsschüttler in den vorgeheizten Inkubator und stellen Sie den Schüttler für 20 Minuten auf 20 U/min. Während der Inkubation beschriften Sie ein neues 2,0-Milliliter-Röhrchen mit einem lösungsmittelbeständigen Stift. Geben Sie es dann in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Entfernen Sie nach Abschluss der Inkubation die Einlasskappe. Setzen Sie dann die Einlassöffnung in das neue 2,0-Milliliter-Rohr ein. Verschließen Sie das konische Rohr mit einem Schraubverschluss.

Eine Minute lang bei 5000 mal g zentrifugieren, um die extrahierte DNA zu sammeln. Entfernen Sie dann die Kartusche im 2,0-Milliliter-Röhrchen mit einer sterilisierten Pinzette. Verschließen Sie das Röhrchen und reinigen Sie die extrahierte DNA, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bei diesem Verfahren werden vier verschiedene Volumina Meerwasser auf demselben Verteiler mit zwei einzigartigen Filtern gefiltert und anschließend die eDNA extrahiert. Die Filterpatrone erkannte im Durchschnitt 50 % mehr Spezies als die Glasfaserfilter. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wasserproben mit einer Filterpatrone filtert und wie man eDNA extrahiert, ohne das Gehäuse aufschneiden zu müssen, um den Filter aus dem Metabarcoding von eDNA von verschiedenen Wasserorganismen zu entfernen.