Name: Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die In Vitro Prophylaktische Wirkung von Interferonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Herstellung eines Zika-Virus-Zellkultursystems mit Vero-Zellen für virologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Replikationsmechanismen und unterstützt die Entwicklung von Medikamenten und Impfstoffen.

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Wir möchten Dr. Aaron Brault und Dr. Brandy Russell von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA, für die Bereitstellung von PRVABC59 des Zika-Virusstamms danken. Wir danken Nicholas Ten von der Yale University für das Lektorat dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch den Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award an V.A.

Hinweis: Eine schematische Darstellung der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Zellen <ol><li> Verwenden Sie Vero-Zellen für Zika Virusproduktion und Analyse von viralen Replikationszyklus. </li><li> Bereiten vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 Einheiten / ml) und 10 mM HEPES. </li><li> Kultur Vero - Zellen mit dem angegebenen vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 2. Zika Virusproduktion <ol><li> Ernten Sie die Vero-Zellen bei 80% Zelldichte unter Verwendung von 0,25% Trypsin in T-75-Kolben und die Zellen zu zählen. <ol><li> Aspirieren das Medium aus dem T-75 Kulturflasche und spülen Sie die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> 2 ml 0,25% Trypsin und Inkubation Der Kolben wird bei 37 ° C für 5 min. </li><li> 8 ml des Serums Wachstumsmedium, das Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren nach oben und unten zu suspend Zellen und übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube. </li><li> Entfernen Sie 10 ul Zellen und mischen mit der gleichen Menge von 0,4% Trypanblau. Laden der vorbereiteten Mischung in die Zelle Zählkammer Dia- und erhalten Lebendzellanzahl eines automatisierten Zellzähler verwendet wird. </li></ol></li><li> Seed insgesamt 7 Millionen Zellen in einem 30 ml Volumen in einem T-160-Kolben. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten eine geeignete Multiplizität der Infektion (0,01 bis 0,1 MOI) von Zika Virus Inoculum in einem 10 ml serumfreies Kulturmedium pro Flasche. </li><li> Entfernen Sie die verbrauchte Medien aus dem T-160-Kolben und fügen Sie dann den frisch viralen Inokulum hergestellt (10 ml). </li><li> Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Kolben seitlich in jeder Stunde zu kippen. </li><li> Bei Beendigung der Inkubation ersetzt das Inokulum mit warmem Serum-ergänztem Wachstumsmedien (30 ml) für jeden Kolben. Dann weiter die Viruskultur für den nächsten 96 Stunden. </li><li> Stellen Sie sicher, das Fortschreiten der infection durch das Auftreten von viralen Plaques auf der Zellschicht Beobachtung eines Phasenkontrastmikroskop und nehmen Bilder (Abbildung 2) als bei 40 - facher und 200 - facher Vergrößerung erforderlich. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Plaketten von Zika Virus auf einer Monoschicht von Vero - Zellen gebildet Hellfeldbilder von verschiedenen Vergrößerungen zeigen Zika viralen Plaques bei 48 hpi. Beachten Sie die Anwesenheit von gerundeten Zellfoci auf der Monoschicht. (Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="8"><li> Erntezellkulturüberständen an der 96 Stunden Zeitpunkt und zentrifugieren der Überstand bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende pelle Schutt und Transfer to 15-ml-Röhrchen. Ultrazentrifugation bei 24.000 xg durchgeführt werden, um die Viruspartikel (optional) zu konzentrieren. </li><li> Lagern Sie die viralen Kulturüberständen in mehreren Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> 3. Mess Titer Zika Virus durch Plaque-Assay <ol><li> Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumen einer 12-Well - Platte verwendet wird . </li><li> Am nächsten Tag vorbereiten serielle Verdünnungen von Virus-Kulturüberständen 10-fach von den T-160-Kolben gesammelt Serum-freien Medien. Entfernen Sie die verbrauchten Medien aus jeder Vertiefung und fügen 400 ul vorbereitet Inokulum auf Vero-Zellen in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Inkubieren der inokulierten Kolben in 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-6 Std. Verbreiten Sie das Inokulum durch sanft die Platte seitlich an jedem eine Stunde zu kippen. </li><li> Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Inokulum mit Serum ergänzten Medium (2 ml pro Vertiefung). </li><li> Bei 48 Stunden nach der Impfung, zählen die Virusherde eine Phase contr mitast Mikroskop. Berechne die Virustiter als Plaque bildende Einheiten (PFU) pro ml. Siehe Abbildung 3 für Plaque - Test. </li><li> Fix und färben die Zellen in 4% Formaldehyd und 0,1% Kristallviolett-Lösung in 20% Ethanol für eine klare Darstellung von Plaques. </li></ol> 4. Zika virale Genom-Replikation Assay <ol><li> Seed naiver Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 2 ml Volumina einer 12-Well - Platte verwendet wird . Am nächsten Tag vorbereiten virale Inokula (MOI von 0,01 und 0,1; 400 &amp; mgr; l / Vertiefung) mit niedrigem und hohem Titer Serum freie Medien in dreifacher Ausfertigung mit. Für Mock-Infektion verwenden Serum freie Medien (400 &amp; mgr; l / Vertiefung) nur. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.4. </li><li> Bei den 48 und 96 h Zeitpunkte, sammeln die Proben für die RNA und Immunzytochemie (ICC). <ol><li> Für die Ernte RNA-Proben, die Medien zu entfernen und dann 400 ul Lyselösung hinzufügen direkt in jede Vertiefung und sammeln die Lysaten. </li><li> Für ICC, entfernen Sie die Medien und tHenne fixieren die Zellen durch Zugabe von 1 ml Methanol in jede Vertiefung und die Platte für 30 Minuten bei 4 ° C inkubiert. </li><li> Aus dem Zelllysat, isolieren die Gesamt-RNA eine RNA-Extraktions-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Quantifizieren der RNA mit einem Spektralphotometer. </li></ol></li><li> Durchführen eines Zweischritt reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) das Genom ZIKV Gehalt von geernteten RNA zu bestimmen. <ol><li> Zur Umkehr der RNA transkribieren, zunächst eine 13 &amp; mgr; l-Reaktionsmischung aufgebaut, bestehend aus 5 ug isolierte RNA, 1 ul dNTPs (10 mM) und 1 ul zufälligen Hexamer (250 ng) in einer 0,2-ml-Röhrchen. Inkubieren der Röhrchen bei 65ºC für 5 min und dann für eine Minute auf Eis stellen. Anschließend fügen 1 ul reverse Transkriptase, 4 &amp; mgr; l Synthesepuffer 5fach Strang, 1 ul 0,1 M Dithiothreitol und 1 &amp; mgr; l RNase-Inhibitor zu dem Reaktionsgemisch. Inkubiere das Rohr für weitere 5 min bei 25 ° C, gefolgt von 60 min bei 50 ° C und inactivaß die Reaktion durch Erhitzen auf 70 ° C für 15 min. </li><li> Führen Sie qPCR unter Verwendung von 1 &amp; mgr; l der resultierenden cDNA mit 12,5 ul 2x grünen Farbstoff Supermischung, die DNA-Polymerase und 1 ul 10 mM einzelnen Primer, die spezifisch für Zika Virus [Zika Virus pan-Genotyp-Primer (für: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; Rev;: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika Virus asiatischen Genotyp PRVABC59 Stamm-Primer (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], oder Hepatitis-C-Virus (JFH RTQ F: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), oder zelluläre Housekeeping-Gen GAPDH (für: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) in einem 25 ul Reaktionsvolumen. </li><li> Führen PCR unter Verwendung der Ausführungsbedingung 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 30 Sekunden (40 Zyklen) in einem Echtzeit-PCR-System. </li><li> Verwenden Sie GAPDH Expressionsniveau basierend auf cycle threshold (Ct) Wert der Z zu normalisierenika viralen Genoms Messung. Berechnen Sie die Delta - Ct (ACt) -Wert von Zika Genoms im Vergleich zu derjenigen von GAPDH und erhalten die 2 ACt Wert. Dann berechnen die Falte Änderung, indem das Verhältnis der normalisierten Zika Genom Inhalte zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten nehmen. Siehe Abbildung 4 für ZIKV Genomreplikation Ergebnisse. </li></ol></li><li> Führen ICC das Methanol fixierten Zellen. <ol><li> Waschen der fixierten Zellen dreimal mit 1x PBS und Blockieren mit ICC Blockierungspuffer (3% Ziegenserum, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS). </li><li> Mit der Maus monoklonaler anti-dsRNA Antikörper J2 (1 ug / ml) in einer Verdünnung von 1: 100 in Blocking-Puffer und über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Waschen der Zellen mit 1x PBS und fügen sekundären Antikörper Ziege-anti-Maus-IgG-594 (1 ug / ml) in einer 1: 1000 Verdünnung in Blockierungspuffer und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wash-Zellen mit 1x PBS und Färbung für Kerne mit Hoechst-Farbstoff undbeachten Sie die Zellen , die ein Fluoreszenzmikroskop bei 100 - facher Vergrßerung (Abbildung 4) verwendet wird . </li></ol></li></ol> 5. Screening Zytokin-Bibliothek gegen eine Infektion Zika Virus <ol><li> Seed naive Vero - Zellen bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well - Platte verwendet wird . Sobald die Zellen gebunden sind (6 Stunden nach der Aussaat), für jede Zytokin in den angegebenen Konzentrationen in biologischen Duplikaten (2 ml Volumen / Well). Enthalten Fahrzeug (PBS) allein Kontrolle. </li><li> Bei 12 Stunden nach der Behandlung, führen Zika Virusinfektion (MOI von 0,1 in 400 &amp; mgr; l pro Vertiefung). Fügen Negativkontrollen ohne Infektion (mock). </li><li> Bei 4 Stunden nach der Infektion, ersetzen Sie die viralen Inokulum mit Medien Zytokin behandelt (2 ml). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für weitere 44 Std. </li><li> Bei 48 Stunden nach der Infektion zählen virale Plaques ein Phasenkontrastmikroskop und erwerben repräsentative Bilder von infizierten Zellen bei 40 - facher Vergrößerung (Abbildung 5). </li></ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).</li>
<li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus%2C+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li>
<li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza%2C+Kedougou%2C+and+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li>
<li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li>
<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li>
<li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere%2C+2015+%5BLetter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier wird eine rationalisierte Protokoll zur Kultivierung Zika Virus in vitro dargestellt. Kritische Schritte, einschließlich Identifizierung optimale Endpunkte für Viruskultur erweitert, Titer zu messen und zu quantifizieren Genomreplikation bereitgestellt wurden. Zika-Virus ist ein menschlicher Krankheitserreger, so, beim Umgang mit infektiösen Erregern, die Biosicherheit Verfahren sind strikt befolgt werden. Ein Affennierenzelllinie, Vero, wurde für den Nachweis verschiedener virologische Tests verwendet. Zi...

Zika - Virus (ZIKV) ist eine wichtige menschliche Krankheitserreger im Zusammenhang mit Mikrozephalie und schlechte Schwangerschaft 1,4 Ergebnisse. ZIKV gehört zur Gruppe von medizinisch relevanten Flaviviren, die neurologische Defekte wie das Dengue-Fieber, West-Nil, und St. Louis-Enzephalitis-Viren verursachen können. Der Hauptmodus der viralen Übertragung durch den Moskito - Vektor Aedes aegypti, und zusätzlich hat die sexuelle Übertragung auch 5,6 berichtet. ZIKV hat ein großes globales Gesundheitsproblem geworden aufgrund der wachsenden geographischen Verteilung des Moskito-Vektor und seine starke Korrelation mit Geburtsfehler. ZIKV wurde isoliert zuerst 7,8 im Jahr 1947 von einem Sentinel - Rhesusaffen im Zika Wald, Uganda und der erste Mensch Fall wurde im Jahr 1952 berichtet. Personen, die mit ZIKV mit milden Symptomen vorhanden infiziert werden, wie Fieber, Hautausschlag, Kopfschmerzen, Konjunktivitis und Muskel / Gelenkschmerzen. Infizierte schwangere Frauen können ZIKV auf den sich entwickelnden Fötus 1 übertragen. ZIKV - Infektion hat sich auch Guillain-Barre - Syndrom in Verbindung gebracht worden, einer peripheren Nerven Auto-Immun - Erkrankung Demyelinisierung 9. Die Zika virale Genom besteht aus einer positiven Sinn, einsträngige RNA-Molekül, das etwa 10,8 Kilobasen lang ist. Die Struktur des Genoms ist als 5&#39;NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3&#39;NCR organisiert, wobei nicht-kodierenden Regionen (NCR) flankieren eine Protein-codierende Region 6. Ein einzelnes Polyprotein (3419 aa) übersetzt wird, dass ist Co- und post-translational in 10 kleinere Peptide gespalten. Sowohl die 5&#39;NCR und 3&#39;NCR RNA-Stem-Loop-Strukturen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme des viralen Genoms Übersetzung und Replikation. Die strukturellen Komponenten des Genoms der Capsid, Membran besteht und Hüllproteine. Die nicht-strukturellen Proteine ​​sind entscheidend für die Genom-Replikation. Derzeit sind Zika Virusstämme gruppiert in drei Haupt Genotypen: West African, Ost - Afrika, Asien und 6,10-13. Es hat sich gezeigt , dass die East African Abstammung verbreiten nach Westafrika und Asien vorgeschlagen, wo es später weitere 12 entwickelt. Der asiatische Genotyp ist verantwortlich für die aktuellen Ausbrüche in Nord- und Südamerika. Zika Virus kann sowohl kultiviert werden in Mücke und Säugerzellen. Primäre Hautfibroblasten, unreife dendritische Zellen, kortikalen neuronalen Vorläuferzellen und Vero - Zellen sind empfänglich für eine virale Infektion Zika 10,14,15. Sowohl Typ I und Typ II - Interferonen wurden ZIKV Wachstum in Fibroblasten der Haut 15 gezeigt zu beschränken. Die Ziele dieser Studie sind eine stufenweise, detailliertes Protokoll für die Herstellung und das Testen des asiatischen Genotyp ZIKA Virusstamm PRVABC59 in einer Säugerzellkultursystem zur Verfügung zu stellen und den Nutzen dieser infektiösen Kultursystems als Medikamenten-Entwicklungsplattform zu demonstrieren. Diese Ressource hat das Potenzial, zu stark die Zika virale und neurologische Forschung profitieren weiter i erläuternts Mechanismen der viralen Pathogenese und Entwicklung von viralen Virulenz.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin, 10x [-] Phenolrot&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Gräfin &ndash; Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-Zellzählung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper für Mäuse J2&nbsp;</td><td>Deutsch & Wissenschaftliche Beratung Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td> SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freie DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Zelllinie&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika-Virusstamm PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alpha&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alpha A&nbsp; &nbsp;</td><td>Forschung & Technik D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Immunfluoreszenzmikroskop mit Nikon Intenselight C-HGFI</td><td></td><td>Nikon Besuch Nikon für Anfrage</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus infectious zellkultursystem und die<em&gt; in vitro</em&gt; prophylaktische wirkung von interferonen

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika-Virus (ZIKV) ist eine aufstrebende Erreger, die fetale Entwicklungsstörungen wie Mikrozephalie verbunden ist, Augenfehler und Wachstumsstörungen. ZIKV ist ein RNA - Virus der Familie Flaviviridae. ZIKV wird hauptsächlich durch Stechmücken übertragen, kann aber auch als auch sexuellen Kontakt durch mütterliche fetalen vertikale Übertragung verteilt werden. Bis heute gibt es keine zuverlässige Behandlung oder Impfung Optionen zur Verfügung, die mit dem Virus infiziert zu schützen. Die Entwicklung einer reproduzierbaren, effektive Zika Virus infektiös Zellkultursystem ist von entscheidender Bedeutung für die molekularen Mechanismen der ZIKV Replikation sowie Drogen-und Impfstoff-Entwicklung zu studieren. In dieser Hinsicht ist ein Protokoll einer Säugerzelle basierenden in vitro Zika Viruskultursystem für die virale Produktion und Wachstumsanalyse beschreibt , wird hier berichtet. Einzelheiten zur Bildung von Plaques durch Zika Virus auf einer Zellmonoschicht und Plaque-Assay für Virustiter Messung dargestellt. Viralen Genomreplikation kineticsund doppelsträngigen RNA-Genom replicatory Zwischenprodukte werden bestimmt. Diese Kultur Plattform zum Screenen gegen eine Bibliothek von einer kleinen Gruppe von Cytokinen, was zu der Identifizierung von Interferon-α (IFN-α), IFN-β und IFN-γ als potente Inhibitoren von Zika virales Wachstum genutzt wurde. Zusammengefasst ein in vitro - Infektions Zika Viruskultursystem und verschiedene virologische Tests sind in dieser Studie gezeigt, die das Potenzial hat, die Forschungsgemeinschaft bei der Aufklärung die Mechanismen der viralen Pathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz stark profitieren. Antivirale IFN-alpha kann weiter als Prophylaktikum, Post-Expositions-Prophylaxe zu bewerten und Behandlungsoption für Zika Virusinfektionen in Hochrisikogruppen, einschließlich der infizierten schwangeren Frauen.

Ein Zika - Virusstamm (PRVABC59; GenBank - Zugangsnummer KU501215) des asiatischen Genotyp wurde in dieser Studie 12 genutzt. Vero - Zellen bei 80% Konfluenz wurden zur Untersuchung der de novo Zika Virusinfektion verwendet. Für die virale Produktion und anschließende virologischen Charakterisierung, eine frühe Passage (P3) Zika Virus wurde verwendet. Die viralen Plaques wurden am zweiten Tag der Infektion beobachtet. Zika viralen Nachkommen von der anfänglich infizie...

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist die Einrichtung eines auf Säugetierzellen basierenden in-vitro-Infektionssystems für das Zika-Virus, um die Replikation des Zika-Virus sowie die Nutzung der in-vitro-Plattform für die Arzneimittelentwicklung zu untersuchen. Dieses detaillierte, schrittweise beschriebene Protokoll eines infektiösen Zellkultursystems für das Zika-Virus kann dazu beitragen, den Mechanismus der vom Zika-Virus vermittelten Krankheitspathogenese sowie die Entwicklung der viralen Virulenz aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die großtechnische Produktion des Zika-Virus für die Entwicklung von Arzneimitteln und Impfstoffen ermöglicht.Beginnen Sie mit der Gewinnung von Vero-Zellen bei einer Zelldichte von 80 % in einem T75-Kulturkolben, indem Sie das Medium aus dem Kolben abpipettieren und die Zellen mit zwei Millilitern gepuffertem Phosphat-Salzlösung (PBS) spülen. Geben Sie zwei Milliliter 0,25 %iger Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie den Kolben fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie acht Milliliter Wachstumsmedium mit Serum hinzu, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Überführen Sie anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Entnehmen Sie danach 10 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie diese mit einer gleichen Menge 0,4 %iger Trypanblaulösung. Geben Sie die vorbereitete Mischung auf eine Zellzählkammer und ermitteln Sie die Anzahl der vitalen Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählgeräts. Säen Sie insgesamt sieben Millionen Zellen in einem Volumen von 30 Milliliter in einen T160-Kolben aus. Bereiten Sie am nächsten Tag eine geeignete Infektionsmultiplizität des Zika-Virus-Inokulums in 10 Milliliter serumfreiem Kulturmedium pro Kolben vor. Ein sicherer Umgang mit dem Virus ist entscheidend, um die Ausbreitung der Infektion zu verhindern.Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus dem T160-Fläschchen und geben Sie anschließend die vollen 10 Milliliter frisch zubereiteten viralen Inokulums hinzu. Inkubieren Sie die infizierten Fläschchen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 über einen Zeitraum von vier bis sechs Stunden. Verteilen Sie das Inokulum, indem Sie das Fläschchen während der Inkubation stündlich vorsichtig seitlich kippen. Ersetzen Sie nach Beendigung der Inkubation das Inokulum durch 30 Milliliter warmes, serumhaltiges Wachstumsmedium. Fahren Sie anschließend mit der viralen Kultur für die nächsten 96 Stunden fort. Überprüfen Sie nach vier Tagen den Fortschritt der Infektion, indem Sie das Auftreten von viralen Plaques auf der Zellmonoschicht mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachten. Nehmen Sie bei Bedarf Bilder mit 40facher und 200facher Vergrößerung auf. Gewinnen Sie die Überstände der Zellkultur nach 96 Stunden und zentrifugieren Sie den Überstand bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 300 × g, um Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die Überstände, ohne den pelletierten Zelltrümmer zu stören, und überführen Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen.Bewahren Sie die Überstände der Viruskultur in mehreren Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius auf. Um das Virus zu titrieren, säen Sie zunächst naive Vero-Zellen in eine 12-Loch-Platte mit je einem Mal 10 hoch 5 Zellen pro Loch in einem Volumen von zwei Milliliter aus. Bereiten Sie am folgenden Tag Verdünnungsreihen der viralen Kulturüberstände im Verhältnis 1:10 vor, die aus dem T160-Fläschchen mit serumfreiem Medium gesammelt wurden.Beim Anfertigen serieller Verdünnungen von viralem Kulturüberstand für Titrierungen achten Sie darauf, den Virus sicher zu handhaben, um eine Infektion zu verhindern. Entfernen Sie anschließend das verbrauchte Medium aus jedem Well der 12-Loch-Platte mit Vero-Zellen und geben Sie 400 Mikroliter des verdünnten Inokulums in Dreifachansätzen auf die Vero-Zellen. Inkubieren Sie die beimpften Platten vier bis sechs Stunden lang im Gewebe-Kultur-Inkubator.Am Ende der Inkubation das Inokulum durch zwei Milliliter serumhaltiges Medium pro Vertiefung ersetzen. 48 Stunden nach der Inokulation die viralen Foci in den geeigneten Verdünnungen mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops zählen. Die virale Titerkonzentration als Plaque-bildende Einheiten pro Milliliter berechnen.Nach der Infektion von Vero-Zellen in einer 12-Loch-Platte mit hohen und niedrigen Titermengen des Zika-Virus und einer Inkubation über 48 und 96 Stunden wird die Genomreplikation mittels quantitativer PCR zur Detektion des Zika-Virusgenoms sowie mittels immunzytochemischer Färbung für doppelsträngige RNA bewertet. Für die Immunzytochemie entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Loch-Platte und geben Sie je einen Milliliter Methanol in jede Vertiefung. Lassen Sie die Zellen bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang fixieren. Waschen Sie die fixierten Zellen anschließend dreimal mit 1x PBS. Geben Sie dann Blockierpuffer hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie den mausmonoklonalen Antikörper gegen doppelsträngige RNA, J2, im Verhältnis 1:100 in Blockierpuffer, geben Sie ihn zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in dieser Lösung. Am nächsten Tag verdünnen Sie den sekundären Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG-594, im Verhältnis 1:1.000 in Blockierpuffer, waschen die Zellen mit 1x PBS und geben den Antikörper zu den Zellen. Inkubieren Sie anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach einem weiteren Waschschritt mit 1x PBS färben Sie die Kerne mit dem Farbstoff Hoechst und betrachten die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100facher Vergrößerung.Sechs Stunden nach der Aussaat einer 12-Loch-Platte mit naiven Vero-Zellen, wie zuvor beschrieben, Zytokine der gewünschten Interesse in angegebenen Konzentrationen in biologischen Duplikaten hinzufügen. Zwölf Stunden nach der Behandlung eine Zika-Virus-Infektion durchführen und Negativkontrollen ohne Infektion einbeziehen. Vier Stunden nach der Infektion das virale Inokulum durch zytokinbehandeltes Medium ersetzen und die Zellen anschließend 47 Grad Celsius für weitere 44 Stunden inkubieren. 48 Stunden nach der Infektion virale Plaques mit einem Phasenkontrastmikroskop zählen und repräsentative Bilder infizierter Zellen bei 40facher Vergrößerung aufnehmen.Dieses Diagramm zeigt den genomischen Gehalt des Zika-Virus, gemessen mittels RT-qPCR. Sowohl Primer für den Pan-Genotyp als auch für den Stamm PRVABC-59 zeigten gleiche Empfindlichkeit und Spezifität. Wie erwartet amplifizierten Primer für das Hepatitis-C-Virus kein Produkt.Die Wachstumsdynamik des Zika-Virus zu den angegebenen Zeitpunkten in Zellen mit niedriger und hoher Viruslast im Vergleich zur nicht infizierten Mock-Kontrolle ist hier dargestellt. Die Ergebnisse des Immunzytochemie-Assays zeigen, dass die infizierten Zellen 48 Stunden nach der Infektion in wenigen Clustern vorliegen, während 96 Stunden nach der Infektion die Mehrheit der Zellen infiziert ist. Dieses Diagramm zeigt die Modulation des Zika-Viruswachstums durch verschiedene Zytokine im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle.Diese Phasenkontrastbilder zeigen Zellen, die mit dem Zika-Virus infiziert sind, mit oder ohne Zytokinsbehandlung. Virale Plaques, die von infizierten Zellen gebildet werden, sind als Foci erkennbar. Beachten Sie, dass in mit Interferon behandelten Vertiefungen keine viralen Plaques auftreten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die hochauflösende Domänenkartierung des Zika-Virus zur Lokalisierung viraler Proteine und Replikation in Mücken- und menschlichen Zellen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Aufklärung des Mechanismus der Krankheitspathogenese und die Entwicklung der viralen Virulenz. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein auf Säugetierzellen basierendes in-vitro-Infektionssystem für das Zika-Virus etabliert, um die Replikation des Zika-Virus zu untersuchen, sowie wie die Nutzung der in-vitro-Plattform für die Entwicklung von Wirkstoffen und Impfstoffen erfolgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der antikörperabhängigen Verstärkung (ADE) von Dengue-Virusinfektionen mit Hilfe des Zika-Virus-Rekonvaleszenzserums. Der Assay verwendet Dengue-Reporter-Viruspartikel (RVPs), die für ein grün fluoreszierendes Protein kodieren. Serumantikörper gegen das Zika-Virus kreuzreagieren mit RVPs und bilden einen Komplex. Die gebundenen Antikörper erhöhen die RVP-Aufnahme durch Zellen, die den Fc-Rezeptor exprimieren, was mittels Durchflusszytometrie...

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Antikörper-abhängigen Verstärkung einer Virusinfektion

Das Video zeigt einen in vitro Assay zum Screening von Interferonen mit antiviraler Aktivität gegen das Zika-Virus, einen menschlichen Krankheitserreger. Innerhalb der Wirtszelle vermehrt sich das Zika-Virus bei der Internalisierung, infiziert benachbarte Zellen und bildet unterschiedliche Zonen oder virale Plaques. Typ-I-Interferon, das als antivirales Mittel wirkt, hemmt die Virusvermehrung und verhindert so die Bildung von viralen Plaques in der Monoschicht der Wirtszelle.

Ein In-vitro-Assay zum Screening von Interferonen als potente Inhibitoren des Zika-Viruswachstums

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Infektion menschlicher fetaler neuraler Stammzellen mit dem Zika-Virus. Die infizierten Zellen können für weitere Studien verwendet werden.

Zika-Virus-Infektion von fötalen neuralen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

Dieser Artikel beschreibt die Methoden, die verwendet werden, um die menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur, sowie zur Unterscheidung in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten, mit einem Schwerpunkt auf den Einsatz von neuronalen Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren zu erweitern.

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Hier demonstrieren wir die Verwendung der zellbasierten elektrischen Impedanz (CEI) als eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, um die Infektion und Replikation des Zika-Virus in menschlichen Zellen in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus ist der CEI-Assay nützlich für die Bewertung antiviraler Verbindungen.

Zellbasierte elektrische Impedanzplattform zur Evaluierung von Zika-Virus-Inhibitoren in Echtzeit

Lernen Sie die Herstellung eines Zika-Virus-Zellkultursystems mit Vero-Zellen für virologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Replikationsmechanismen und unterstützt die Entwicklung von Medikamenten und Impfstoffen.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die

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