Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Das übergeordnete Ziel der Methode des Hybridschnitts ist es, die Integrität von geschnittenen widerspenstigen Pflanzengeweben mit zähen Fasern und Siliziumdioxidkristallen zu verbessern, um geeignete Gewebeproben für anatomische und biologische Studien zu erhalten. Pflanzen, die einen hohen Gehalt an Kristallen und Kieselsäure enthalten, können beim Schneiden schwere Paraffinrisse und Probleme erleiden. Diese Methode verbessert die Integrität des Gewebes erheblich.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Schneiden bei extrem niedrigen Temperaturen im Kryostaten den Paraffinblock härtet, wodurch das Problem der Kristallscherung erheblich reduziert wird. Die Anwendung dieser Technik kann sich unter anderem auf die In-situ-Hybridisierung, FISH und die interne Bewertung erstrecken. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sich die Schritte, um sicherzustellen, dass der Paraffinblock fest an einem Tisch haftet, als schwierig erweisen können.

Wählen Sie zunächst reife Phalaenopsis-Orchideenpflanzen im Fünfblattstadium aus. Entfernen Sie vorsichtig die Blätter, indem Sie sie entlang der Mittelrippe abreißen. Entferne mit einem scharfen Skalpell vorsichtig die Achselknospen von der Basis des dritten oder vierten Blattes des Monopodialsystems.

Geben Sie die Proben sofort in ein Szintillationsglasfläschchen mit 15 Millilitern eiskaltem PFA-Fixiermittel. Üben Sie ein Vakuum auf die Proben im Fixiermittel bei vier Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten aus. Aus den Proben werden kleine Blasen freigesetzt.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die meisten Proben nach dem Lösen des Vakuums absinken. Halten Sie den Staubsauger schließlich über Nacht und lassen Sie ihn am nächsten Tag langsam los. Tauchen Sie anschließend die fixierten Proben in 15 Milliliter PBS und legen Sie sie 15 Minuten lang auf Eis.

Dehydrieren Sie die Proben in 15 Millilitern Ethanol in einer Reihe ansteigender Konzentrationen. 30 %50 %70 %85 %95 % und schließlich 100 %Infiltrieren Sie die Proben mit 15 Millilitern einer Mischung aus Ethanol und Xylolersatz von zwei zu eins bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Infiltration fort, indem Sie die Proben nacheinander in 15 Milliliter der folgenden Proben geben.

Ein Eins-zu-Eins-Volumen-Gemisch aus Ethanol und Xylol-Ersatz, ein Eins-zu-Volumen-Gemisch aus Ethanol und Xylol-Ersatz und schließlich ein reiner Xylol-Ersatz. Dann inkubierst du die Taschentücher in einem Ofen bei 60 Grad Celsius. Infiltrieren Sie die Proben mit 15 Millilitern Xylolersatz und Paraffingemisch bei 60 Grad Celsius.

Zum Schluss infiltrieren Sie Paraffin in 15 Millimeter reinem Paraffin zweimal für jeweils 12 Stunden bei 60 Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag. Um mit dem Einbetten zu beginnen, erwärmen Sie zuerst die Metallformen auf 62 Grad Celsius und gießen Sie dann etwa 13 Milliliter geschmolzenes Wachs in den Formboden.

Übertragen Sie mit einer erwärmten Pinzette eine Gewebeprobe in die Form und richten Sie sie in die gewünschte Position aus. Schieben Sie die Form vorsichtig auf die Kühlplatte und lassen Sie sie stehen, bis das Wachs erstarrt ist. Schneiden Sie anschließend den Paraffinprobenblock mit einer Rasierklinge in eine entsprechend große Säule mit einer trapezförmigen Oberfläche an der Spitze.

Geben Sie 800 Mikroliter optische Schneidtemperaturverbindung (OCT) in die Mitte des Kryostattisches. Legen Sie den Paraffinblock auf den Tisch und richten Sie den Gewebeblock schnell in die gewünschte Position aus. Übertragen Sie den Paraffinblock und die Bühne in eine Kristallkammer.

Frieren Sie das OCT bei minus 42 Grad Celsius für 10 Minuten ein. Kühlen Sie anschließend den Crystat-Adapter und die Kammertemperatur auf minus 20 Grad Celsius bzw. minus 16 Grad Celsius ab. Befestigen Sie den Block und den Tisch an den Crystat-Adapter.

Schneiden Sie nun das Gewebe auf eine Dicke von 10 Mikrometern. Nehmen Sie die Gewebeschnitte mit einer Pinzette auf und platzieren Sie sie so, dass sie auf 800 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser auf einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger schwimmen. Übertragen Sie die Objektträger auf eine auf 42 Grad Celsius eingestellte Kochplatte.

Lassen Sie die Abschnitte flach drücken und verwenden Sie Filterpapier, um das Wasser von den Rändern aufzusaugen. Lassen Sie die Probe über Nacht bei 42 Grad Celsius auf der Heizplatte, damit das Gewebe auf dem Objektträger befestigt werden kann. Um die Proben zu entparaffinisieren, legen Sie zunächst die montierten Objektträger in ein Färbegestell.

Geben Sie 150 Milliliter Xylol in ein Färbeglas und tauchen Sie das Gestell mit den Objektträgern fünf Minuten lang ein. Rehydrieren Sie anschließend die Proben, indem Sie sie in abnehmenden Ethanolkonzentrationen von jeweils 150 Millilitern jeweils drei Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahren. Tauchen Sie die Proben schließlich drei Minuten lang in doppelt destilliertes Wasser.

Färben Sie die Proben, indem Sie die Objektträger 1,5 Minuten lang in 150 Milliliter Hämatoxylinlösung legen. Spülen Sie einige Sekunden lang in 150 Millilitern doppelt destilliertem Wasser, das ein bis zwei Tropfen N-Salzsäure enthält, und waschen Sie die Objektträger dann kurz mit doppelt destilliertem Wasser. Die Proben werden erneut mit einer Reihe von 150 Millilitern steigender Ethanolkonzentration drei Minuten lang bei Raumtemperatur dehydriert.

Tauchen Sie die Proben fünf Minuten lang in 150 Milliliter Xylol. Zum Schluss montieren Sie die Proben, indem Sie vorsichtig 600 Mikroliter Eindeckmedium auf jeden Objektträger geben und dann ein Deckglas über die Probe legen. Mit dieser Methode wurden Gewebeschnitte von Phalaenopsis-Orchideen erzeugt, einschließlich der typischerweise schwer zu durchtrennenden Achselknospe, die einen hohen Anteil an Kristallen enthält.

Detaillierte Strukturen wurden beibehalten, was eine Visualisierung der Proteinkörper ermöglicht. Der Hybridschnitt ergab auch einen klaren Schnitt zur Visualisierung des Sprossapikalmeristems des gekeimten Samens. Diese Bilder zeigen die Präparation von quer verlaufenden Blattschnitten von Reis- und Weizenpflanzen mit den traditionellen Paraffin- und Hybridschnitttechniken.

Diese Pflanzen enthalten in der Regel einen hohen Anteil an Kieselsäure, was die Sektion schwierig macht. Die Gewebeintegrität in den Hybridschnitten wurde signifikant verbessert, und Schlüsselstrukturen, die in Paraffinproben oft verformt oder schwer zu finden waren, blieben in ihrer Gesamtheit im Hybridschnittgewebe erhalten. Darüber hinaus wurde ein Reißen nur in den Paraffinschnittproben beobachtet.

Darüber hinaus macht die starke Retention der Anatomie hybride Schnittgewebe nützlich für die Untersuchung räumlicher Genexpressionsmuster. Hier wurde eine in situ Hybridisierung mit Aktin und Cyclin B1:1 an hybrid geschnittenen Schnitten der zweiten und dritten Achselknospen der Phalaenopsis-Orchideen durchgeführt. Die verbesserte anatomische Konservierung ermöglichte den Nachweis höherer Expressionsniveaus der Zielgene in den sich entwickelnden meristematischen Zellen der dritten Achselknospen.

Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, eine Temperatur von minus 16 Grad Celsius zu halten, um den Paraffinblock zu härten. Dies sollte zu einem qualitativ hochwertigen Gewebeschnitt führen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, nachdem wir viele Male daran gescheitert waren, eine erfolgreiche Sektion bei Orchideen mit der traditionellen Paraffin- oder Kryosektionsmethode durchzuführen.

Nach diesem Verfahren können alle Experimente wie in situ Hybridisierung und FISH durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, einschließlich der Untersuchung der räumlichen Lokalisation und Funktion von Genen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie qualitativ hochwertige Gewebeschnitte in widerspenstigen Pflanzenproben durchführen können.