Name: Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zur Messung von Proteindiffusion in primären Immunzellmembranen. Diese Methode liefert Einblicke in Membranrezeptordynamiken für Immuntherapieansätze.

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Wir danken Dr. Vladana Vukojević, Zentrum für Molekulare Medizin, Karolinska Institutet für die Aufrechterhaltung des Zeiss Confocor 3 Instrument und hilfreiche Tipps in Bezug auf Zellmessungen. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Vetenskapsrådet (Grant-Nummer 2012- 1629) finanziert werden, Magnus Bergvalls Stiftelse und von Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll für FCS kann für die Bewertung der molekularen Dynamik von Oberflächenmolekülen auf allen Arten von Immunzellen (murine, menschliche oder andere Arten) verwendet werden. FCS Maßnahmen räumlich-zeitliche Molekulardynamik bis auf Einzelmolekülauflösung in lebenden Zellen. Die molekulare Dichte sowie die Diffusionsgeschwindigkeit und clustering Dynamik der Proteine ​​von Interesse, aus den Autokorrelationskurven extrahiert werden. Die Fluoreszenzmarkierung ist von zentraler Bed...

Viele Immunzellen Funktionen basieren auf der molekularen Diffusion und Wechselwirkungen innerhalb Membranen. Biologische Membranen sind komplex und viele Faktoren, die für die Funktion von Immunzellen wichtig sein kann , um die Geschwindigkeit der Translationsdiffusion von Proteinen in Zellmembranen 1 beeinflussen kann. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die natürliche Killer (NK) Zellen, gehören , Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, weisen differentielle Diffusion von beiden untersuchten Proteine an der Zellmembran in Abhängigkeit von dem Zustand der NK - Zell - Aktivierung 2. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Technik, die zur Quantifizierung molekularen Diffusionsraten innerhalb biologischer Membranen fähig ist. Es zeigt die durchschnittliche Diffusionsrate von fluoreszenz Moleküle in einem festen Volumen markiert, üblicherweise im Mittelpunkt eines konfokalen Mikroskops. Es basiert auf der Messung der Schwankungen in der Fluoreszenz, die auf Molekularbewegung auftreten inein System im stationären Zustand. FCS wurde zur Untersuchung der Diffusion von fluoreszierenden Farbstoffen und Proteinen sowohl in Lösung als auch in Lipidmembranen verwendet. Andere Ausgabeparameter die Diffusionsgeschwindigkeit zu beeinflussen auch indirekt werden kann auf diese Weise (zB Konformationsänderungen von Proteinen oder Wechselwirkungen von Molekülen auf Zellmembranen) untersuchten 3, 4. FCS zeichnet sich im Vergleich zu anderen Verfahren aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, so dass die Möglichkeit zur Einzelmolekül-Detektion. Es funktioniert gut für die molekulare Konzentrationen im nanomolaren bis millimolaren Bereich, der für die endogene Expressionsniveaus der meisten Proteine 5 typisch ist. Weiterhin FCS kann eine Approximation der absolute Anzahl von Proteinen innerhalb des untersuchten Volumen geben, während die meisten anderen Techniken nur relative Informationen über die Proteinexpressionsniveaus ergeben. Andere Methoden molekularen Diffusionsraten zu messen, in Membranen Fluo umfassenzenz Erholung nach dem (FRAP), Einzelpartikelverfolgung (SPT), mehrere Pinhole FCS und Bildkorrelationsphotobleaching Methoden. FRAP und Bildkorrelationsverfahren sind ensemble Techniken, die im allgemeinen keine Informationen über die absolute Anzahl der Moleküle 10 geben. Im Vergleich zu SPT ist der Durchsatz von FCS höher in Bezug auf die Bevölkerungsdurchschnitt zu charakterisieren. Die Analyse ist auch weniger anspruchsvoll, da die durchschnittliche Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle innerhalb des Laserfokus wird gemessen, eher als die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle. Auch, es sei denn spezielle Mikroskope sind 11 verfügbar, SPT können keine Informationen über Konzentrationen geben, da Standard - SPT Kennzeichnung sehr gering sein muss für die Identifizierung von einzelnen Molekülen zu ermöglichen. Auf der anderen Seite erfordert FCS die Moleküle untersucht, mobil zu sein. Es wird einfach keine vermeintlichen immobile Fraktionen oder Moleküle sehr langsam bewegen erkennen. Die Diffusionsgeschwindigkeit von Molekülen, diebefinden sich innerhalb der Fokus mehr als etwa ein Zehntel der Akquisitionszeit 3, in FCS - Messungen werden 12 nicht korrekt dargestellt. Daher ist es durch FCS aufgezeichnet Diffusionskoeffizienten sind in der Regel schneller als die Diffusionsraten von Techniken wie FRAP und SPT berichtet werden, wo die Nähe zu unbeweglich und sehr langsam Fraktionen als auch berücksichtigt werden. SPT wird auch eine detailliertere Beschreibung der Variabilität von Diffusionsraten innerhalb der molekularen Population als FCS geben. FCS quantifiziert die Schwankung der Fluoreszenzintensität über die Zeit innerhalb des angeregten Volumens. Im Falle von Membran Messungen bedeutet dies zu der beleuchteten Fläche der Membran. In diesem Papier nutzen wir die Tatsache, dass solche Schwankungen durch Moleküle aufweisen Brownsche Diffusion induziert werden und somit in und aus dem Anregungsvolumen bewegt. Es gibt auch mehrere andere mögliche Quellen für die schwankungentionen im Fluoreszenzsignal, wie Blinken oder Gegenwart eines Triplett-Zustand in der Fluorophore, Umweltauswirkungen, bindungs ​​unbinding des Liganden, oder die Bewegung der gesamten Zellmembran. Diese vermeintliche Fehlerquellen müssen in Betracht gezogen werden , wenn ein FCS - Experiment , um die Gestaltung , um genau die Ergebnisse 12, 13 zu interpretieren. Typischerweise seitliche Diffusionsraten in biologischen Membranen sind gering durch Crowding und Interaktionen, sowohl zwischen den Membranproteinen und zwischen Proteinen und dem Zytoskelett. Historisch gesehen , wurde die Verwendung von FCS in Membranen somit durch das Fehlen von photostabilen Fluorophore behindert, die erforderlich sind , während der verlängerten Laufzeiten durch die Anregungsfokus 14 Bleichen zu vermeiden. Doch heute gibt es viele Möglichkeiten für geeignete photostabile Farbstoffe. Signifikante Verbesserungen in Detektoren und anderer Hardware ermöglicht auch die Detektion von fluoreszierenden ProteIns und Farbstoffe von geringer Helligkeit. Hierbei wird ein Basisprotokoll für die Anwendung von FCS murine primären Lymphozyten verwendet, wobei das Protein von Interesse mit einem fluoreszierend markierten Antikörper markiert ist, wird beschrieben. Ein Ansatz, um die Autokorrelationskurven, um zu passen den Diffusionskoeffizienten und die molekulare Dichte wird auch gezeigt, zu extrahieren. Das Protokoll zielt darauf ab, wird leicht gefolgt von Immunologen ohne vorherige Erfahrung von Techniken, um die Diffusion von Molekülen zu untersuchen. Es ist jedoch ein grundlegendes Verständnis für die konfokale Mikroskopie erwartet (um diese grundlegende Verständnis gewinnen, siehe Referenz 15). Dieses Protokoll kann relativ leicht auf andere Suspensionszellen adaptiert werden, die beide Zelllinien und Primärzellen. Für erfahrene Anwender FCS, verfeinerte Analysemethoden existieren, von denen einige in der Diskussion beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit Maus II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Negative Selektion von NK-Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td> <td>-</td><td></td> <td>Hergestellt im Haus&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Transparentes Medium</td></tr><tr><td>Antikörperklon 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Zur Blockierung von Fc-Rezeptoren.</td></tr><tr><td>Anti-Ly49A-Antikörper&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Monoklonaler Antikörper, der im eigenen Haus hergestellt und im Haus mit Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Klon JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd-Antikörper</td> konjugiert wurde.<td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>im Haus konjugiert mit MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Fluoreszenzfarbstoff für die Antikörperkonjugation.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Verdünnt in destilliertem Wasser (1,10)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (20 kDa), gepfropft mit Polyethylenglykol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)</td><td>Verdünnt in PBS (pH 7,4) auf 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rhodamin 110 chlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Bekannter Diffusionskoeffizient: 3,3 &; 10&minus; 10 m2/sec 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientsp;</td><td>A20006</td><td>Bekannter Diffusionskoeffizient: 4,4 x 10&minus; 10 m2/sec 20</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab mit Kurvenanpassungs-Toolbox</td><td>Matlab</td><td>Version R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas</td><td>Thermowissenschaftlich&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 Vertiefungen, 1,0 Borosilikatboden</td></tr></tbody></table>

molekulare diffusion in plasmamembranen von primären lymphozyten mittels fluoreszenz-korrelations-spektroskopie gemessen

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der Diffusion von Molekülen in biologischen Membranen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. FCS kann die molekulare Konzentration und Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in der Zellmembran zu quantifizieren. Diese Technik hat die Fähigkeit , die molekularen Diffusionseigenschaften von Molekülen in der Plasmamembran von Immunzellen im eingeschwungenen Zustand (dh ohne Prozesse beeinflussen das Ergebnis bei der tatsächlichen Messzeit) zu erforschen. FCS ist für die Diffusion von Proteinen zu studieren, die typisch für die meisten endogenen Proteinen in Konzentrationen exprimiert werden. Hier wird eine einfache und robuste Methode, um die Diffusionsgeschwindigkeit von Zellmembranproteinen auf primären Lymphozyten zu bestimmen, wird demonstriert. Ein effektiver Weg, Messungen an Antikörper gefärbten lebenden Zellen durchzuführen und häufig auftretende Beobachtungen nach dem Erwerb werden beschrieben. Die jüngsten Fortschrittebei der Entwicklung von photostabile Fluoreszenzfarbstoffe können durch Konjugieren der Antikörper von Interesse verwendet werden Farbstoffe geeignet, dass während der Messungen nicht extensiv bleichen. Zusätzlich erlaubt dies für die Detektion von langsam diffundierenden Einheiten, die ein gemeinsames Merkmal der Proteine ​​in Zellmembranen exprimiert wird. Das Analyseverfahren Molekülkonzentration und Diffusionsparameter aus den erzeugten Autokorrelationskurven zu extrahieren, wird markiert. Zusammenfassend ist ein Basisprotokoll für die FCS-Messungen vorgesehen sind; sie kann durch Immunologen mit einem Verständnis für die konfokale Mikroskopie, aber mit keiner anderen bisherigen Erfahrungen von Techniken zur Messung von dynamischen Parametern, wie Molekulardiffusionsraten folgen.

Ein typisches Ergebnis wird eine Autokorrelationskurve mit einer Durchlaufzeit in dem Bereich von 10 msec bis 400 msec für Membranproteine ​​erzeugen. Die Anzahl der Moleküle können zwischen 0,5 bis etwa 200 pro &amp; mgr; m 2 für endogen exprimierte Proteine variieren. Prüfen Sie sorgfältig, dass die CPM ist nicht geringer als erwartet. Dies kann bedeuten, dass es einen Einfluss des Hintergrundsignals. Als Daumenregel gilt, das CPM-Signal auf Zellen, die für die Analyse angen...

Eine Methode zur Messung der Proteindiffusion in Membranen primärer Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wird beschrieben. In dieser Arbeit wird die Verwendung von Antikörpern für die Fluoreszenzmarkierung veranschaulicht.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Diffusionsrate eines markierten Proteins in Membranen von primären Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Immunologie und Zellbiologie zu identifizieren, wie z. B. die Identifizierung natürlicher Killerzellen mit einer aktiveren Membranrezeptordynamik. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit lebenden Zellen verwendet wird, so dass sie den natürlichen Zustand der Bewegung von Molekülen genau widerspiegelt.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Immuntherapie von Krebs, wenn verschiedene natürliche Killerzellmerkmale, wie z. B. die molekulare Diffusion, mit ihrer Funktion verknüpft sind, so dass die Effizienz besser vorhergesagt werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die molekulare Bewegung in Immunzellen geben kann, kann sie auch auf andere Primärzellen und Zelllinien in jeder Disziplin angewendet werden. Öffnen Sie die Software im Expertenmodus, wobei die Option Neue Bilder scannen ausgewählt ist.Wählen Sie die 40-fache Wasserobjektivlinse am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Drücken Sie auf der Registerkarte "Erfassen" die Schaltflächen "Config" und "Scan", um die Konfigurationssteuerung und die Scan-Steuerung zu öffnen. Drücken Sie auf der Registerkarte ConfoCor auf Messen, um das Messfenster zu öffnen.Erstellen Sie als Nächstes einen Ordner zum Speichern der FCS-Messungen. Starten Sie eine neue Bilddatenbank, indem Sie auf der Registerkarte Datei auf Neu klicken. Schalten Sie die Halogenlampe ein.Schalten Sie mit der Lasertaste die entsprechenden Laser ein, um die Fluorophore anzuregen. Legen Sie dann die Einstellungen für die Bilderfassung im Fenster Konfigurationssteuerung fest. Dazu gehören der Anregungslaser, die Anregungs- und Emissionsfilter, der Strahlengang und die verwendeten Detektoren.Gehen Sie auf ähnliche Weise zum Messfenster und passen Sie die FCS-Einstellungen auf der Registerkarte Systemkonfiguration an. Aktivieren Sie die Erkennungskanäle für die FCS-Aufnahmen, indem Sie Ch 1 für den grünen Kanal und Ch 2 für den roten Kanal umschalten. Während sich der Laser stabilisiert, was bis zu 30 Minuten dauern kann, passen Sie die Lochblende an.Geben Sie zunächst einen 50-Mikroliter-Tropfen Farbstoff mittig in eine Vertiefung eines mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgers mit acht Vertiefungen. Die angrenzenden Wells werden für Zellmessungen verwendet, da die Kalibrierung objektträgerabhängig ist. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die 40-fach-Wasserobjektivlinse und positionieren Sie den Objektträger.Drücken Sie dann Vis, um die sichtbare Lichtquelle auszuwählen und auf die zentrale Position des Fluorophor-Tröpfchens zu fokussieren. Wählen Sie im Messfenster der Software die Registerkarte Erfassung aus und schalten Sie unter Positionen die aktuelle Position um. Kehren Sie dann zur Registerkarte Systemkonfiguration im selben Fenster zurück und stellen Sie eine hohe oder Sättigungsleistung für den grünen Laser ein.Um die Stabilität des Signals zu testen, drücken Sie Start, um ein neues Fenster zu öffnen, in dem die Zeitspur und die Auto-Korrelationskurve angezeigt werden. Stellen Sie sicher, dass das Fluoreszenzsignal hoch und stabil ist und dass die y-Achse eine Fluktuation im Kilohertz-Bereich aufweist. Niedrigere Werte können auf eine ungenaue Fokussierung oder einen Farbstoffabbau zurückzuführen sein.Wählen Sie anschließend im Messfenster die Schaltfläche O Anpassen. Wählen Sie dann den richtigen Erkennungskanal aus und drücken Sie Auto Adjust X.Wenn die Obergrenze der resultierenden Kurve fehlt oder nicht zentriert ist, markieren Sie die Option Grob und drücken Sie erneut Auto Adjust X. Nachdem Sie die X-Richtung angepasst haben, machen Sie dasselbe für die Y-Richtung, indem Sie auf Auto Adjust Y drücken.Deaktivieren Sie Coarse und wechseln Sie zwischen der Anpassung von X und Y, indem Sie Auto Adjust drücken, bis beide klare Maxima und stabile Werte haben.Wenn die Zellen mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert sind, geben Sie einen Tropfen rote Fluorophorlösung in eine benachbarte Kammer. Kalibrieren Sie dann den zweiten Kanal. Stellen Sie den roten Laser auf eine hohe Leistung ein und wiederholen Sie den Stabilitätskalibrierungsvorgang.Als nächstes messen wir die Laufzeit von frei diffundierenden Fluorophoren durch den Fokus. Und wir verwenden dann den Tisch, um den Bereich der Zellmembran zu berechnen, der im Fokus liegt. Konzentrieren Sie sich zunächst auf ein Tröpfchen Lösung, indem Sie den Einstellvorgang sorgfältig durchführen.Gehen Sie dann im Messfenster auf die Registerkarte Erfassung und stellen Sie die Erfassungszeit mit drei Wiederholungen auf 30 Sekunden ein. Stellen Sie die Laserleistung auf nahezu Sättigung ein und drücken Sie Start, um eine Messung durchzuführen. Notieren Sie die Zählungen pro Molekül oder CPM, nachdem die Messung abgeschlossen ist.Nehmen Sie dann neue Messungen vor, um die Laserleistung iterativ zu reduzieren. In diesem Leistungsbereich ist die erwartete Leistung der bevorstehenden Zellenmessungen zu berücksichtigen. Überprüfen Sie als nächstes, ob die CPM-Werte linear mit der Laserleistung skalieren.Unter der Voraussetzung, dass der Rest der Skala linear ist, ist die Sättigung bei höchster Leistung akzeptabel. Wenn ein neu konjugierter fluoreszierender Antikörper zum ersten Mal verwendet wird, führen Sie eine FCS-Messung von frei diffundierenden Antikörpern durch, um die erwartete CPM zu quantifizieren. Und es ist wichtig, mit PEG Poly-L-Lysin beschichtete Vertiefungen für freie Antikörper zu verwenden.Für dieses Verfahren wird ein Objektträger mit einer Kammer von 200 Mikrolitern Poly-L-Lysin beschichtet, die auf Polyethylenglykol transplantiert sind. Lassen Sie die Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur ziehen. Die Stammlösung kann bis zu zwei Wochen gekühlt werden.Und die Pulverbrühe sollte im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Entfernen Sie später die Flüssigkeit und lassen Sie die Kammer an der Luft trocknen. Verdünnen Sie den Antikörper in PBS am Mikroskop auf ein bis 10 Mikrogramm pro Milliliter.Fahren Sie mit der Messung der Transitzeit von freien Antikörpern fort, wie im vorherigen Abschnitt für freie Fluorophore beschrieben. Um eine Messung in einer Zelle durchzuführen, fügen Sie 125 Mikroliter Zellen in PBS plus 1 %FCS aus der Antikörper-markierten Zellsuspension hinzu. Und 150 Mikroliter transparentes Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 in eine leere Vertiefung in den PLL-beschichteten Glasobjektträger.Lassen Sie die Zellen mindestens 20 Minuten lang im Dunkeln bei der Messtemperatur inkubieren, bevor Sie fortfahren, damit sich die Zellen anheften und ausgleichen können. Beginnen Sie die Bildgebung mit schnellen XY-Scans, um die geringstmögliche Laserleistung zu ermitteln, die für die Betrachtung der Zellen erforderlich ist. Zentrieren Sie dann das Bild auf eine runde Zelle mit mittlerer Helligkeit, an der die Membran klar definiert ist.Entscheidend ist, dass sich kein Fluoreszenzsignal im Zytoplasma befindet. Vergrößern Sie die Ansicht, bis die Zelle den größten Teil des Bildes abdeckt. Konzentrieren Sie sich dann auf die Oberseite der Zellmembran.Beginnen Sie in der Mitte der Zelle und bewegen Sie sich nach oben, bis die Bildmitte einen kleinen runden Bereich mit gleichmäßiger Fluoreszenz zeigt. Eine sorgfältige Platzierung des Fokus ist entscheidend. Wenn sich der Fokus nicht in der Membran befindet, stammt die detektierte Fluoreszenz nicht von den fluoreszenzmarkierten Membranrezeptoren.Und so werden die Ergebnisse nicht ihr Verhalten widerspiegeln. Wählen Sie nun auf der Registerkarte Erfassung des Messfensters eine Position für die FCS-Messung aus, indem Sie das Fadenkreuz aktivieren. Stellen Sie dann die Anzahl der Wiederholungen auf sechs bis 10 und die Messzeit auf 10 Sekunden pro Wiederholung ein.Kehren Sie nun zur Registerkarte Systemkonfiguration des Messfensters zurück und verringern Sie die Laserleistung für FCS-Messungen auf ein bis 10 Mikrowatt. Drücken Sie dann Start. Wenn die Intensitätsspur in den ersten 10 Sekunden um mehr als 30 % abfällt, wurde die Zelle zu stark gebleicht und eine andere Zelle muss mit einer geringeren Leistung gemessen werden.Wenn das Signal verloren geht, stellen Sie den Fokus in Z-Richtung ein und starten Sie die Messung neu. Überprüfen Sie nach Abschluss der Messung im Fenster Scan-Steuerung, ob die Zelle noch zentriert ist, um sicherzustellen, dass ihre Membran gemessen wurde. Wenn sich die Zelle verschoben hat, verwerfen Sie die Daten.Gehen Sie nun zum Fenster Automatische Korrelation und löschen Sie manuell einzelne Wiederholungen, die Zoommanöver, Bleichen, große Cluster oder andere Artefakte enthalten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Löschen aus, um die Artefakte zu entfernen. Die Auswahl der eigentlichen Artefakte erfordert Übung.Das Entfernen von Wiederholungen ist ein einfacher Vorgang, aber die Wiederholungen müssen korrekt bewertet werden, um zu wissen, was entfernt werden sollte und was nicht. Speichern Sie dann die endgültige Datei im FCS-Format. Behalten Sie nur Zellen, die nach dem Entfernen der Artefakte noch mindestens vier Wiederholungen für die weitere Analyse übrig haben.Die Autokorrelationskurve eines typischen Membranrezeptors ist glatt und hat eine Laufzeit im Bereich von 10 bis 400 Millisekunden. Legen Sie die Anpassungsbereiche so fest, dass sowohl der Anfang als auch das Ende des steilsten geneigten Teils, der die Diffusion darstellt, dargestellt wird. Wenn Sie ein Modell der freien Diffusion in zwei Dimensionen verwenden, um die Daten anzupassen, achten Sie auf den am tiefsten geneigten Teil der Kurve.Kleine Schwankungen um oder um eine Sekunde auf der Tau-Skala, die im Residuen zu sehen sind, sind akzeptabel. Wenn die Kurve schlecht passt, die Zelle aber keine offensichtlichen Probleme aufweist, wie z. B. Verschieben, Ausbleichen oder Cluster, müssen wahrscheinlich die Startwerte oder die oberen und unteren Grenzwerte des Modells geändert werden. Sobald das Modell gut an die Auto-Korrelationskurve angepasst ist, extrahieren Sie die Werte der Variablenparameter.Die Anzahl der Moleküle kann bei endogen exprimierten Proteinen zwischen 0,5 und etwa 200 pro Quadratmikrometer variieren. Vergewissern Sie sich, dass der CPM-Wert aus der Zellmessung mindestens 33 % des von frei diffundierenden Antikörpern aufgezeichneten Werts beträgt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Diffusionsrate von Proteinen mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie messen kann.Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen bis etwa 20 Minuten vor Beginn der Messung auf Eis zu halten. Messen Sie keine Proben länger als zwei Stunden.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die Diffusionsrate mit dem Expressionsniveau eines bestimmten Proteins korreliert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Molekularbiologie und Immunologie den Weg, die Dynamik von Proteinen in lebenden Zellen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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