Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein In Vitro Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Das übergeordnete Ziel dieses indirekten Cokultur-Assays ist es, den Einfluss von Astrozyten auf die Entwicklung von Neuronen zu untersuchen. Unser Labor interessiert sich für die Rolle der Neuron-Glia-Interaktionen. Es wird angenommen, dass Astrozyten zur Bildung der Synapsen, der Verbindungsstrukturen des zentralen Nervensystems, beitragen.

Um ihre Rolle zu untersuchen, haben wir ein In-vitro-Modell entworfen, in dem wir primäre Astrozyten und primäre embryonale Neuronen in getrennten Kompartimenten kombinieren können. Die Kompartimente sind durch eine durchlässige Membran verbunden, die die Analyse des Austauschs zwischen beiden Zelltypen ermöglicht. Mit diesem Ansatz konnten wir die Synapsenbildung über einen Zeitraum von bis zu vier Wochen überwachen.

Darüber hinaus ist es möglich, mit diesem Assay die individuellen Rollen von Astrozyten einerseits und Neuronen andererseits zu untersuchen. Und schließlich können wir auch das Sekretom unserer Zellkompartimente genauer untersuchen, das Moleküle enthält, die die wechselseitige Beeinflussung beider Zellkompartimente in diesem System vermitteln. Diese Methode kann Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten geben.

Es kann auch auf andere Modellorganismen angewendet werden, wie z. B. die Zellen von Ratten. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da Erfahrung erforderlich ist, um die optimale Reifungsoperation des Hippocampusgewebes nach der Dissektion zu erhalten. Um die Kortikale zu präparieren, entfernen Sie die Haut vom Schädel entlang der Mittellinie, beginnend vom Hals bis zur Höhe der Augen.

Halten Sie dann den Kopf mit einer Pinzette am rostralen Ende fest und machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels. Schneiden Sie dann die linke und die rechte Schädelhälfte ab, um das Gehirn freizulegen. Heben Sie danach das Gehirn aus dem Schädel und übertragen Sie es in eine 10 cm große Petrischale, die mit HBSS gefüllt ist.

Mit den übrigen Proben wird auf die gleiche Weise verfahren, bis alle Gehirne in der Schale gesammelt sind. Um die Rinde zu trennen, kneifen Sie den Hinterdrang mit einer Pinzette ab. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie zwischen den beiden Hemisphären.

Fixieren Sie vorsichtig das Gehirn und schneiden Sie das Mittelhirn und den Riechkolben mit einer zweiten Pinzette ab, wodurch zwei kortikale Hälften entstehen. Befestigen Sie anschließend eine kortikale Hälfte mit einer Pinzette und schälen Sie die Hirnhäute ab, indem Sie sie vom Seitenrand lösen. Und anschließend mit einer zweiten Pinzette von der kortikalen Oberfläche zu ziehen.

Richten Sie die kortikale Hälfte mit der Oberfläche nach unten aus. Präparieren und entfernen Sie vorsichtig den halbmondförmigen Hippocampus. Übertragen Sie dann die Kortikale in ein konisches 15-ml-Röhrchen.

Geben Sie einen ml Denem und 0,1 % wv Papain in ein 2 ml Reaktionsröhrchen. Inkubieren Sie die Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, bis die Lösung klar ist. L-Cystein und DNAse zur Mischung geben und leicht schütteln.

Anschließend filtrieren Sie die Mischung, um einen ml sterile Lösung zu erhalten, fügen Sie sie dem kortikalen Gewebe hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bis eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Um die Verdauungsreaktion zu beenden, fügen Sie ein ml Astrozytenmedium hinzu und titrieren Sie das verdaute Gewebe vorsichtig. Geben Sie anschließend fünf ml Astrozytenmedium in die Zellsuspension.

Sobald das Gewebe in eine einzellige Suspension dissoziiert wurde, zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang. Danach aspirieren Sie den Überstand vorsichtig aus dem resultierenden Pellet und suspendieren die Zellen in einem ml Astrozytenmedium erneut. Geben Sie die Zellsuspension in die T75-Kolben, die mit neun ml Astrozytenmedium aufgefüllt sind.

Überprüfen Sie nach siebentägiger Kultur, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben. Es ist darauf zu achten, dass die Temperatur auf 37 Grad Celsius eingestellt ist und der Filter des Kolbens mit Laborfolie versiegelt ist, um eine Verdunstung des Kohlendioxids zu verhindern. Um die Vorläuferzellen loszuwerden und eine reine Astrozytenkultur zu erhalten, stellen Sie die T75-Kolben auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie die Kulturen über Nacht mit 250 Umdrehungen pro Minute.

Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 10 ml frisches Kulturmedium hinzu, das mit 20 mikromolaren RSE aufgefüllt ist, um verbleibende sich teilende Zellen zu entfernen. Legen Sie bei diesem Verfahren so viele Einsätze wie nötig in die 24-Well-Platte. Jede Einlage mit 10 Mikrogramm Poly d'Lysin pro ml bestreichen und eine Stunde lang inkubieren.

Nach einer Stunde waschen Sie die Einlagen zweimal mit PBS. In der Zwischenzeit das Astrozytenmedium aspirieren und die Kultur einmal mit 10 ml PBS waschen, um sicherzustellen, dass das restliche Serum entfernt wird. Geben Sie anschließend drei ml 0,05 % Trypsin-EDTA in die Kolben und inkubieren Sie die Zellen für die Trypsinisierung für etwa 10 Minuten.

Suspendieren Sie die Zellen anschließend vorsichtig wieder in sieben ml Astrozytenmedium. Die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 216 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in einem ml Astrozytenmedium.

Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Füllen Sie anschließend die 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Astrozytenmedium pro Well. Aspirieren Sie das PBS und übertragen Sie 25.000 Zellen und 500 Mikroliter Astrozytenmedium in jedes einzelne Insert und inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius.

Um die Hippocampi zu zerlegen, bereiten Sie drei 10 cm lange Schalen mit Zubereitungsmedium und eine 2-ml-Tube mit einem ml Zubereitungsmedium vor. Präparieren Sie die Hippocampi von den Cortex-Noyadees und sammeln Sie sie in einer zwei ml Tube, die mit Präparationsmedium gefüllt ist. Es ist wichtig, dass die Hippocampus ohne angrenzendes Gewebe aus anderen Regionen des ZNS isoliert werden.

Daher muss nach der Entfernung des Hippocampus zusätzlich das fremde Schadstoffgewebe entfernt werden. Übertragen Sie das Röhrchen nach der Dissektion auf eine sterile Laminar-Flow-Bank. Entfernen Sie das Präparationsmedium vorsichtig und verdauen Sie das Hippocampusgewebe von einem ml Verdauungslösung, die Papain enthält.

Nach 15 Minuten Aufschluss ziehen Sie die Aufschlusslösung vorsichtig durch sanftes Ansaugen mit der Pipette heraus. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des Neurons ist es wichtig, das Hippocampus vorsichtig zu titrieren, um Blasen zu vermeiden und die optimale Titrationsintensität zu erreichen. Waschen Sie den Hippocampus dreimal mit Neuronenmedium, indem Sie pro Waschgang einen ml frisches Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig aspirieren.

Nach dem letzten Waschschritt titrieren Sie das Gewebe vorsichtig in einem ml Neuronenmedium. Zählen Sie dann die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Platten 35.000 Zellen in 500 Mikroliter Neuronenmedium pro Vertiefung der 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie nun die vorbereiteten Einsätze, die mit konfluenten Astrozyten-Monoschichten besiedelt wurden, aus dem Inkubator. Tauschen Sie das Medium aus, indem Sie das Astrozytenmedium aspirieren und durch 500 Mikroliter frisches Neuronenmedium ersetzen. Platzieren Sie dann die Einsätze mit den Astrozyten vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in die Vertiefungen, in denen sich die Neuronenkulturen befinden.

Sie anschließend die resultierende indirekte Neuron-Astrozyten-Kokultur bis zu den Experimenten zurück in den Inkubator. Dieses Bild zeigt die Monoschichten, die von Astrozyten auf der Membran des Zellkultureinsatzes gebildet werden. Die Astrozyten sind für GFAP und MMP2 immungefärbt.

Das Schema hier veranschaulicht den Aufbau der indirekten Kokultur. Obwohl zwei Kulturen physisch getrennt sind, teilen sie sich das gleiche Medium. Zwei sezernierte molekulare Mediatoren von Neuronenglia-Interaktionen werden im Co-Kultivierungsmedium unter Verwendung eines Western Blots mit mehreren Isoformen von TNC, einem ausgesprochenen Wachstumsregulator, und MMP2, einem extrazellulären Matrixmodifikator, nachgewiesen.

Dieses Bild zeigt, dass die primären Neuronen bis zum 14. Tag der Kultivierung stark miteinander verbundene Netzwerke entwickeln. Die Kolokalisation des präsynaptischen Markerfagotts mit dem postsynaptischen PSD95-Gerüst dokumentiert die strukturell abgeschlossene synaptische Bildung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es mit unserem Assay-System möglich ist, primäre Astrozyten und primäre Neuronen im Kokulturmodell zu kombinieren.

Beide Surtypen sind getrennt, teilen sich aber das gleiche Medium. Daher können wir auch das Sekretom beider Surtypen in unserem Modell untersuchen. In diesem Modell entwickeln und reifen Synapsen.

Und darüber hinaus können wir auch die Entstehung weiterer spezifischer Strukturen wie perineuronaler Netze zeigen. Daher ist unser Modellsystem gut geeignet, um den Einfluss von Astrozyten auf die Synapsenbildung, Plastizität und Funktion zu untersuchen.