hyperpolarisiertem ¹³ C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kohlenstoff-13-markierte Moleküle mittels dynamischer Kernpolarisation zu hyperpolarisieren und ihre energetische Umwandlung mittels Kohlenstoff-13-Magnetresonanz, retroskopischer Bildgebung, in vitro zu messen. Diese Methode erhöht das Resonanzsignal von Kohlenstoff um das 10.000- bis 100.000-fache, so dass die geschichteten Verbindungen von ihren Stoffwechselprodukten unterschieden und durch Bildgebung im Körper lokalisiert werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu den VR-Techniken besteht darin, dass sie einen Blick auf den Stoffwechsel von natürlich vorkommenden Substanzen in lebenden Organismen in Echtzeit ermöglicht.

Auch diese Methode kann einen Einblick in den Stoffwechsel von Krebs geben, und zwar in vitro. Es kann auch auf Tiermodelle und menschliche Patienten angewendet werden. Die Anwendung dieser Technik geht über die Tumorlokalisation hinaus.

Es kann verwendet werden, um metabolische Tumorsubtypen zu finden und zu unterscheiden und die Behandlung zusammen mit modernsten Techniken zu überwachen. Zu Beginn des Verfahrens bereiten Sie zunächst eine millimolare Lösung von Gadoterat, Meglumin und konzentriertem 13-Kohlenstoff-Pyruvat vor. Geben Sie Tritylradikal OX063 zu der Mischung, um eine Endkonzentration von 15 Millimolar zu erreichen, und lösen Sie es vollständig auf.

Klicken Sie in der DNP-Polarisator-Software auf "Abkühlen", um die Temperatur des variablen Temperatureinsatzes (VTI) unter 1,4 Kelvin zu senken. Sobald der VTI abgekühlt ist, geben Sie etwa acht Mikroliter der mit Kohlenstoff-13 markierten Probenlösung in einen Probenbecher aus Kunststoff. Befestigen Sie den Becher an der Probeneinführstange.

Klicken Sie in der Software auf Probe einfügen'Normale Probe auswählen'und dann auf Weiter'Dadurch wird der Probenhalter angehoben und die Einlassventile zum VTI geöffnet, wodurch das Einführen der Probe ermöglicht wird. Verwenden Sie bei der Eingabeaufforderung die Einführstange, um den Probenbecher in den VTI zu schieben. Nehmen Sie den Probenbecher ab und ziehen Sie den Einführstab vorsichtig heraus.

Vergewissern Sie sich, dass sich die Probe vom Stab gelöst und während des Verschließvorgangs nicht aus dem VTI gedrückt wurde. Klicken Sie auf Weiter', um die Ventile zu schließen und den Probenbecher in das flüssige Helium abzusenken, und klicken Sie dann auf Fertig'Um eine optimale Polarisationsfrequenz zu finden, starten Sie zuerst die RINMR-Software. Klicken Sie im Konfigurationsbildschirm auf "Probe auswählen" und führen Sie "Micro Sweep" durch. Erstellen Sie die Datei, in der die Daten gespeichert werden.

Wechseln Sie zurück zur DNP Polarisator Software. Wählen Sie die Registerkarte "Kalibrieren" aus, legen Sie die Parameter für den Mikrowellen-Sweep fest, und starten Sie dann den Mikrowellen-Sweep-Prozess. Sobald der Mikrowellen-Sweep beendet ist, notieren Sie sich die Frequenz mit einer maximal gemessenen Signalamplitude.

Kehren Sie zur RINMR-Software zurück und wählen Sie Feststoffaufbau"Klicken Sie dann in der DNP-Polarisator-Software auf Polarisation"Geben Sie die optimale Mikrowellenfrequenz und die Leistung ein. Klicken Sie auf Weiter'Polarisationsaufbauüberwachung aktivieren' und klicken Sie auf Fertig'Polarisieren Sie die Probe für einen ausreichend langen Zeitraum, um eine Polarisation von über 95% zu erreichen. Schließen Sie während der Polarisation einen Auffangkolben an das Abluftrohr der Hyperpolarisator-Probe an und platzieren Sie ihn in der Nähe des Spektrometers.

Richten Sie ein Ein-Tesla-NMR-Spektrometer mit der 13-Kohlenstoff-Scan-Serie von 110-Grad-HF-Pulsen im Drei-Sekunden-Intervall ein. Beginnen Sie während der Pyruvatpolarisation mit der Vorbereitung der Zellkultur. Entfernen Sie das Zellmedium aus den Zellkulturflaschen.

Waschen Sie die Zellen mit etwa 10 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie fünf Milliliter Trypsin in den Kulturkolben. Inkubieren Sie die Kultur drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und deaktivieren Sie dann das Trypsin mit etwa fünf Millilitern F12K-Medium, das 10 Vol.-% fötales Kälberserum enthält.

Übertragen Sie dann das Volumen der Zellsuspension mit der gewünschten Anzahl von Zellen in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Die Zellprobe wird fünf Minuten lang bei 1200 g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in ausreichend F12K-Medium mit 10 % FCS, um ein Endvolumen von 800 Mikrolitern zu erreichen.

Füllen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen in einen mit warmem Wasser gefüllten Plastikbehälter. Um mit der Datenerfassung mittels Kohlenstoff-13-Magnetresonanzspektroskopie zu beginnen, klicken Sie, sobald die Zellprobe vorbereitet ist und die Pyruvatpolarisation mehr als 95 Prozent beträgt, in der DNP-Polarisator-Software auf "Auflösung ausführen". Laden Sie das gemessene Volumen des Auflösungsmittels über das obere Ventil der Auflösungskammer.

Bewegen Sie den Dissolution-Stick in die aktive Position. Bestätigen Sie mit einem Klick auf Weiter'Sobald die Zellprobe für das Experiment bereit ist', klicken Sie in der DNP Polarizer Software auf 'Fertig', um den Auflösungsprozess zu initialisieren. Warten Sie, bis der Auflösungsprozess abgeschlossen ist.

Geben Sie 200 Mikroliter der hyperpolarisierten Pyruvatlösung zu 800 Mikrolitern der Zellprobe. Mit einer Pipette gut mischen und dann etwa 600 Mikroliter der Mischung in ein fünf Millimeter großes NMR-Röhrchen geben. Laden Sie die NMR-Röhre in das Spektrometer und klicken Sie auf "Ausführen", um die Messung zu starten.

Bewegen Sie dann den Auflösungstab mit dem angeschlossenen Probenbecher in die Reinigungsposition und klicken Sie in der DNP-Polarisator-Software auf "Fertig". Um mit der Kohlenstoff-13-Magnetresonanztomographie zu beginnen, werden nach dem Start des Hyperpolarisationsprozesses 800 Mikroliter resuspendierter Zellproben mit einer Zellzahl von mindestens 10 auf das Achtel in eine Drei-Milliliter-Spritze überführt. Schließen Sie die Spritze an einen langen Katheter an und legen Sie die Spritze auf ein MRT-Untersuchungsbett.

Stellen Sie sicher, dass der Katheter lang genug ist, um nach außen aus dem MRT-Scanner zu greifen. Platzieren Sie ein Kalibrierphantom, das zehn molare Kohlenstoff-13-Harnstoffe mit 10 %igem Gadoterat-Meglumin enthält, neben der Spritze. Setzen Sie eine auf Carbon 13 abgestimmte HF-Empfängerspule auf die Spritze.

Setzen Sie das Scanbett so in den Scanner ein, dass sich das Objekt von Interesse im Isozentrum des MRT-Scanners befindet. Verbinden Sie den Verbindungskolben mit dem Abluftrohr der Hyperpolarisator-Probe und platzieren Sie ihn in der Nähe des Endes des Katheters. Führen Sie eine standardmäßige Lokalisierungssequenz mit drei Ebenen durch und passen Sie die Position der Spritze bei Bedarf an.

Richten Sie dann eine T2-gewichtete anatomische Sequenz des Protons ein und führen Sie sie durch, die die Lokalisation der Spritze abdeckt. Wählen Sie aus den resultierenden anatomischen Bildern fünf zusammenhängende Schichten der interessierenden Region aus, einschließlich des Kohlenstoff-13-Phantoms. Richten Sie eine spektroskopische Kohlenstoff-13-Kalibrierungserfassung ein und wählen Sie die 2D-Block-Siegert-Kalibrierungssequenz aus der Pulssequenzbibliothek aus.

Laden Sie die Pulssequenz auf den Scanner herunter und führen Sie einen spektroskopischen Pre-Scan durch. Legen Sie im Spektrumsgrößendiagramm den Phantompeak der Kohlenstoff-13-Kalibrierung auf den Mittelpunkt der Scannerfrequenz fest. Stellen Sie die Empfängerverstärkung auf Maximum ein und klicken Sie auf Scannen, um die Kalibrierungssequenz auszuführen.

Zeichnen Sie die gemeldete Sendeverstärkung und Zentrierfrequenz auf. Richten Sie dann eine Aufnahme der chemischen Kohlenstoffverschiebung für die ausgewählten anatomischen Schnitte ein. Wählen Sie die echoplanare spektroskopische 2D-Bildgebungssequenz und laden Sie die Pulssequenz auf den Scanner herunter.

Führen Sie den spektroskopischen Pre-Scan durch und passen Sie die Zentrierfrequenz und die Sendeverstärkung basierend auf den Kalibrierungswerten an, um die Einrichtung des MRT-Spektrometers abzuschließen. Sobald das Pyruvat eine Polarisation von 95 % erreicht hat, klicken Sie in der DNP Polarizer-Software auf "Auflösung ausführen" und laden Sie das Auflösungsmittel. Bewegen Sie den Dissolution-Stick in die aktive Position.

Klicken Sie auf "Weiter" und dann auf "Fertig"Wenn die gelöste hyperpolarisierte Probe den Sammelkolben erreicht, ziehen Sie etwa 1 Milliliter der hyperpolarisierten Lösung in eine Spritze und injizieren Sie sie in den Katheter, so dass 200 Mikroliter die Zellprobe erreichen. Klicken Sie auf Scannen, um die Erfassung der experimentellen Daten zu starten. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, bewegen Sie den Auflösungstab mit dem angeschlossenen Probenbecher in die Reinigungsposition und klicken Sie in der DNP NMR-Software auf Fertig.

Die metabolische Austauschrate von Pyruvat zu Laktat wurde in PC3-Zellen des Prostatakarzinoms untersucht, indem die Signalintensitäten der Kohlenstoff-13-NMR-Spektroskopie von hyperpolarisiertem Laktat und Pyruvat in Bezug auf Frequenz und Zeit überwacht wurden. Die kinetischen Laktatwerte wurden mit einem einfachen Verhältnismodell und mit einem Zwei-Standort-Austauschdifferentialmodell ausgewertet und auf die Anzahl der Zellen normiert. In beiden Modellen wurde ein Trend zu abnehmender Laktatproduktion mit zunehmender Zellzahl beobachtet.

Dies wird auf höhere Zellkonzentrationen und eine höhere Viskosität der Probe zurückgeführt. Proben mit Zellzahlen unter zwei mal zehn bis sieben zeigen ein sehr kleines Laktatsignal-Rausch-Verhältnis und daher große Standardabweichungswerte, was darauf hindeutet, dass Proben mindestens diese Anzahl von Zellen enthalten sollten, um aussagekräftige Daten zu erhalten. Die räumliche Lokalisierung wurde mit der MRT mit einer guten spektralen Auflösung erreicht, so dass Kohlenstoff-13-Bilder für bestimmte Frequenzbereiche aufgenommen werden konnten.

Die räumliche Verteilung wurde aus den Rohdaten ermittelt. Das Kohlenstoff-13-Bild könnte auch mit dem zuvor aufgenommenen Protonenbild mitregistriert werden. Einmal gemeistert und richtig durchgeführt, kann dieses Experiment in weniger als 60 Minuten durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Hyperpolarisation eines gewünschten Moleküls mit der dynamischen Kernpolarisationstechnik durchführt und wie man einfache NMR-Spektroskopie und Zellbildgebungsexperimente durchführt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sehr schnell zu sein. Nachdem die hyperpolarisierte Probe den Polarisator verlassen hat, denken Sie daran, dass Sie Ihr gesamtes gewonnenes NMR-Signal in weniger als zwei Minuten verlieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Dissolution DNP für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Dazu gehört die Untersuchung von Krankheiten wie Diabetes oder die Untersuchung von Stoffwechselveränderungen verschiedener Krebsarten, aber auch die Messung des pH-Werts des Gewebes.