Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist die Einrichtung eines auf Säugetierzellen basierenden in-vitro-Infektionssystems für das Zika-Virus, um die Replikation des Zika-Virus sowie die Nutzung der in-vitro-Plattform für die Arzneimittelentwicklung zu untersuchen. Dieses detaillierte, schrittweise beschriebene Protokoll eines infektiösen Zellkultursystems für das Zika-Virus kann dazu beitragen, den Mechanismus der vom Zika-Virus vermittelten Krankheitspathogenese sowie die Entwicklung der viralen Virulenz aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die großtechnische Produktion des Zika-Virus für die Entwicklung von Arzneimitteln und Impfstoffen ermöglicht.

Beginnen Sie mit der Gewinnung von Vero-Zellen bei einer Zelldichte von 80 % in einem T75-Kulturkolben, indem Sie das Medium aus dem Kolben abpipettieren und die Zellen mit zwei Millilitern gepuffertem Phosphat-Salzlösung (PBS) spülen. Geben Sie zwei Milliliter 0,25 %iger Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie den Kolben fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie acht Milliliter Wachstumsmedium mit Serum hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Überführen Sie anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Entnehmen Sie danach 10 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie diese mit einer gleichen Menge 0,4 %iger Trypanblaulösung. Geben Sie die vorbereitete Mischung auf eine Zellzählkammer und ermitteln Sie die Anzahl der vitalen Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählgeräts. Säen Sie insgesamt sieben Millionen Zellen in einem Volumen von 30 Milliliter in einen T160-Kolben aus. Bereiten Sie am nächsten Tag eine geeignete Infektionsmultiplizität des Zika-Virus-Inokulums in 10 Milliliter serumfreiem Kulturmedium pro Kolben vor.

Ein sicherer Umgang mit dem Virus ist entscheidend, um die Ausbreitung der Infektion zu verhindern.

Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus dem T160-Fläschchen und geben Sie anschließend die vollen 10 Milliliter frisch zubereiteten viralen Inokulums hinzu. Inkubieren Sie die infizierten Fläschchen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 über einen Zeitraum von vier bis sechs Stunden. Verteilen Sie das Inokulum, indem Sie das Fläschchen während der Inkubation stündlich vorsichtig seitlich kippen. Ersetzen Sie nach Beendigung der Inkubation das Inokulum durch 30 Milliliter warmes, serumhaltiges Wachstumsmedium. Fahren Sie anschließend mit der viralen Kultur für die nächsten 96 Stunden fort. Überprüfen Sie nach vier Tagen den Fortschritt der Infektion, indem Sie das Auftreten von viralen Plaques auf der Zellmonoschicht mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachten. Nehmen Sie bei Bedarf Bilder mit 40facher und 200facher Vergrößerung auf.

Gewinnen Sie die Überstände der Zellkultur nach 96 Stunden und zentrifugieren Sie den Überstand bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 300 × g, um Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die Überstände, ohne den pelletierten Zelltrümmer zu stören, und überführen Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen.

Bewahren Sie die Überstände der Viruskultur in mehreren Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius auf.

Um das Virus zu titrieren, säen Sie zunächst naive Vero-Zellen in eine 12-Loch-Platte mit je einem Mal 10 hoch 5 Zellen pro Loch in einem Volumen von zwei Milliliter aus. Bereiten Sie am folgenden Tag Verdünnungsreihen der viralen Kulturüberstände im Verhältnis 1:10 vor, die aus dem T160-Fläschchen mit serumfreiem Medium gesammelt wurden.

Beim Anfertigen serieller Verdünnungen von viralem Kulturüberstand für Titrierungen achten Sie darauf, den Virus sicher zu handhaben, um eine Infektion zu verhindern.

Entfernen Sie anschließend das verbrauchte Medium aus jedem Well der 12-Loch-Platte mit Vero-Zellen und geben Sie 400 Mikroliter des verdünnten Inokulums in Dreifachansätzen auf die Vero-Zellen. Inkubieren Sie die beimpften Platten vier bis sechs Stunden lang im Gewebe-Kultur-Inkubator.

Am Ende der Inkubation das Inokulum durch zwei Milliliter serumhaltiges Medium pro Vertiefung ersetzen. 48 Stunden nach der Inokulation die viralen Foci in den geeigneten Verdünnungen mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops zählen. Die virale Titerkonzentration als Plaque-bildende Einheiten pro Milliliter berechnen.

Nach der Infektion von Vero-Zellen in einer 12-Loch-Platte mit hohen und niedrigen Titermengen des Zika-Virus und einer Inkubation über 48 und 96 Stunden wird die Genomreplikation mittels quantitativer PCR zur Detektion des Zika-Virusgenoms sowie mittels immunzytochemischer Färbung für doppelsträngige RNA bewertet.

Für die Immunzytochemie entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Loch-Platte und geben Sie je einen Milliliter Methanol in jede Vertiefung. Lassen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang fixieren. Waschen Sie die fixierten Zellen anschließend dreimal mit 1x PBS. Geben Sie dann Blockierpuffer hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie den mausmonoklonalen Antikörper gegen doppelsträngige RNA, J2, im Verhältnis 1:100 in Blockierpuffer, geben Sie ihn zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in dieser Lösung. Am nächsten Tag verdünnen Sie den sekundären Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG-594, im Verhältnis 1:1.000 in Blockierpuffer, waschen die Zellen mit 1x PBS und geben den Antikörper zu den Zellen. Inkubieren Sie anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach einem weiteren Waschschritt mit 1x PBS färben Sie die Kerne mit dem Farbstoff Hoechst und betrachten die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100facher Vergrößerung.

Sechs Stunden nach der Aussaat einer 12-Loch-Platte mit naiven Vero-Zellen, wie zuvor beschrieben, Zytokine der gewünschten Interesse in angegebenen Konzentrationen in biologischen Duplikaten hinzufügen. Zwölf Stunden nach der Behandlung eine Zika-Virus-Infektion durchführen und Negativkontrollen ohne Infektion einbeziehen. Vier Stunden nach der Infektion das virale Inokulum durch zytokinbehandeltes Medium ersetzen und die Zellen anschließend 47 Grad Celsius für weitere 44 Stunden inkubieren. 48 Stunden nach der Infektion virale Plaques mit einem Phasenkontrastmikroskop zählen und repräsentative Bilder infizierter Zellen bei 40facher Vergrößerung aufnehmen.

Dieses Diagramm zeigt den genomischen Gehalt des Zika-Virus, gemessen mittels RT-qPCR. Sowohl Primer für den Pan-Genotyp als auch für den Stamm PRVABC-59 zeigten gleiche Empfindlichkeit und Spezifität. Wie erwartet amplifizierten Primer für das Hepatitis-C-Virus kein Produkt.

Die Wachstumsdynamik des Zika-Virus zu den angegebenen Zeitpunkten in Zellen mit niedriger und hoher Viruslast im Vergleich zur nicht infizierten Mock-Kontrolle ist hier dargestellt. Die Ergebnisse des Immunzytochemie-Assays zeigen, dass die infizierten Zellen 48 Stunden nach der Infektion in wenigen Clustern vorliegen, während 96 Stunden nach der Infektion die Mehrheit der Zellen infiziert ist. Dieses Diagramm zeigt die Modulation des Zika-Viruswachstums durch verschiedene Zytokine im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle.

Diese Phasenkontrastbilder zeigen Zellen, die mit dem Zika-Virus infiziert sind, mit oder ohne Zytokinsbehandlung. Virale Plaques, die von infizierten Zellen gebildet werden, sind als Foci erkennbar. Beachten Sie, dass in mit Interferon behandelten Vertiefungen keine viralen Plaques auftreten.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die hochauflösende Domänenkartierung des Zika-Virus zur Lokalisierung viraler Proteine und Replikation in Mücken- und menschlichen Zellen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Aufklärung des Mechanismus der Krankheitspathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein auf Säugetierzellen basierendes in-vitro-Infektionssystem für das Zika-Virus etabliert, um die Replikation des Zika-Virus zu untersuchen, sowie wie die Nutzung der in-vitro-Plattform für die Entwicklung von Wirkstoffen und Impfstoffen erfolgt.