Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mit Hilfe der Mikroskopie die Bildung von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Hyphen zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie bakterielle Biofilme auf Hyphen gebildet werden, wie spezifisch sie sind und woraus sie bestehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Bildung von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen auf mehreren Skalen ermöglicht, vom Nanometer- bis zum Zentimeterbereich.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Cora Miquel Guennoc aus meinem Labor und Christophe Rose, dem Elektronenmikroskopie-Ingenieur der INRA PTEF-Plattform, durchgeführt. Bereiten Sie zunächst Zellophanmembranen mit dem gleichen Durchmesser wie die Petrischalen vor und legen Sie sie dann 30 Minuten lang in kochendes EDTA. Spülen Sie die Blätter dann mit entionisiertem Wasser ab und autoklavieren Sie sie zweimal.

Zur Herstellung von Pilzvorkulturen wird der Pilz auf Agarmedium geimpft, das mit einer EDTA-vorbehandelten Zellophanmembran bedeckt ist. Inkubieren Sie die Kulturen bei optimaler Temperatur, um Kolonien mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter zu erhalten. Aus der Vorkultur inokulieren Sie eine Petrischale mit geeignetem Agarmedium, das mit der EDTA-Zellophanmembran bedeckt ist, indem Sie mit einem Skalpell vorsichtig den äußeren Bereich einer Vorkulturkolonie ankratzen und dann die Hyphen auf die Agarplatte übertragen.

Inkubieren Sie die Platten bei optimaler Temperatur, bis die Kolonien einen Durchmesser von etwa einem Zentimeter haben. Um Bakterienkulturen wie P.fluorescens BBc6 herzustellen, verwenden Sie eine sterile Schleife, um zwei bis drei einzelne Bakterienkolonien aus dem Agarmedium zu sammeln, und inokulieren Sie 25 Milliliter LB. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei optimaler Temperatur. Nachdem Sie die Bakterien über Nacht gezüchtet haben, zentrifugieren Sie die Kultur drei Minuten lang bei 5.000 g g.

Und dann suspendieren Sie das Pellet in 25 Millilitern sterilem 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer. Nach Wiederholung der Zentrifugation verwenden Sie denselben Puffer, um die endgültige Bakterienkonzentration auf 10 bis neunte Zellen pro Milliliter einzustellen. Füllen Sie eine Mikroplatte mit sechs Vertiefungen mit fünf Millilitern der Bakteriensuspension.

Schneide die Zellophanmembran der Pilzkultur mit einer sterilen Rasierklinge in Quadrate, auf denen sich jeweils eine Kolonie befindet. Anschließend werden mit einer Pinzette vorsichtig Zellophanquadrate mit Hyphen aus dem festen Medium entnommen und in einzelne Vertiefungen der Bakteriensuspension überführt. Schütteln Sie die Mikroplatte vorsichtig, bis sich die Pilzkolonien vom Zellophan gelöst haben.

Entfernen Sie dann die Zellophanblätter und lassen Sie die Pilzkolonien in der Platte. Inkubieren Sie die Mikroplatte unter leichtem Rühren bei 20 Grad Celsius für eine Zeit, abhängig von den verwendeten Stämmen und dem zu analysierenden Tisch. Für P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor inkubieren Sie die Kulturen 30 Minuten lang, um Biofilme im Frühstadium zu erhalten, und bis zu 16 Stunden für reife Biofilme.

Um planktonische Bakterien und Bakterien, die elektrostatisch an den Hyphen haften, zu entfernen, spülen Sie den Pilz ab, indem Sie ihn auf eine neue Sechs-Well-Mikroplatte übertragen, die mit starker Salzlösung gefüllt ist. Schütteln Sie den Teller eine Minute lang vorsichtig. Übertragen Sie den Pilz auf eine neue Sechs-Well-Mikroplatte mit fünf Millilitern sterilem 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer

Schütteln Sie die Platte vorsichtig zwei Minuten lang und geben Sie dann den Pilz in frischen Puffer. Während Sie die Pilzkolonie in Puffer halten, schneiden Sie die Kolonie mit einem Skalpell etwa in zwei Hälften. Die Hälfte der zu färbenden Kolonie wird in eine Petrischale mit einem Milliliter sterilem Wasser gegeben, ergänzt mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff, um das Pilznetzwerk sichtbar zu machen, wie z. B. Weizenkeim-Agglutinin, das an Alexa Fluor 633 konjugiert ist.

Inkubieren Sie die Probe dann im Dunkeln. Spülen Sie die Probe nach dem Färben ab, indem Sie sie auf einen Petrischalendeckel mit 10 Millilitern sterilem 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer geben, und schütteln Sie sie eine Minute lang vorsichtig. Tauchen Sie einen Objektträger zur Hälfte in den Deckel der Petrischale ein und positionieren Sie den geschnittenen Abschnitt vorsichtig so, dass er über dem Objektträger schwebt.

Heben Sie dann den Objektträger langsam aus der Pufferlösung, so dass sich die Probe sanft auf dem Objektträger absetzen kann. Der heikelste Aspekt ist die Positionierung der Probe auf dem Objektträger. Um eine Beschreibung des Biofilms zu vermeiden, müssen die Probe und der Objektträger während der Positionierung der Probe eingetaucht werden und die Probe darf vor der Bildgebung nicht mehr bewegt werden.

Geben Sie abschließend 10 Mikroliter Antifading-Einbettmittel in die Probe und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem konfokalen Lasermikroskop mit einem 10x- oder 40x-Objektiv. Verwenden Sie eine Kombination aus Kachelscan und den Z-Stack-Funktionen, um globale 3D-Ansichten der Pilzkolonie und der Biofilme zu erhalten.

Um die Elektronenmikroskopie durchzuführen, wird der Pilz nach dem Spülen des Pilzes in starker Salzlösung wie zuvor in steriles Wasser statt in einen Puffer überführt, um die Bildung von Salzkristallen während des Dehydratisierungsschritts zu verhindern. Übertragen Sie die Biofilme auf einen Probenhalter und entfernen Sie überschüssiges Wasser. Übertragen Sie dann die Proben in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops mit variablem Druck.

Frieren Sie die Probe auf einem Peltier-Kühltisch auf minus 50 Grad Celsius ein, so dass sie direkt in der REM-Kammer langsam trocknen kann, wobei 100 Pascal variabler Druck für 15 Stunden eingestellt wird. Entnehmen Sie die Probe und überführen Sie sie in ein Hochvakuum-Filmabscheidungssystem. Anschließend beschichten Sie die Probe mit zwei Nanometern Platin unter Argonplasma.

Beobachten Sie die beschichtete Probe mit einem Rasterelektronenmikroskop, mit einer Feldemissionskanone unter Verwendung des hochauflösenden Linsendetektors und einer elektronischen Hochspannung von einem Kilovolt. Diese mesoskalige Analyse von Biofilmen zeigt die heterogene Verteilung des Biofilms von P.fluorescens BBc6 in grün auf den Hyphen von L.bicolor S238N, dargestellt in rot. Die Analyse ermöglichte es auch, die Biofilmbildung im Laufe der Zeit zu verfolgen, von den frühen Schritten, in denen nur einige GFP-markierte Bakterien an die rot dargestellten Hyphen gebunden wurden, bis hin zur Bildung eines dicken, reifen Biofilms.

Wie hier gezeigt, wurden die hochauflösenden mesoskaligen Bilder auch für mikroskalige Analysen verwendet, um Koloniearchitekturen zu erhalten. Darüber hinaus zeigt in dieser hochauflösenden 2D-Projektion mit maximaler Intensität eines konfokalen 3D-Bildes die spezifische Markierung mit SYPRO Ruby, die in Rot dargestellt ist, das Vorhandensein von Proteinen in der Matrix an, wobei GFP-markierte BBc6-Bakterien und FUN-1-markierte Pilze dunkelgrün sind. Nach Dehydratisierung und Kodierung der gleichen Probe wurden weitere Details der Biofilmstruktur durch REM-Bildgebung gewonnen.

Die grünen Pfeilspitzen zeigen auf Bakterienzellen im Biofilm, die gelben Pfeilspitzen auf Pilzhyphen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zweieinhalb Stunden für eine Probe durchgeführt werden, wobei die Inkubationszeit für die Biofilmbildung und die Kultivierung von Mikroorganismen nicht mitgerechnet wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg der Methode stark von der Fähigkeit abhängt, sehr dünne Pilzkolonien zu erhalten, die aus nur wenigen Hyphenschichten bestehen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. Mutagenese oder in situ Hybridisierung, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die funktionelle oder chemische Charakterisierung des Biofilms, oder um Multispezies-Biofilme zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher aus verschiedenen Bereichen wie Medizin, Umweltwissenschaften, Lebensmittelindustrie und so weiter, um die Biofilmbildung bei bakteriellen Pilzinteraktionen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bakterielle Biofilmbildung auf Pilzhyphen züchtet und analysiert.