Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Diffusionsrate eines markierten Proteins in Membranen von primären Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Immunologie und Zellbiologie zu identifizieren, wie z. B. die Identifizierung natürlicher Killerzellen mit einer aktiveren Membranrezeptordynamik. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit lebenden Zellen verwendet wird, so dass sie den natürlichen Zustand der Bewegung von Molekülen genau widerspiegelt.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Immuntherapie von Krebs, wenn verschiedene natürliche Killerzellmerkmale, wie z. B. die molekulare Diffusion, mit ihrer Funktion verknüpft sind, so dass die Effizienz besser vorhergesagt werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die molekulare Bewegung in Immunzellen geben kann, kann sie auch auf andere Primärzellen und Zelllinien in jeder Disziplin angewendet werden. Öffnen Sie die Software im Expertenmodus, wobei die Option Neue Bilder scannen ausgewählt ist.

Wählen Sie die 40-fache Wasserobjektivlinse am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Drücken Sie auf der Registerkarte "Erfassen" die Schaltflächen "Config" und "Scan", um die Konfigurationssteuerung und die Scan-Steuerung zu öffnen. Drücken Sie auf der Registerkarte ConfoCor auf Messen, um das Messfenster zu öffnen.

Erstellen Sie als Nächstes einen Ordner zum Speichern der FCS-Messungen. Starten Sie eine neue Bilddatenbank, indem Sie auf der Registerkarte Datei auf Neu klicken. Schalten Sie die Halogenlampe ein.

Schalten Sie mit der Lasertaste die entsprechenden Laser ein, um die Fluorophore anzuregen. Legen Sie dann die Einstellungen für die Bilderfassung im Fenster Konfigurationssteuerung fest. Dazu gehören der Anregungslaser, die Anregungs- und Emissionsfilter, der Strahlengang und die verwendeten Detektoren.

Gehen Sie auf ähnliche Weise zum Messfenster und passen Sie die FCS-Einstellungen auf der Registerkarte Systemkonfiguration an. Aktivieren Sie die Erkennungskanäle für die FCS-Aufnahmen, indem Sie Ch 1 für den grünen Kanal und Ch 2 für den roten Kanal umschalten. Während sich der Laser stabilisiert, was bis zu 30 Minuten dauern kann, passen Sie die Lochblende an.

Geben Sie zunächst einen 50-Mikroliter-Tropfen Farbstoff mittig in eine Vertiefung eines mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgers mit acht Vertiefungen. Die angrenzenden Wells werden für Zellmessungen verwendet, da die Kalibrierung objektträgerabhängig ist. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die 40-fach-Wasserobjektivlinse und positionieren Sie den Objektträger.

Drücken Sie dann Vis, um die sichtbare Lichtquelle auszuwählen und auf die zentrale Position des Fluorophor-Tröpfchens zu fokussieren. Wählen Sie im Messfenster der Software die Registerkarte Erfassung aus und schalten Sie unter Positionen die aktuelle Position um. Kehren Sie dann zur Registerkarte Systemkonfiguration im selben Fenster zurück und stellen Sie eine hohe oder Sättigungsleistung für den grünen Laser ein.

Um die Stabilität des Signals zu testen, drücken Sie Start, um ein neues Fenster zu öffnen, in dem die Zeitspur und die Auto-Korrelationskurve angezeigt werden. Stellen Sie sicher, dass das Fluoreszenzsignal hoch und stabil ist und dass die y-Achse eine Fluktuation im Kilohertz-Bereich aufweist. Niedrigere Werte können auf eine ungenaue Fokussierung oder einen Farbstoffabbau zurückzuführen sein.

Wählen Sie anschließend im Messfenster die Schaltfläche O Anpassen. Wählen Sie dann den richtigen Erkennungskanal aus und drücken Sie Auto Adjust X.Wenn die Obergrenze der resultierenden Kurve fehlt oder nicht zentriert ist, markieren Sie die Option Grob und drücken Sie erneut Auto Adjust X. Nachdem Sie die X-Richtung angepasst haben, machen Sie dasselbe für die Y-Richtung, indem Sie auf Auto Adjust Y drücken.Deaktivieren Sie Coarse und wechseln Sie zwischen der Anpassung von X und Y, indem Sie Auto Adjust drücken, bis beide klare Maxima und stabile Werte haben.

Wenn die Zellen mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert sind, geben Sie einen Tropfen rote Fluorophorlösung in eine benachbarte Kammer. Kalibrieren Sie dann den zweiten Kanal. Stellen Sie den roten Laser auf eine hohe Leistung ein und wiederholen Sie den Stabilitätskalibrierungsvorgang.

Als nächstes messen wir die Laufzeit von frei diffundierenden Fluorophoren durch den Fokus. Und wir verwenden dann den Tisch, um den Bereich der Zellmembran zu berechnen, der im Fokus liegt. Konzentrieren Sie sich zunächst auf ein Tröpfchen Lösung, indem Sie den Einstellvorgang sorgfältig durchführen.

Gehen Sie dann im Messfenster auf die Registerkarte Erfassung und stellen Sie die Erfassungszeit mit drei Wiederholungen auf 30 Sekunden ein. Stellen Sie die Laserleistung auf nahezu Sättigung ein und drücken Sie Start, um eine Messung durchzuführen. Notieren Sie die Zählungen pro Molekül oder CPM, nachdem die Messung abgeschlossen ist.

Nehmen Sie dann neue Messungen vor, um die Laserleistung iterativ zu reduzieren. In diesem Leistungsbereich ist die erwartete Leistung der bevorstehenden Zellenmessungen zu berücksichtigen. Überprüfen Sie als nächstes, ob die CPM-Werte linear mit der Laserleistung skalieren.

Unter der Voraussetzung, dass der Rest der Skala linear ist, ist die Sättigung bei höchster Leistung akzeptabel. Wenn ein neu konjugierter fluoreszierender Antikörper zum ersten Mal verwendet wird, führen Sie eine FCS-Messung von frei diffundierenden Antikörpern durch, um die erwartete CPM zu quantifizieren. Und es ist wichtig, mit PEG Poly-L-Lysin beschichtete Vertiefungen für freie Antikörper zu verwenden.

Für dieses Verfahren wird ein Objektträger mit einer Kammer von 200 Mikrolitern Poly-L-Lysin beschichtet, die auf Polyethylenglykol transplantiert sind. Lassen Sie die Lösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur ziehen. Die Stammlösung kann bis zu zwei Wochen gekühlt werden.

Und die Pulverbrühe sollte im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Entfernen Sie später die Flüssigkeit und lassen Sie die Kammer an der Luft trocknen. Verdünnen Sie den Antikörper in PBS am Mikroskop auf ein bis 10 Mikrogramm pro Milliliter.

Fahren Sie mit der Messung der Transitzeit von freien Antikörpern fort, wie im vorherigen Abschnitt für freie Fluorophore beschrieben. Um eine Messung in einer Zelle durchzuführen, fügen Sie 125 Mikroliter Zellen in PBS plus 1 %FCS aus der Antikörper-markierten Zellsuspension hinzu. Und 150 Mikroliter transparentes Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 in eine leere Vertiefung in den PLL-beschichteten Glasobjektträger.

Lassen Sie die Zellen mindestens 20 Minuten lang im Dunkeln bei der Messtemperatur inkubieren, bevor Sie fortfahren, damit sich die Zellen anheften und ausgleichen können. Beginnen Sie die Bildgebung mit schnellen XY-Scans, um die geringstmögliche Laserleistung zu ermitteln, die für die Betrachtung der Zellen erforderlich ist. Zentrieren Sie dann das Bild auf eine runde Zelle mit mittlerer Helligkeit, an der die Membran klar definiert ist.

Entscheidend ist, dass sich kein Fluoreszenzsignal im Zytoplasma befindet. Vergrößern Sie die Ansicht, bis die Zelle den größten Teil des Bildes abdeckt. Konzentrieren Sie sich dann auf die Oberseite der Zellmembran.

Beginnen Sie in der Mitte der Zelle und bewegen Sie sich nach oben, bis die Bildmitte einen kleinen runden Bereich mit gleichmäßiger Fluoreszenz zeigt. Eine sorgfältige Platzierung des Fokus ist entscheidend. Wenn sich der Fokus nicht in der Membran befindet, stammt die detektierte Fluoreszenz nicht von den fluoreszenzmarkierten Membranrezeptoren.

Und so werden die Ergebnisse nicht ihr Verhalten widerspiegeln. Wählen Sie nun auf der Registerkarte Erfassung des Messfensters eine Position für die FCS-Messung aus, indem Sie das Fadenkreuz aktivieren. Stellen Sie dann die Anzahl der Wiederholungen auf sechs bis 10 und die Messzeit auf 10 Sekunden pro Wiederholung ein.

Kehren Sie nun zur Registerkarte Systemkonfiguration des Messfensters zurück und verringern Sie die Laserleistung für FCS-Messungen auf ein bis 10 Mikrowatt. Drücken Sie dann Start. Wenn die Intensitätsspur in den ersten 10 Sekunden um mehr als 30 % abfällt, wurde die Zelle zu stark gebleicht und eine andere Zelle muss mit einer geringeren Leistung gemessen werden.

Wenn das Signal verloren geht, stellen Sie den Fokus in Z-Richtung ein und starten Sie die Messung neu. Überprüfen Sie nach Abschluss der Messung im Fenster Scan-Steuerung, ob die Zelle noch zentriert ist, um sicherzustellen, dass ihre Membran gemessen wurde. Wenn sich die Zelle verschoben hat, verwerfen Sie die Daten.

Gehen Sie nun zum Fenster Automatische Korrelation und löschen Sie manuell einzelne Wiederholungen, die Zoommanöver, Bleichen, große Cluster oder andere Artefakte enthalten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Löschen aus, um die Artefakte zu entfernen. Die Auswahl der eigentlichen Artefakte erfordert Übung.

Das Entfernen von Wiederholungen ist ein einfacher Vorgang, aber die Wiederholungen müssen korrekt bewertet werden, um zu wissen, was entfernt werden sollte und was nicht. Speichern Sie dann die endgültige Datei im FCS-Format. Behalten Sie nur Zellen, die nach dem Entfernen der Artefakte noch mindestens vier Wiederholungen für die weitere Analyse übrig haben.

Die Autokorrelationskurve eines typischen Membranrezeptors ist glatt und hat eine Laufzeit im Bereich von 10 bis 400 Millisekunden. Legen Sie die Anpassungsbereiche so fest, dass sowohl der Anfang als auch das Ende des steilsten geneigten Teils, der die Diffusion darstellt, dargestellt wird. Wenn Sie ein Modell der freien Diffusion in zwei Dimensionen verwenden, um die Daten anzupassen, achten Sie auf den am tiefsten geneigten Teil der Kurve.

Kleine Schwankungen um oder um eine Sekunde auf der Tau-Skala, die im Residuen zu sehen sind, sind akzeptabel. Wenn die Kurve schlecht passt, die Zelle aber keine offensichtlichen Probleme aufweist, wie z. B. Verschieben, Ausbleichen oder Cluster, müssen wahrscheinlich die Startwerte oder die oberen und unteren Grenzwerte des Modells geändert werden. Sobald das Modell gut an die Auto-Korrelationskurve angepasst ist, extrahieren Sie die Werte der Variablenparameter.

Die Anzahl der Moleküle kann bei endogen exprimierten Proteinen zwischen 0,5 und etwa 200 pro Quadratmikrometer variieren. Vergewissern Sie sich, dass der CPM-Wert aus der Zellmessung mindestens 33 % des von frei diffundierenden Antikörpern aufgezeichneten Werts beträgt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Diffusionsrate von Proteinen mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie messen kann.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen bis etwa 20 Minuten vor Beginn der Messung auf Eis zu halten. Messen Sie keine Proben länger als zwei Stunden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die Diffusionsrate mit dem Expressionsniveau eines bestimmten Proteins korreliert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus der Molekularbiologie und Immunologie den Weg, die Dynamik von Proteinen in lebenden Zellen zu erforschen.