Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sowohl Lysin- als auch Arginin-Monomere innerhalb derselben Peptoidsequenz einzuführen und die Aktivität dieser Verbindungen gegen Leishmania mexicana, die Erreger der vernachlässigten Tropenkrankheit kutane Leishmaniose, zu bewerten. Neuartige Therapeutika für kutane Leishmaniose werden dringend benötigt, und dieses Verfahren kann dazu beitragen, Peptoide als eine neue Klasse potenzieller Antiinfektiva für diese vernachlässigte Tropenkrankheit zu identifizieren und zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass Peptoide synthetisiert werden können, die gemischte kationische Funktionalität enthalten.

Dies ist sehr wünschenswert, da es dazu beitragen kann, die biologischen Aktivitäten der Sequenzen zu modulieren. Obwohl dies gegen die Säugetierform des Parasiten getestet wird, kann es auch gegen das Insektenstadium von Leishmania mexicana oder auf Säugetierzelllinien angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist sehr nützlich, da sie die schrittweise Natur der Synthese und auch die Parasitenkultur zu verschiedenen Zeitpunkten im Lebenszyklus von Leishmania mexicana zeigt.

Bereiten Sie zu Beginn dieses Verfahrens Lösungen in Dimethylformamid vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie dann 0,1 Millimol Fmoc-geschütztes Eisamidharz in ein verschlossenes 20-Milliliter-Polypropylen-Reaktionsgefäß mit zwei Fritten. Fügen Sie fünf Milliliter Dimethylformamid hinzu und lassen Sie das Gefäß 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Lassen Sie dann das ZMS mit einer Festphasen-Extraktionsvakuumplattform ab. Fügen Sie anschließend zwei Milliliter vorbereitete Piperidinlösung hinzu. Stellen Sie das Gefäß bei 450 U/min bei Raumtemperatur auf eine Schüttelplattform und schütteln Sie es fünf Minuten lang.

Lassen Sie die Lösung mit der Vakuumstation ab. Fügen Sie dann zwei Milliliter Piperidinlösung hinzu und schütteln Sie sie 15 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen. Nach Beendigung des Schüttelns die Lösung über eine Vakuumstation abtropfen lassen.

Fügen Sie zwei Milliliter DMF hinzu und mischen Sie 30 Sekunden lang, um das Harz zu waschen. Lassen Sie das DMF ab und wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Um mit der Submonomersynthese zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter vorbereitete Bromessigsäurelösung und 0,2 Milliliter vorbereitete DIC-Lösung hinzu.

20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Lassen Sie dann die Lösung ab und waschen Sie sie dreimal mit jeweils zwei Millilitern DMF. Fügen Sie einen Milliliter vorbereitete Aminlösung hinzu.

Schütteln Sie dann das Harz 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung ab und waschen Sie das Harz dreimal mit jeweils zwei Millilitern DMF. Fügen Sie anschließend einen Milliliter Bromessigsäurelösung und 0,2 Milliliter DIC-Lösung hinzu.

20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Lassen Sie dann die Lösung ab und waschen Sie sie dreimal mit jeweils zwei Millilitern DMF. Um ein Guanidin-funktionalisiertes Monomer einzuführen, fügen Sie dem Harz einen Milliliter ungeschützte Diaminlösung hinzu.

60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Lassen Sie dann die Lösung ab und waschen Sie das Harz dreimal mit zwei Millilitern DMF. Fügen Sie 0,5 Milliliter der vorbereiteten 2-Acetyldimedon-Lösung hinzu.

60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Lassen Sie dann die Lösung ab und waschen Sie das Harz dreimal mit zwei Millilitern DMF. Setzen Sie die Submonomersynthese fort, bis die gewünschte Sequenz hergestellt ist.

Fügen Sie dann vier Milliliter vorbereitete Hydrazinlösung hinzu und schütteln Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung ab und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Waschen Sie dann das Harz dreimal mit zwei Millilitern DMF für jede Wäsche.

DIPEA und sechs Äquivalente von Pyrazol-1-Carboxamidin pro freiem Amin in die Peptoidsequenz geben. 60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Nachdem das Schütteln abgeschlossen ist, lassen Sie die Lösung ab.

Waschen Sie das Harz dreimal mit zwei Millilitern Dichlormethan pro Wäsche. Trockne das Harz 10 Minuten lang an der Luft und bewahre es für die zukünftige Verwendung auf. Nach der Zugabe von Aminen kann eine Testspaltung durchgeführt werden, um den Fortschritt der Synthese zu überprüfen.

Um mit der endgültigen Spaltung zu beginnen, geben Sie vier Milliliter Spaltungscocktail in dieselbe frittierte Reaktionspatrone, die für die Synthese verwendet wird, und decken Sie das Gefäß ab. 90 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Filtrieren Sie dann mit dem gefrittenen Reaktionsgefäß den Spaltcocktail aus dem Harz in einen Kolben mit rundem Boden.

Verdampfen Sie den Dekolleté-Cocktail mit einem Rotationsverdampfer. Fügen Sie zwei Milliliter wasserfreien Diethylether hinzu, um das Peptoid auszufällen. Entfernen Sie den Diethylether mit einer Pipette und entsorgen Sie ihn.

Wiederholen Sie dann die Diethylether-Fällung dreimal. Sobald die Fällung abgeschlossen ist, lösen Sie das rohe Peptoid in 10 Millilitern vorbereitetem Acetonitril und angesäuerter Wasserlösung auf. In einen vorgewogenen Behälter umfüllen.

Anschließend bei minus 20 Grad Celsius einfrieren und zu einem trockenen Pulver lyophilisieren, das für die Reinigung durch Umkehrphasen-HPLC bereit ist. Nach der Kultivierung der Leishmania mexicana-Parasiten und der Umwandlung in das axenische Amastigotenstadium beginnen Sie den Zytotoxizitätstest, indem Sie zusammengesetzte Stammlösungen herstellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie zwei Mikroliter Fünf-Millimola-Peptoid-Stammlösung, Amphotericin B-Kontrolle und DMSO-Kontrolle in die obere Reihe einer 96-Well-Platte, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 48 Mikroliter frisches Medium in die obere Reihe. Geben Sie 25 Mikroliter frisches Medium in alle anderen Reihen. Führen Sie anschließend eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 25 Mikroliter Lösung aus der oberen Reihe pipettieren, sie in die untere Reihe geben und mischen.

Wiederholen Sie die Verdünnungen für die gesamte Platte, indem Sie die letzten 25 Mikroliter aus der unteren Reihe pipettieren lassen. Übertragen Sie dann eine Parasitenkultur in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 447 mal g.

Gießen Sie das alte Medium ab und fügen Sie 10 Milliliter frisches Medium hinzu. Anschließend das Pellet der Parasiten mit einer Pipette vorsichtig in das neue Medium resuspendieren. Zählen Sie mit einem verbesserten Neubauer-Hämozytometer und verdünnen Sie die Kultur auf acht Millionen Parasiten pro Milliliter.

Nachdem die Kultur verdünnt wurde, geben Sie 25 Mikroliter Parasiten in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 60 Minuten lang bei 32 Grad Celsius. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entnehmen Sie 40 Mikroliter Lösung aus jeder Vertiefung.

Geben Sie 90 Mikroliter frisches Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 32 Grad Celsius. Geben Sie dann 10 Mikroliter Resazurin-basierte Zellviabilitätslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie vier Stunden lang bei 32 Grad Celsius.

Verwenden Sie nach Abschluss der Inkubation einen Plattenleser, um die Fluoreszenz zu messen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den durchschnittlichen Hintergrund entfernen und die Fluoreszenz der Wells nach der Normalisierung mit resect mit den DMSO-Kontrollen vergleichen. In dieser Studie werden zwei Peptoide mit jeweils 120 Milligramm Eisamidharz synthetisiert.

Die Produkte werden mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt, und die Fraktionen, die der Zielmasse entsprechen, werden kombiniert und als weiße Pulver erhalten. Die für die beiden Peptoide gesammelte Menge ist hier dargestellt, mit Ausbeuten von ca. 30 % für Fraktionen über 90 % Reinheit. Die Produktreinheit wird mit einer analytischen Umkehrphasen-HPLC bewertet und bei 220 Nanometern, der Absorption des Amidrückgrats, visualisiert.

Die Peptoide gelten beide als homogen. Die repräsentativen Ergebnisse der Zytotoxizitätsassays gegen L Mexicana sind hier dargestellt. Fünf-Millimolar-Stammlösungen der Verbindungen werden in DMSO in Zellkulturqualität hergestellt und mindestens zweimal in dreifacher Ausführung getestet, um robuste Daten zu gewährleisten.

Es ist ersichtlich, dass Peptoid B bei der Reduzierung des Anteils lebensfähiger Parasiten wirksamer ist als Peptoid A, wobei beide eine dosisabhängige Wirkung haben. Nachdem Sie sich diese Methode angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Peptoide synthetisiert, charakterisiert und reinigt, die sowohl Lysin- als auch Arginin-Monomere enthalten, und wie man diese in Zytotoxizitätsassays gegen Leishmania mexicana verwendet. Unsere Methode, Peptoiden duale kationische Funktionalität hinzuzufügen, fügt der häufig verwendeten Submonomermethode der Peptoidsynthese nur einen zusätzlichen einfachen Schritt hinzu.

Nach dieser Methode können Submonomere vom Lysin- oder Arginin-Typ unterschiedlicher Länge hinzugefügt werden, um die Bibliotheksvielfalt zu erhöhen, z. B. mit Seitenketten von zwei bis sechs Kohlenstoffen Länge. Beim Versuch der Peptoidsynthese ist es wirklich wichtig, daran zu denken, das Harz zwischen den Schritten gut zu waschen, um unerwünschte Additions- oder Deletionsprodukte zu vermeiden. Diese Methode ebnet den Forschern den Weg, die biologische Aktivität von gemischten kationisch-funktionalisierten Peptoiden zu untersuchen und diese Aktivität mit solchen zu vergleichen, die ausschließlich Lysin- oder Arginin-Monomere enthalten.

Vergessen Sie schließlich nicht, dass die Parasiten und einige der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien äußerst gefährlich sein können. Daher ist es wichtig, immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung zu verwenden und gegebenenfalls in einem Abzug oder einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank zu arbeiten.